2019-2020年高中生物 第4章 現(xiàn)代生物技術 第15課時 聚合酶鏈式反應技術同步備課教學案 北師大版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 第4章 現(xiàn)代生物技術 第15課時 聚合酶鏈式反應技術同步備課教學案 北師大版選修1 [學習導航]　1.閱讀教材P77～78內(nèi)容，掌握PCR技術原理。2.結(jié)合教材P79～80內(nèi)容，了解PCR技術的基本操作過程，討論PCR技術的影響因素。 [重難點擊]　1.簡述PCR的原理。2.了解PCR技術的基本操作過程并討論PCR技術的影響因素。 一、PCR的原理 聚合酶鏈式反應簡稱PCR，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，這項技術中DNA復制的過程和細胞內(nèi)DNA復制的過程是類似的，請結(jié)合已學習的DNA分子結(jié)構(gòu)和復制的相關知識，分析PCR的原理。 1.DNA的平面結(jié)構(gòu)示意圖 (1)寫出各個標號的名稱①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鳥嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脫氧核糖；⑥磷酸基團；⑦胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸；⑧氫鍵；⑨堿基對；⑩一條脫氧核糖核苷酸鏈。 (2)DNA的兩條鏈是反向平行的，為了明確表示DNA鏈的方向，通常將羥基末端稱為3′端；將磷酸基團的末端稱為5′端，按此原則在圖上方框內(nèi)標出兩條鏈的方向。 答案　左鏈上5′端，下3′端；右鏈上3′端，下5′端。 2.細胞內(nèi)DNA復制條件分析 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復制的模板 原料 四種脫氧核糖核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 打開DNA雙螺旋 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3′端起點 3.PCR原理與反應過程 (1) PCR概念：是一種體外酶促合成特定DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。 (2)條件及作用 條件 作用 待擴增的目的DNA片段 作為復制的模板 兩種人工合成的單鏈DNA片段 合成DNA時所需要的特異引物 四種三磷酸脫氧核苷酸 原料 耐熱TaqDNA聚合酶 酶促作用 緩沖溶液 反應介質(zhì) (3)反應過程 ①變性 溫度上升到94～98 ℃時，目的DNA雙鏈變性解旋為單鏈模板。 ②復性 溫度下降到40～60 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。 ③延伸 溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核糖核苷酸在耐熱的TaqDNA聚合酶的作用下。根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。 ④循環(huán)：繼續(xù)上述的3個過程，DNA片段被不斷的擴增。若開始加入了N個DNA模板片段，理論上，循環(huán)n次后能獲得N2n個DNA片段。 1.PCR原理 PCR反應與體內(nèi)DNA復制的引物在化學本質(zhì)上是否相同？請分析原因。 答案　不相同。體內(nèi)DNA復制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反應時所用引物一般是人工合成的單鏈DNA片段。 2.PCR反應過程 (1)PCR反應中需要解旋酶和DNA聚合酶嗎？若需要，則與細胞內(nèi)DNA復制有何區(qū)別？ 答案　PCR反應不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反應中需要高溫使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高溫。 (2)PCR的每次循環(huán)中應如何控制溫度？請分析原因。 答案　每次循環(huán)中先高溫解旋，再低溫使引物與模板結(jié)合，最后適當升溫有利于Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用。 (3)結(jié)合下圖分析PCR過程中DNA復制的方向是怎樣的？ 答案　DNA的羥基(—OH)末端為3′端，磷酸基團的末端為5′端。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 歸納總結(jié)　PCR擴增與DNA復制的異同 項目 DNA復制 PCR擴增 不同點 時期 有絲分裂間期或減數(shù)分裂Ⅰ前的間期 任何時期 場所 活細胞內(nèi) 細胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的Taq DNA聚合酶 引物 有轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生RNA作引物，無需人工加入 無轉(zhuǎn)錄，無引物產(chǎn)生，需人工加入兩種DNA引物 特點 邊解旋邊復制 先全部解旋后開始復制 緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細胞核液 設備 無 控制溫度變化的溫控設備 相同點 原理 嚴格遵循堿基互補配對原則 引物 都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 模板 DNA的兩條鏈為模板 特點 半保留復制 原料 游離的四種脫氧核苷酸 1.下列關于DNA復制和PCR技術的描述中，正確的是(　　) A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈 B.DNA復制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合 D.PCR擴增的對象是氨基酸序列 答案　C 解析　DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，故DNA復制需要引物；DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，而不能從5′端延伸DNA鏈；引物通過堿基互補配對原則與DNA母鏈相結(jié)合；PCR擴增的對象是DNA，不是氨基酸序列。 2.PCR技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低難以對樣品進行研究的問題，而被廣泛應用，與細胞內(nèi)的DNA復制相比，PCR可以快速擴增所需的DNA片段，請分析回答下列有關問題： (1)體內(nèi)DNA復制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術中的解旋原理是_________。 (2)此過程需要一種Taq DNA聚合酶，該酶是從____________________中分離的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是______________。 (4)與體內(nèi)DNA復制相比較，PCR反應要在______________中才能進行，并且要嚴格控制________條件。 (5)PCR中加入的引物有________種，加入引物的作用是____________________________。 答案　(1)DNA的熱變性原理　(2)水生耐熱細菌Taq　(3)耐高溫　(4)一定的緩沖溶液　溫度　(5)2　作為DNA復制的起點 解析　(1)PCR技術中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋，其原理是DNA的熱變性原理。 (2)Taq DNA聚合酶是從水生耐熱細菌Taq中提取的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的環(huán)境中不變性，具有耐高溫的特性。 (4)PCR反應需要適宜的溫度和pH，因此PCR反應要在一定的緩沖溶液中進行，并需嚴格控制好溫度條件。 (5)PCR需要兩種引物，引物的識別位點決定了PCR擴增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段單鏈DNA，作用是引導DNA復制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復制的起點。 一題多變 細胞內(nèi)的DNA復制需要適宜的溫度和pH嗎？若需要，是如何實現(xiàn)的？ 答案　需要。細胞內(nèi)的適宜溫度和pH與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關，低等生物與環(huán)境因素有關。 易錯提醒　與PCR原理有關的三個易錯點 (1)酶的作用位點：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。 (2)DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR中的解旋過程：PCR過程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時的溫度不會破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂?，并未分解成單體。 二、DNA片段的PCR擴增和產(chǎn)物檢測 DNA片段的PCR擴增可以利用PCR熱循環(huán)儀完成，而產(chǎn)物的檢測則利用瓊脂糖凝膠電泳進行。閱讀教材，完善下列內(nèi)容： 1.DNA片段的PCR擴增 準備：按照PCR反應體系的配方將所需試劑擺放于實驗桌上 ↓ 移液：用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組成成分 ↓ 混合：蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 ↓ 離心：將微量離心管放在離心機上，離心約10 s，目的是使反應液集中在離心管底部 ↓ 反應：將離心管放入PCR儀中，設置程序進行反應 (1)加入離心管中的物質(zhì)應包括：模板DNA、TaqDNA聚合酶、4種三磷酸脫氧核苷酸、2種引物、緩沖液。 (2)離心管中要加入少量石蠟油，目的是防止反應溶液的揮發(fā)。 (3)熱循環(huán)儀的反應程序應設定為： (4)影響因素：在PCR實驗中，需要擴增的DNA片段的大小決定延伸的時間，片段越大，中溫延伸的時間越長；引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復性溫度的選擇，如果引物越短，A、T含量越多，復性溫度就越低，反之引物越長，G、C含量越多，復性溫度就越高，這是因為G、C之間是由3個氫鍵連接，A、T之間是由2個氫鍵連接。 (5)PCR過程中，循環(huán)次數(shù)是不是越多越好？ 答案　不是。TaqDNA聚合酶在PCR擴增過程中存在110－5的出錯幾率，而且隨著循環(huán)次數(shù)的增加，其活性也會逐漸降低。因此，PCR過程中，循環(huán)次數(shù)并非越多越好，一般控制在25～35個循環(huán)。 2.擴增產(chǎn)物的檢測 (1)原理：瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔，帶有大量負電荷的DNA分子在外加電場的作用下可以通過這些濾孔向正極泳動。DNA片段在凝膠中的泳動速率主要取決于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子會在凝膠的一定位置形成DNA條帶。 (2)過程 配制質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠，制作成電泳膠板 　　　　　↓ 在DNA樣品中加入0.2倍體積的載樣緩沖液混勻 　　　　　↓ 取20 μL加入樣品孔內(nèi) 　　　　　↓ 80 V穩(wěn)壓電泳20～40 min 　　　　　↓ 當溴酚藍指示劑電泳到凝膠底部時，切斷電源 　　　　　↓ 將膠板浸入溴化乙錠溶液染色5～10 min 　　　　　↓ 在紫外透射儀上觀察電泳條帶 1.實驗過程分析 (1)離心的目的是什么？在離心的過程中，微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴？ 答案　離心的目的是使反應液集中在離心管底部，提高反應效率。微量離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。 (2)在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁，目的是什么？ 答案　離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應液混合均勻。 (3)PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌，為什么這樣操作？還有哪些操作與此目的相同？ 答案　為避免外源DNA等的污染。在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。 2.結(jié)果檢測 (1)實驗中為什么要測定DNA的含量？ 答案　實際操作過程中會有許多因素影響DNA含量，所以需要對DNA含量進行測定。 (2)如何判斷DNA擴增成功？ 答案?、倏梢酝ㄟ^計算DNA含量來評價擴增的效果。②電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。 (3)PCR擴增過程可能會出現(xiàn)哪些異常結(jié)果？ 答案　樣品產(chǎn)物少，或產(chǎn)生新的DNA。 歸納總結(jié)　PCR擴增DNA片段的操作要點 (1)避免外源DNA的干擾，所用儀器、緩沖液、蒸餾水等都需要在使用前高壓滅菌。 (2)緩沖液、酶、DNA引物和DNA模板等如果長期保存，需要在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反復凍融，否則容易造成DNA的降解。 (3)在用微量移液管混合PCR反應體系的各種成分時，一定注意避免各種溶液之間的相互污染，需遵循每吸取一種溶液就要更換一個槍頭的原則。 (4)為防止DNA引物與模板DNA在室溫非特異性結(jié)合進行PCR反應，需在冰盒上混合PCR擴增體系的各種組分。 (5)為避免反應過程中高溫使EP管中的水蒸氣溢出管外而導致PCR過程中各種成分的濃度發(fā)生變化，須在PCR反應過程中加入無菌的石蠟油防止溶液的揮發(fā)。 3.使用PCR儀具體實驗操作順序應為(　　) ①設計好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔蕚浜酶鹘M分③用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分　④進行PCR反應?、蓦x心使反應液集中在離心管底部 A.②③⑤④① B.①⑤③②④ C.②③⑤①④ D.④②⑤③① 答案　C 解析　PCR反應的操作步驟一般分為準備(包括配制配方及將各配方放于實驗臺上)→移液→混合→離心→反應。PCR儀是一種自動控制溫度的儀器，設計好循環(huán)程序就可以進行反應了。 4.近20年來，PCR技術(聚合酶鏈式反應)成為分子生物學實驗室的一種常規(guī)實驗手段，其原理是利用DNA半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖)，在短時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈間的______鍵完全打開，稱為______；而在細胞中是在_______酶的作用下進行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個特定區(qū)段，應該加入________種特定的引物。當溫度降低至40 ℃時，引物與兩條“舒展”的模板鏈的特定位置結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的______端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是______________。 (3)PCR技術的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的________和__________，前者由________自動調(diào)控，后者則靠__________來維持。 (4)通過PCR技術使DNA分子大量復制，如果將一個用15N標記的DNA分子放入試管中，以14N標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復制四次之后，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是________。 問題導析　(1)解旋是使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，PCR技術是利用DNA的熱變性原理，細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不論復制幾次，含有15N標記的DNA分子都只有2個。 答案　(1)氫　解旋　解旋　(2)兩　3′　從子鏈的5′端向3′端延伸　(3)溫度　酸堿度　PCR儀　緩沖液　(4)1/8 解析　(1)PCR技術利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋，而在細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應步驟：變性(94～98 ℃)、復性(40～60 ℃)、延伸(72 ℃)，其特異性依賴于與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增DNA序列互補的片段，兩引物之間的距離決定擴增片段的長度。由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，則DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(3)PCR技術與細胞內(nèi)的DNA復制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液)，每一個步驟需要適宜的溫度和酸堿度等。(4)一個DNA分子連續(xù)復制四次之后，形成16個DNA分子，15N標記的DNA分子有2個，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。  1.用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸，是一小段(　　) A.DNA B.RNA C.單鏈DNA或RNA D.雙鏈DNA 答案　C 2.符合PCR反應條件的一項是(　　) ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境　②DNA模板?、酆铣梢铩、芩姆N脫氧核苷酸?、軩NA聚合酶?、轉(zhuǎn)NA解旋酶　⑦限制性內(nèi)切酶?、鄿乜卦O備 A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧ C.③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧ 答案　D 解析　PCR反應模擬的是生物細胞內(nèi)DNA復制的條件，只是無需解旋酶(可熱變性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性內(nèi)切酶)。 3.下列關于PCR的描述中，正確的是(　　) ①PCR是一種酶促反應?、谝餂Q定了擴增的特異性　③擴增DNA利用了熱變性的原理?、軘U增的對象是氨基酸序列 A.①②④ B.②③④ C.①③④ D.①②③ 答案　D 解析　PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，在高溫條件下，把DNA的雙鏈打開，緩慢冷卻后，又重新結(jié)合，需要耐高溫的DNA聚合酶，同時，還需要引物，從引物的3′端連接脫氧核苷酸。 4.下圖所示為PCR擴增的產(chǎn)物，請分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A.第一次循環(huán) B.第二次循環(huán) C.第三次循環(huán) D.第四次循環(huán) 答案　A 解析　在PCR反應中，以引物為標記，第一次循環(huán)時，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應，所以會形成DNA分子兩端均含引物的情況，如下圖所示，因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。 5.聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。請回答下列問題： (1)DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將____________的末端稱為5′端，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的________開始延伸DNA鏈。 (2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，但又導致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代，科學家從一種Taq細菌中分離到________________________，它的發(fā)現(xiàn)和應用解決了上述問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來，所用的培養(yǎng)基叫____________。 (3)PCR的每次循環(huán)可以分為__________________三步。假設在PCR反應中，只有一個DNA片段作為模板，請計算在5次循環(huán)后，反應物中大約有________個這樣的DNA片段。 (4)簡述PCR技術的主要應用：_______________________________(要求至少答兩項)。 答案　(1)磷酸基團　3′端　(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶　選擇培養(yǎng)基　(3)變性、復性和延伸　32　(4)遺傳疾病的臨床診斷、法醫(yī)鑒定、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等 解析　一條脫氧核苷酸鏈一端是游離的羥基，另一端是游離的磷酸基團，含羥基的一端是3′端，含磷酸基團的是5′端。引物的5′端與模板鏈的3′端結(jié)合，然后沿著引物的3′端延伸。耐高溫的Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是實現(xiàn)PCR的關鍵，該酶可以利用選擇培養(yǎng)基從一些微生物中分離出來。PCR一次循環(huán)要經(jīng)歷變性、復性和延伸三個階段。 課時作業(yè) [基礎過關] 1.PCR過程與細胞內(nèi)的DNA復制過程相比，主要有兩點不同，它們是(　　) ①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA②PCR過程不需要DNA聚合酶?、跴CR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的　④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進行復制 A.③④ B.①② C.①③ D.②④ 答案　C 解析　PCR過程與細胞內(nèi)的DNA復制過程相比較，主要有兩點不同：(1)PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個核苷酸。(2)PCR過程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的。 2.DNA擴增過程中，DNA片段經(jīng)若干次擴增，與其數(shù)目的理論值變化相符的圖是(　　) 答案　C 解析　PCR反應中，DNA的擴增數(shù)目和生物體內(nèi)的DNA復制是類似的，即1個DNA分子復制一次，變?yōu)?個，復制2次，產(chǎn)生4個DNA分子，呈指數(shù)擴增，開始有一個DNA分子的模板，經(jīng)過n次復制后得到的DNA分子的數(shù)量為2n，與曲線C相符合。 3.下列各項屬于引物作用的是(　　) A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始復制 D.提供模板 答案　C 解析　DNA分子的復制具有方向性，即只能從子鏈的5′端→3′端方向進行復制。當引物與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。 4.如圖為DNA變性和復性示意圖，下列相關說法正確的是(　　) A.向右的過程為加熱(94～98 ℃)變性的過程 B.向左的過程是DNA雙鏈迅速致冷復性 C.變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實質(zhì)都相同 D.圖中DNA片段共有4個游離的磷酸基團、4個3′端 答案　A 5.PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(　　) A.仍與引物Ⅰ結(jié)合進行DNA子鏈的延伸 B.與引物Ⅱ結(jié)合進行DNA子鏈的延伸 C.同時與引物Ⅰ和引物Ⅱ結(jié)合進行子鏈的延伸 D.無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈 答案　B 解析　當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5′端，因此與它互補的子鏈應從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結(jié)合延伸DNA子鏈。 6.PCR儀實質(zhì)上是一臺自動調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，磷酸二酯鍵斷開?、?4 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋?、?0 ℃時，使DNA分子開始復制、延伸?、?0 ℃時，引物與DNA單鏈結(jié)合?、?2 ℃時，使DNA分子開始復制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復活性 A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥ 答案　C 解析　PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。當溫度上升至94 ℃時，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到40 ℃時，引物與DNA單鏈結(jié)合，恢復活性；溫度上升至72 ℃時，DNA分子開始復制、延伸，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。 7.下列有關PCR過程的敘述中，不正確的是(　　) A.在PCR的變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，DNA在人體細胞內(nèi)復制時可利用解旋酶實現(xiàn) B.復性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依據(jù)堿基互補配對原則完成的 C.延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D.PCR與細胞內(nèi)DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高 答案　C 解析　變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開，DNA在人體細胞內(nèi)復制時借助解旋酶來實現(xiàn)；根據(jù)堿基互補配對原則，引物可與 DNA模板鏈結(jié)合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四種脫氧核苷酸為原料；PCR過程所需溫度較高，會導致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫的DNA聚合酶。 8.下列關于瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的說法中不正確的是(　　) A.在DNA樣品中加入0.2倍體積的載樣緩沖液混勻 B.當指示劑電泳到凝膠底部時，切斷電源 C.電泳后將膠板浸入溴酚藍溶液中染色5～10 min D.在紫外透射儀上觀察電泳條帶 答案　C 解析　溴酚藍是電泳指示劑，電泳后染色是用溴化乙錠溶液。 [能力提升] 9.下列關于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　) A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D.在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換 答案　C 解析　在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化，故C錯誤。 10.關于PCR技術的應用，錯誤的一項是(　　) A.化石樣品分析、刑偵破案、DNA序列測定 B.診斷遺傳病、基因克隆、化石樣品分析 C.DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案 D.診斷遺傳病、合成核苷酸、DNA序列測定 答案　D 解析　PCR技術在醫(yī)學上用于遺傳病的基因診斷、基因克隆、DNA序列測定，法醫(yī)上用于刑偵破案，古生物學上用于生物化石樣品分析。PCR技術是以4種脫氧核苷酸為原料，合成雙鏈DNA的過程，PCR技術不能用于合成核苷酸。 11.有關PCR技術的說法，下列敘述不正確的是(　　) A.多聚酶鏈式反應，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術 B.在用PCR技術擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似 C.PCR反應只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D.PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復性和延伸 答案　C 解析　PCR是多聚酶鏈式反應的英文縮寫，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。在用PCR技術擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復性和延伸三步。 12.在PCR擴增DNA的實驗中，預計一個DNA分子經(jīng)過30次循環(huán)后，應該得到230個DNA分子，但是結(jié)果只有約210個DNA分子，那么出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因不可能是(　　) A.Taq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制 B.系統(tǒng)設計欠妥 C.循環(huán)次數(shù)不夠 D.引物不能與親鏈結(jié)合 答案　D 解析　如果Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預期的少，則A項正確。如果PCR系統(tǒng)設計欠妥，達不到預期的結(jié)果，則B項正確；如果循環(huán)次數(shù)過少，產(chǎn)物的量比預期的少，則C項正確；如果引物設計不合理，也許不能與模板DNA結(jié)合，造成無法進行擴增，而結(jié)果得到了210個DNA分子，則D項錯誤。 13.PCR(多聚酶鏈式反應)技術是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，下圖表示合成過程，請據(jù)圖分析回答下列問題： (1)A過程高溫使DNA變性解旋，對該過程原理的敘述，正確的是(　　) A.該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B.該過程用到限制性內(nèi)切酶破壞磷酸二酯鍵 C.該過程不需要解旋酶的作用 D.該過程與人體細胞的過程完全相同 (2)C過程要用到的酶是______________。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增時可以__________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應除提供酶外，還需要滿足的基本條件有__________________________________________________________。 (3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，控制“94 ℃～40 ℃～72 ℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占________。 (4)如果模板DNA分子共有a個堿基對，其中含有胞嘧啶m個，則該DNA復制10次，需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸________個。 (5)PCR中由堿基錯配引起的變異屬于________。假設對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占________。 答案　(1)C　(2)Taq DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、適當?shù)臏囟燃熬彌_溶液　(3)1/4　(4)(210－1)(a－m)　(5)基因突變　3/4 解析　(1)高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?2)C過程為PCR技術的延伸階段，當系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右時，緩沖溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈，Taq DNA聚合酶是耐熱的，高溫下不變性，所以一次性加入即可。PCR反應需要模板、四種脫氧核苷酸作原料、酶、能量等，需要在一定的緩沖溶液中進行。(3)PCR技術遵循半保留復制的特點。經(jīng)過三次循環(huán)，共產(chǎn)生23個DNA分子，其中有2個DNA分子含有15N標記。(4)在一個雙鏈DNA分子中，C＋T占堿基總數(shù)的一半，故T的數(shù)目為a－m，復制10次，相當于新增加了(210－1)個DNA分子。故需補充T的數(shù)目為(210－1)(a－m)。(5)基因中的堿基對改變屬于基因突變。對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，第二次以后按正常配對方式進行擴增，錯配鏈作模板擴增的都是錯誤的DNA分子，原正常鏈作模板擴增的都是正常的DNA分子，故若干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占3/4。 14.PCR是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。下圖為模板DNA分子及2種引物，請據(jù)圖回答相關問題： (1)PCR的全稱是__________________。PCR與體內(nèi)DNA復制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術中先用94 ℃高溫處理的目的是____________________，而這一過程在細胞內(nèi)是通過______________實現(xiàn)的。 (2)在PCR技術中所需要的引物通常為一段單鏈DNA。請在圖中繪出引物結(jié)合的位置。 (3)若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入________個引物。 (4)DNA子鏈復制的方向是__________________，這是由于__________________________。 答案　(1)聚合酶鏈式反應　使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開)　解旋酶的催化 (2)如圖所示 (3)211－2 (4)從5′端到3′端　DNA聚合酶只能從引物的3′端開始連接單個脫氧核苷酸分子 解析　PCR技術又稱聚合酶鏈式反應。在PCR技術中，用94 ℃高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，使兩條鏈解開，即使DNA分子變性。引物通常是一種單鏈DNA，它能與解開的DNA母鏈的3′端結(jié)合，為DNA聚合酶提供吸附位點，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而決定了DNA子鏈復制的方向是從5′端到3′端。在DNA分子擴增時，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復制的起點，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，即2210－2＝211－2 (個)。 [真題體驗] 15.(xx江蘇，22)小鼠雜交瘤細胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應，為了克服這個缺陷，可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達。下列相關敘述正確的是(多選)(　　) A.設計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列 B.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列 C.PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶 D.一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細胞 答案　BD 解析　設計擴增目的基因的引物時，要考慮擴增的目的基因與載體兩端序列堿基互補配對，A錯誤；DNA復制沿著模板進行，不必知道基因的全部序列，B正確；PCR技術中的DNA聚合酶是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細胞中提取的DNA聚合酶，C錯誤；目的基因編碼產(chǎn)物不同，相應的受體細胞不同，D正確。 16.(xx江蘇，33節(jié)選)請回答基因工程方面的有關問題： (1)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA復制類似(如圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。 ①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為________。 ②在第________輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。 (2)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物都不合理(如圖)，請分別說明理由。 ①第1組：________________________________________________________________； ②第2組：________________________________________________________________。 (3)PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為______________________________________________________________。 答案　(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 解析　(1)①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)某同學設計的兩組引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。