2019-2020年高中生物 5.2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷》教學(xué)設(shè)計 新人教版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 5.2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷》教學(xué)設(shè)計 新人教版選修1 教材內(nèi)容解讀 要點(diǎn)1　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模 板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。 要點(diǎn)2　PCR原理 （1）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似．細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種成分和基本條件以及各自的作用如下表： 參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用 解旋酶 打開DNA雙鏈 DNA母鏈 提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核苷酸 合成子鏈的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸 （2）DNA的方向 通常將DNA的羥基(－OH)末端稱為3’端，面磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端。 （3）引物 引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。 引物的作用：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。 （4）DNA的合成方向 當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3’端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。 （5）DNA的變性與復(fù)性 在80-100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈，這個過程稱為復(fù)性。 （6）PCR對DNA雙鏈的解聚與結(jié)合控制 PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。 （7）TaqDNA聚合酶的應(yīng)用 PCR中的高溫會導(dǎo)致普通DNA聚合酶失活，而耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了這個問題，大大增加了PCR的效率，使PCR技術(shù)趨向自動化。 （8）PCR擴(kuò)增DNA的基本條件 PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供：DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 要點(diǎn)3　PCR的反應(yīng)過程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 要點(diǎn)4　實(shí)驗(yàn)操作 做PCR通常使用微量離心管，它是一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。具體操作時，用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分，再設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。 如果沒有PCR儀，可以設(shè)置3個恒溫水浴鍋，溫度分別為94℃、55℃和72℃，然后按照上表的要求，在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管即可。 PCR的突出優(yōu)點(diǎn)是快速、高效、靈活和易于操作。 要點(diǎn)5　DNA含量的測定 DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(見下圖)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定。具體步驟如下： （1）將樣品進(jìn)行50倍稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水。 （2）以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。 （3）加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。 （4）計算DNA含量。公式：DNA含量(g)=50（260nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù)。 要點(diǎn)6　實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) （1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及 蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸氣滅菌。 （2）在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心臂放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中 進(jìn)行反應(yīng)。