高中生物專題5DNA和蛋白質技術課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件新人教版選修

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1、課 題 2 多 聚 酶 鏈 式 反 應 擴 增 DNA片 段【 課 題 背 景 】在 刑 事 偵 破 案 件 中 常 需 要 對 樣 品 DNA進 行 分 析 ， PCR技 術 能 快 速 擴 增DNA片 段 ， 在 幾 個 小 時 內(nèi) 復 制 出 上 百 萬 份 的 DNA拷 貝 ， 有 效 地 解 決 了因 為 樣 品 中 DNA含 量 太 低 而 難 以 對 樣 品 進 行 分 析 研 究 的 問 題 。 現(xiàn) 在PCR技 術 已 廣 泛 應 用 于 遺 傳 病 的 診 斷 、 刑 偵 破 案 、 古 生 物 學 、 基 因 克隆 和 基 因 測 序 ?！?課 題 目 標 】1.理 解 P

2、CR的 原 理 和 反 應 過 程2.嘗 試 PCR技 術 的 基 本 操 作3.討 論 PCR技 術 的 應 用 PCR儀 以 “ DNA復 制 ” 為 背 景 材 料 ， 設 計 問 題 ， 導 入 新 課 ， 首先 回 顧 DNA的 結 構 和 復 制 的 有 關 知 識 ， 然 后 了 解 PCR技 術 的原 理 和 應 用 ， 接 著 講 解 PCR技 術 的 反 應 過 程 及 具 體 實 驗 操 作步 驟 ， 后 以 視 頻 觀 看 來 再 次 學 習 實 驗 的 知 識 點 。 最 后 通 過 課堂 檢 測 完 善 所 學 內(nèi) 容 。 通 過 對 PCR反 應 過 程 的 教

3、學 ， 應 以 讀 圖 識 圖 為 主 。 教 材中 反 應 過 程 圖 解 詳 細 的 描 繪 了 參 與 PCR的 各 種 組 成 成 分 ； 每一 輪 反 應 的 三 個 基 本 步 驟 變 性 、 復 性 、 延 伸 ； 每 一 步 驟 的作 用 。 在 教 學 中 分 析 圖 形 的 同 時 ， 結 合 教 科 書 中 的 文 字 說 明來 加 深 理 解 。 參 與 的 組 分 在 DNA復 制 中 的 作 用解 旋 酶DNA母 鏈4種 脫 氧 核 苷 酸DNA聚 合 酶引 物1.胞 內(nèi) DNA復 制 的 基 本 體 系一 、 基 礎 知 識 打 開 DNA雙 鏈提 供 DNA復

4、制 的 模 板合 成 子 鏈 的 原 料催 化 合 成 DNA子 鏈使 DNA聚 合 酶 能 夠 從 引 物 的 3端 開 始 連 接 脫 氧 核 苷 酸(一 ） PCR原 理 2.DNA雙 鏈 方 向 與 復 制 關 系 （ 2） DNA聚 合 酶 只 能 從 3 端 延 伸 DNA鏈 ， 故 DNA復 制 需 要 引 物 。（ 1） DNA的 羥 基 “ OH” 末 端 稱 為 3 端 ， 而 磷 酸 基 團 的 末 端 稱 為 5 端 。DNA合 成 總 是 從 子 鏈 的5 端 向 3 端 伸3 端5 端 3.PCR原 理（ 1） DNA的 熱 變 性 原 理 通 過 控 制 溫 度

5、來 控 制 雙 鏈 的 解 聚 與 結 合 變 性 ： 80 100 C的 溫 度 范 圍 內(nèi) ， DNA雙 螺 旋 結 構 解 體 ， 雙 鏈 分 開加 熱 變 性 復 性 ： 溫 度 緩 慢 降 低 后 ， 兩 條 彼 此 分 離 的 DNA鏈 重 新 結 合 成 雙 鏈緩 慢 冷 卻 復 性（ 2） 耐 高 溫 的 Taq DNA聚 合 酶 （ 3） 緩 沖 液 為 PCR反 應 提 供 的 物 質 DNA模 板 ， 分 別 與 兩 條 模 板 鏈 相 結 合 的 兩 種 引 物 ， 四 種 脫 氧 核 苷 酸 ，耐 熱 的 DNA聚 合 酶 ， 同 時 通 過 控 制 溫 度 使 DN

6、A復 制 在 體 外 反 復 進 行【 方 法 點 撥 】 細 胞 內(nèi) 復 制 和 PCR不 同 點 PCR過 程 需 要 的 引 物 不 是 RNA， 而 是 人 工 合 成 的 DNA單 鏈 ， 其 長 度 通常 為 20 30個 脫 氧 核 苷 酸 PCR過 程 中 DNA的 解 旋 不 依 靠 解 旋 酶 ， 而 是 通 過 對 反 應 溫 度 的 控 制來 實 現(xiàn) 的 （ 二 ） PCR的 反 應 過 程PCR一 般 要 經(jīng) 歷 三 十 多 次 循 環(huán) ， 每 次 循 環(huán) 分 為 變 性 、 復 性 和 延 伸 三 步(1)變 性溫 度 上 升 到 90 以 上 時 ， 雙 鏈 DN

7、A解 旋 為 單 鏈 。(2)復 性溫 度 下 降 到 50 左 右 ， 兩 種 引 物 通 過 堿 基 互 補 配 對 與 兩 條 單鏈 DNA結 合 。 溫 度 上 升 到 72 左 右 ， 溶 液 中 的 四 種 脫 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在DNA聚 合 酶 的 作 用 下 ， 根 據(jù) 堿 基 互 補 配 對 原 則 合 成 新 的 DNA鏈 。(3)延 伸【 方 法 點 撥 】(1)72 左 右 時 ， TaqDNA聚 合 酶 有 最 大 活 性 ， 可 使 DNA新 鏈 由 5 端向 3 端 延 伸 。(2)DNA聚 合 酶 只 能 特 異 性 地 復 制 處 于

8、兩 個 引 物 之 間 的 DNA序 列 ， 使該 段 固 定 長 度 的 序 列 呈 “ 指 數(shù) 式 ” 擴 增 。 標 準 的 PCR過 程 一 般 分 為 變 性 、 復 性 、 延 伸 三 大 步 ， 這 三 大 步 需 要的 溫 度 依 次 是 ( )A 92 、 50 、 72 B 72 、 50 、 92 C 50 、 92 、 72 D 80 、 50 、 72 欄目鏈接【 典 型 例 題 】A【 方 法 點 撥 】1.變 性 ： 溫 度 上 升 到 90 (90 96 )以 上 時 ， 雙 鏈 DNA解 旋 為 單 鏈2.復 性 ： 溫 度 下 降 到 50 (40 60 )

9、左 右 時 ， 兩 種 引 物 通 過 堿 基互 補 配 對 與 兩 條 單 鏈 DNA結 合3.延 伸 ： 溶 液 中 的 四 種 脫 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在 Taq DNA聚 合 酶的 作 用 下 ， 根 據(jù) 堿 基 互 補 配 對 原 則 合 成 新 的 DNA鏈 二 、 實 驗 操 作1.PCR儀（ 一 ） 設 備 及 用 具一 臺 能 夠 自 動 調(diào) 控 溫 度 的 儀 器2.微 量 離 心 管一 種 薄 壁 塑 料 管 ， 總 容積 為 0.5ml3.微 量 移 液 器用 于 定 量 轉 移 PCR配 方 中 的 液體 ， 其 上 的 一 次 性 吸 液 槍 頭

10、 用一 次 更 換 一 次 1.準 備2.移 液（ 二 ） 實 驗 操 作 步 驟按 照 PCR反 應 體 系 的 配 方 將 所 需 用 的 試 劑 擺 放 在 實 驗 桌 上 。用 微 量 移 液 器 按 照 PCR反 應 體 系 配 方 往 微 量 離 心 管 里 面 加入 各 種 試 劑 。3.混 合 過 程 ： 蓋 嚴 微 量 離 心 管 口 的 蓋 子 ， 用 手 指 輕 輕 彈 擊 管 壁 。 注 意 :A.離 心 管 口 的 蓋 子 一 定 蓋 嚴 ， 防 止 實 驗 中 脫 落 或 液 體 外 溢 。B.手 指 輕 輕 彈 擊 微 量 離 心 管 的 管 壁 ， 目 的 是

11、使 反 應 液 混 合 均 勻 。4.離 心 過 程 ： 將 微 量 離 心 管 放 在 離 心 機 上 ,離 心 約 10s。 目 的 ： 使 反 應 液 體 集 中 在 離 心 管 底 部 ， 提 高 反 應 效 果 。 循 環(huán) 數(shù) 變 性 復 性 延 伸第 一 次 94 C， 10min 30次 4 ， 30s 55 ， 30s 72 ， 1min最 后 一 次 4 ， 1min 55 ， 30s 72 ， 1min5.反 應將 離 心 管 放 入 PCR儀 上 ， 設 置 好 PCR儀 的 循 環(huán) 程 序 ?！?注 意 事 項 】 避 免 外 源 DNA等 因 素 的 污 染 隔 離

12、操 作 區(qū) ， 所 用 微 量 離 心 管 、 槍 頭 、 緩 沖 液 以 及 蒸 餾 水 等 在 使用 必 須 進 行 高 壓 滅 菌 ； 分 裝 試 劑 ， 簡 化 操 作 程 序 ， 使 用 一 次 性 槍 頭 。 在 PCR實 驗 操 作 中 ， 下 列 說 法 不 正 確 的 是 ( )A 在 微 量 離 心 管 中 添 加 各 種 試 劑 時 ， 只 需 一 個 槍 頭B 離 心 管 的 蓋 子 一 定 要 蓋 嚴 ， 防 止 液 體 外 溢C 用 手 輕 彈 離 心 管 壁 的 目 的 是 使 反 應 液 充 分 混 合D 離 心 的 目 的 是 使 反 應 液 集 中 在 離

13、心 管 部 ， 提 高 反 應 效 果變 式訓 練 欄目鏈接【 典 型 例 題 】 A3.離 心 10s的 目 的 是 使 反 應 液 集 中 在 離 心 管 部 ， 提 高 反 應 效 果 ?！?方 法 點 撥 】1.在 微 量 離 心 管 中 添 加 各 種 試 劑 時 ， 每 吸 取 一 種 試 劑 后 ， 移液 器 上 的 槍 頭 必 須 更 換 ， 以 確 保 實 驗 的 準 確 性 ；2.離 心 管 的 蓋 子 一 定 要 蓋 嚴 ， 防 止 實 驗 中 脫 落 或 液 體 外 溢 ； （ 一 ） 理 論 上 DNA擴 增 數(shù) 目 的 計 算1.一 條 DNA， 復 制 n次 ，

14、DNA為 2n 2.a條 DNA， 復 制 n次 ， DNA為 a 2n（ 二 ） 實 驗 中 DNA含 量 的 測 定1.原 理可 以 通 過 計 算 DNA含 量 來 評 價 擴 增 的 效 果 ， DNA在 260nm的 紫 外 線 波段 有 一 強 烈 的 吸 收 峰 ， 峰 值 的 大 小 與 DNA的 含 量 有 關三 、 課 題 成 果 評 價2.過 程 稀 釋 2uLPCR反 應 液 ， 加 入 98uL蒸 餾 水 ， 即 將 樣 品 進 行 50倍 稀 釋 對 照 調(diào) 零 以 蒸 餾 水 作 為 空 白 對 照 ， 在 波 長 260nm處 ， 將 紫 外 分 光 光 度計

15、的 讀 數(shù) 調(diào) 節(jié) 至 零 計 算 取 DNA稀 釋 液 100uL至 比 色 杯 中 ， 測 定 260nm處 的 光 吸 收 值 計 算 DNA含 量 （ g） 50 x(260nm的 讀 數(shù) ） x 稀 釋 倍 數(shù)50： 1 g /mL的 DNA在 厚 度 為 1cm比 色 杯 中 的 吸 光 值 為 0.02紫 外 分 光 度 計 比 色 杯四 、 課 題 延 伸PCR技 術 是 80年 代 中 期 發(fā) 展 起 來 的 體 外 核 酸 擴 增 技 術 。 它 具 有 特 異 、敏 感 、 產(chǎn) 率 高 、 快 速 、 簡 便 、 重 復 性 好 、 易 自 動 化 等 突 出 特 點 例

16、 如 ： PCR產(chǎn) 物 每 輪 循 環(huán) 增 加 一 倍 ， 30輪 循 環(huán) 擴 增 量 達 2 30個 拷貝 （ 109拷 貝 ） 【 課 堂 小 結 】一 、 PCR原 理1.變 性 ： 溫 度 上 升 到 90 (90 96 )以 上 時 ， 雙 鏈 DNA解 旋 為 單 鏈2.復 性 ： 溫 度 下 降 到 50 (40 60 )左 右 時 ， 兩 種 引 物 通 過 堿 基互 補 配 對 與 兩 條 單 鏈 DNA結 合3.延 伸 ： 溶 液 中 的 四 種 脫 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在 Taq DNA聚 合 酶的 作 用 下 ， 根 據(jù) 堿 基 互 補 配 對 原

17、則 合 成 新 的 DNA鏈二 、 PCR操 作1.準 備 2.移 液 3.混 合 4.離 心 5.反 應 PCR過 程 與 細 胞 內(nèi) 的 DNA復 制 過 程 相 比 ， 主 要 有 兩 點 不 同 ， 它 們 是 （ ） PCR過 程 需 要 的 引 物 是 人 工 合 成 的 單 鏈 DNA或 RNA PCR過 程 不 需 要 DNA聚 合 酶 PCR過 程 中 DNA的 解 旋 不 依 靠 解 旋 酶 ， 而 是 通 過 對 反 應 溫 度 的 控 制 來 實現(xiàn) 的 PCR過 程 中 ， DNA不 需 要 解 旋 ， 直 接 以 雙 鏈 DNA為 模 板 進 行 復 制A B C D 【 課 堂 練 習 】 C【 方 法 點 撥 】1.PCR過 程 需 要 耐 高 溫 的 DNA聚 合 酶2.PCR過 程 中 ， DNA不 依 靠 解 旋 酶 解 旋 ， 而 是 利 用 高 溫 解 旋 ， 然 后 以 單鏈 DNA為 模 板 進 行 復 制