2019-2020年高中生物《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》教案2 新人教版選修1.doc

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2019-2020年高中生物《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》教案2 新人教版選修1 ★課題目標 （一）知識與技能 1、了解PCR技術的基本操作 2、理解PCR的原理 3、討論PCR的應用 （二）過程與方法 　　在多聚酶鏈式反應擴增DNA片段的實驗過程中，應避免外源DNA污染，嚴格控制溫度等反應條件 （三）情感、態(tài)度與價值觀 通過對PCR實驗的操作及結果分析，培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和實事求是的科研精神 ★課題重點 PCR的原理和PCR的基本操作 ★課題難點 　PCR的原理 ★教學方法 啟發(fā)式教學 ★教學工具 多媒體課件 ★教學過程 （一）引入新課 在現(xiàn)代生物技術中，DNA技術可謂是尖端技術。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學習DNA分子的擴增技術――PCR技術。 （二）進行新課 1．基礎知識 PCR技術擴增DNA的過程，與細胞內DNA復制過程類似： 1．1細胞內DNA復制條件分析： 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打開DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點 1．2細胞內DNA復制過程 （1）DNA的反向平行結構：（結合教材圖5－6） 核苷酸分子的結構與方向性：（分子結構模式圖） 由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。 DNA雙螺旋結構的反向平行結構： （2）DNA的復制過程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。 引物結合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結合，確保引物3’端與DNA單鏈準確配對。 DNA聚合酶結合： 子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。 后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導鏈，滯后鏈） 子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。 ［思考］DNA分子能準確復制的原因有哪些？ DNA雙螺旋結構提供模板；堿基互補配對；DNA聚合酶的復查功能。 ［思考］細胞內哪些物質是從頭合成的？RNA合成、蛋白質合成。 1．3DNA分子復制的人工控制 解開螺旋：在80～100℃時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。 恢復螺旋：在50℃左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。 復制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。 反應場所：PCR儀（自動溫度周期性調節(jié)）。 ［思考］緩沖液相當細胞內的什么成分？（核基質） 4．PCR的反應過程 延伸 復性 變性 變性：在95℃時DNA解旋 復性：在50℃時引物與DNA單鏈結合 延伸：在72℃時合成DNA子鏈（兩個引物間的序列） 2．實驗操作 2．1 PCR反應體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水 2．2 實驗操作步驟 2．3 按照PCR反應體系配方配制反應液； （2）將PCR反應體系50μL用微量移液器轉移到微量離心管（0.5mL）中； （3）將微量離心管放到PCR儀中； （4）設置PCR儀的工作參數(shù)。 （5）DNA在PCR儀中大量擴增。 2．4 水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應時間。 3．實驗注意事項 3．1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。 3．2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。 3．3每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。 3．4混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。 4．結果分析與評價 4．1反應液稀釋：取2LPCR反應液，添加98L蒸餾水；2．分光光度計調零：將100L蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計調整讀數(shù)為零。 4．2將100L反應稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。 4．3計算：DNA含量＝50光吸收值稀釋倍數(shù) （三）課堂總結、點評 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段 PCR原理 DNA的復制需要酶、原料、能量、引物 DNA的變性和復性受溫度影響 PCR過程 變性 復性 延伸 操作步驟 配制PCR反應體系 移入離心管 放入PCR 設置工作參數(shù) DNA擴增 測定含量 稀釋 調零 測定并讀數(shù) 計算 （四）實例探究 例1 在（ ）的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構解開 A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃ 解析：蛋白質大多不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會變性。 答案：B 例2 關于DNA的復制，下列敘述正確的是（ ） A. DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5’端延伸DNA鏈 B. DNA復制不需要引物 C. 引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結合 D. DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸 解析：由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3’端即復制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈是依據堿基互補配對原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。 答案：C ☆綜合應用 例3 下列有關PCR描述，不正確的是（ ） A. 是一種酶促反應 B. 引物決定了擴增的特異性 C. 擴增產量按y＝（1＋X）n D. 擴增對象是氨基酸序列 E. 擴增對象是DNA序列 解析：PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸，短時間內迅速復制上百萬份的DNA拷貝，其擴增產量為y＝（1＋X）n，y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，x表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，因此答案選D。 答案：D （五）鞏固練習 1．DNA分子復制時，解旋的兩條鏈中（ ） A僅一條作為復制模板 B兩條鏈作為模板并復制出兩個不同的DNA分子 C兩條鏈作為模板并復制出兩個相同的DNA分子 D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結合成一個全新的DNA分子 2.下列關于DNA復制過程的正確順序是（ ） ①互補堿基對之間氫鍵斷裂②互補堿基對之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進行堿基互補配對⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結構 A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤ 3.下列各項過程中，遵循“堿基互補配對原則”的有（ ） ①DNA復制②RNA復制③轉錄④翻譯⑤逆轉錄 A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤ 4.實驗室內模擬生物體DNA的復制必需的一組條件是（ ） ①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度 A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧ 5.利用PCR技術，把一個雙鏈DNA分子當作第一代，經過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ ） A 2 B 4 C 8 D 16， 6.關于DNA分子的敘述中，正確的是（ ） A .DNA的兩條鏈是極性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈是極性相同，反向平行 C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈是極性不同，同向平行 7.假設PCR反應中，只有一個DNA的片段作為模板，請計算在30次循環(huán)后，反應物中大約有多少這樣的DNA片段（ ） A 215 B 230 C 260 D 231 8.DNA的合成方向總是（ ）延伸。 A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端 C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端 9.要使PCR反應在體外的條件下順利地進行，需要嚴格的控制（ ） A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度 10.DNA分子經PCR反應循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應與（ ） A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同 答案： CDADA CBCCB ★課余作業(yè) 1、PCR與生物體DNA復制有何區(qū)別？ 2、如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？ ★教學體會 教師在教學過程中，可以鮮引導學生回憶必修2的有關DNA復制的知識，在此基礎上，學生可加深對于PCR原理的認識。對于PCR反應過程的教學，應以讀圖識圖為主。教材中反應過程圖解詳細的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應的三個基本步驟—變性、復性、延伸；每一步驟的作用。教師在教學中可以請學生在讀圖的同時，結合教科書中的文字說明來加深理解。當學生遇到難以理解的地方時，教師要及時給予解答。 ★資料袋 免疫-PCR 免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測. 免疫-PCR試驗的主要步驟有三個:①抗原-抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質粒DNA).該技術的關鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子-DNA復合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原. 免疫PCR優(yōu)點為:①特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.③操作簡便，PCR擴增質粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行.