高二生物質(zhì)疑解惑課件：5-2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》（人教版選修I）

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歡迎進(jìn)入生物課堂 課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 課程標(biāo)準(zhǔn)嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 課標(biāo)解讀1 理解PCR技術(shù)的基本原理 2 知道PCR技術(shù)的基本操作過(guò)程 3 討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用 1 生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的條件 1 四種是合成子鏈的原料 2 提供了DNA復(fù)制的模板 3 打開(kāi)了DNA雙鏈 4 催化合成DNA子鏈 5 使DNA聚合酶能夠從開(kāi)始連接脫氧核苷酸 PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)過(guò)程 脫氧核苷酸 DNA母鏈 解旋酶 DNA聚合酶 引物 引物的3 端 2 PCR擴(kuò)增的原理及條件 1 概念PCR即 是一種迅速的技術(shù) 它能以極少量的為模板 在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的 2 原理 DNA的熱變性 在的溫度范圍內(nèi) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解體 雙鏈分開(kāi) 這個(gè)過(guò)程稱為 當(dāng)溫度緩慢后 兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新 子鏈的合成 a 需要 b 合成方向總是從子鏈的端向端延伸 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 擴(kuò)增DNA片段 DNA DNA拷貝 80 100 變性 降低 結(jié)合成雙鏈 引物 5 3 3 條件 模板 分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種 A T G C四種 耐熱DNA聚合酶 一般用 需要一定的和能嚴(yán)格控制的溫控設(shè)備 DNA 引物 脫氧核苷酸 耐高溫的TaqDNA聚合酶 緩沖溶液 溫度 3 PCR反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷次循環(huán) 每次循環(huán)可以分為 和三步 1 當(dāng)溫度上升到以上時(shí) 雙鏈DNA解聚為單鏈 2 溫度下降到左右 通過(guò)與兩條單鏈DNA結(jié)合 3 溫度上升到左右 溶液中的四種脫氧核苷酸在的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈 三十多 變性 復(fù)性 延伸 變性 90 復(fù)性 50 兩種引物 堿基互補(bǔ)配對(duì) 延伸 72 DNA聚合酶 思維激活1 DNA復(fù)制緣何必須有引物 提示DNA聚合酶不能從頭合成DNA 而只能以3 延伸DNA鏈 故DNA合成時(shí) 必須加入引物 其3 游離 以作為延長(zhǎng)DNA子鏈的 引子 1 細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴(kuò)增的比較 見(jiàn)下表 2 PCR過(guò)程 1 變性當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí) 雙鏈DNA解聚為單鏈 2 復(fù)性溫度下降到50 左右 兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合 3 延伸溫度上升到72 左右 溶液中的四種脫氧核苷酸 A T C G 在DNA聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈 特別提醒 1 72 左右時(shí) TaqDNA聚合酶有最大活性 可使DNA新鏈由5 端向3 端延伸 2 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列 使該段固定長(zhǎng)度的序列呈 指數(shù)式 擴(kuò)增 鞏固1 標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為變性 復(fù)性 延伸三大步 這三大步需要的溫度依次是 A 94 55 72 B 72 55 94 C 55 94 72 D 80 55 72 解析當(dāng)溫度上升到90 90 96 以上時(shí) 雙鏈DNA解聚為單鏈 稱之為變性 當(dāng)溫度下降到50 40 60 左右時(shí) 兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合 當(dāng)溫度上升到72 70 75 時(shí) 溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈 稱為延伸 答案A 1 實(shí)驗(yàn)用具 1 PCR儀 該儀器能自動(dòng)調(diào)控 實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增 如果沒(méi)有PCR儀 可用3個(gè)代替 操作時(shí)按程序在3個(gè)中PCR反應(yīng)的微量離心管 2 微量離心管 總?cè)莘e為 實(shí)際上是進(jìn)行的場(chǎng)所 3 微量移液器 用于 PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作及評(píng)價(jià) 溫度 恒溫水浴鍋 水浴鍋 來(lái)回轉(zhuǎn)移 0 5mL 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體 2 操作步驟準(zhǔn)備 混合 反應(yīng) 3 操作提示 1 為避免等因素的污染 實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行 2 所用的和應(yīng)分裝成小份 并在儲(chǔ)存 3 在中添加反應(yīng)成分時(shí) 每吸取一種試劑后 移液器上的槍頭必須 加入組分 設(shè)置PCR的循環(huán)程序 外源DNA 高壓滅菌 緩沖液 酶 20 微量離心管 更換 思維激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋 需要旋轉(zhuǎn)酶嗎 提示PCR操作中 模板DNA仍需解旋 但該解旋過(guò)程不是DNA解旋酶催化的結(jié)果 而是利用DNA熱變性的原理 在80 100 溫度范圍內(nèi) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體 雙鏈分開(kāi) 以此達(dá)到解旋的目的 1 PCR儀 PCR自動(dòng)化程度較高 參照下表設(shè)計(jì)程序即可 將微量離心管放在離心機(jī)上 離心約10s 目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部 3 實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰 峰值的大小與DNA的含量有關(guān) 可以利用DNA這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定 具體方法如下 稀釋 2 LPCR反應(yīng)液 加入98 L蒸餾水 即將樣品進(jìn)行50倍稀釋 對(duì)照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對(duì)照 在波長(zhǎng)260nm處 將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 測(cè)定 取DNA稀釋液100 L至比色杯中 測(cè)定260nm處的光吸收值 計(jì)算 DNA含量 g 50 260nm的讀數(shù) 稀釋倍數(shù)特別提醒若沒(méi)有PCR儀 可進(jìn)行水浴擴(kuò)增DNA設(shè)置3個(gè)恒溫水浴鍋 溫度分別為94 55 和72 在3個(gè)水浴鍋中依據(jù)PCR儀的處理時(shí)間來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管即可 鞏固2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR技術(shù) 是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法 由高溫變性 低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期 循環(huán)進(jìn)行 使目的DNA得以迅速擴(kuò)增 其簡(jiǎn)要過(guò)程如圖所示 下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是 A PCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)B 反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板C PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料 以指數(shù)方式擴(kuò)增D 應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變 解析PCR技術(shù)是人工合成DNA的方法 原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸 答案C 例1 2011江蘇 請(qǐng)回答有關(guān)問(wèn)題 1 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似 如下圖所示 圖中引物為單鏈DNA片段 它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ) PCR技術(shù)的原理 從理論上推測(cè) 第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為 在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段 2 設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一 某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物 只標(biāo)注了部分堿基序列 都不合理 如下圖 請(qǐng)分別說(shuō)明理由 第1組 第2組 3 PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶 下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能 這是因?yàn)?思維導(dǎo)圖 歸納提升 PCR技術(shù)特點(diǎn) 1 PCR不需要解旋酶 而生物體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)需要解旋酶 2 PCR需要耐熱的DNA聚合酶 而生物體內(nèi)DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性 3 PCR一般需經(jīng)三十多次循環(huán) 而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的控制 例2 使用PCR儀具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為 設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序 按配方準(zhǔn)備好各組分 用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分 進(jìn)行PCR反應(yīng) 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部A B C D 思維導(dǎo)圖 PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng) 深度剖析PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備 包括配制配方及將各配方放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上 移液 混合 離心 反應(yīng) 因PCR儀是一種自動(dòng)控制溫度的儀器 設(shè)計(jì)好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了 答案C 單擊此處進(jìn)入隨堂達(dá)標(biāo)檢測(cè) 教材P631 提示繪圖可參考教科書(shū)中圖5 9 PCR反應(yīng)中的DNA片段一般以2n的方式積累 其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù) 一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段 2n 230 1073741824 解析PCR擴(kuò)增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長(zhǎng) 2 提示根據(jù)已知DNA序列設(shè)計(jì)引物 因?yàn)镻CR擴(kuò)增的是兩種引物之間的特定DNA序列 解析PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的 引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn) 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全 同學(xué)們 來(lái)學(xué)校和回家的路上要注意安全