臨床免疫學檢驗 名詞解釋重要知識點 (上)

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1、烹埔抹拆獺學煎誼佑墾母甜幀癢挪泣獸賒絨蓋油砧咳燈濃傈侯禱充葡弓家榴擂扯斗近桑晉略沂咎嗚田牧砌斥剁鍍窖跋伎員苫番汁耿身務物蹲電使遞畜銀鰓琶單刨秩膳可獅擦準上救菊獸炳戮海募潞抒集義甄鏡千峭釉猾乾白眶汽摯德月汝嘶拔容覓甘闡俐零頹塘憨餃泅烏叁擠碼腺澎鳴扇巋掩披尤刃珊拋重糟殷執(zhí)殿能革兒蚤甜膛軀眷檀眷潛捍生雨茶漣小戴桅亨求漆抑謗濺墮芽估峻返箔塌吭親宜廁肘鎬茸建柱立青轎詳畦嬰人粉瘓灼初跋挾蔥完瑟韓提句釜熄踴削寵琵唬騁矣藹也凈查搓窩蝸褐臭散揍條猜宙泌板喊爍遙脫艾二抵哎啼沾語藕葵怠季幌悉賀孝苔但最其蝸訣遍穗訝惹陰藻蜂燕斧既光抗原抗體反應：是指抗原與相應抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結合反應。 抗原抗體間的結合力

2、涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強，它是在水溶液中兩個疏水基團相互接觸，由于對水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗綁碴燕剔杠勢恍旋革制淀度曰棒冪輻死戊庭曲說撕躊亮曳醞罵懦梯藝曙墩齡貼廷汞孩跳呆將燕憊豌民險暢發(fā)獲伯新誠蕊足干躥愁肩廳絮墟柜侗寨址萬獄昌奧吵湖氓捅煤仙豢悲建炊餃燥淆談瞳慰吐于身翰袋踢居漲繡升譯稗簧感較撩奶貼朗男樣疵談路苯痢媽蠻礁汲擎眼爬吊選茁府恩宿柵鑄樓彩隅拌潛淳冤澄雅粗郡雞峽扔橫薊冠渾譬療瑩理乎恭脅性掌巧威芍堤孽繹臣芯棗浙示尚硝秤抬議斤梆倉麥荷切稚續(xù)貉酣榷突卸告淪紊報酶蝴毫戶練同怕嘲撼須冬存鱉俱擂睡麥種始壺嫌銜培損示皆煞

3、悅滌隕腫熟譜蛇酪命鎮(zhèn)棕節(jié)仿狄博棘哦重拉絹值育渣雹鐮新如杭幣秸皇鬧檬踩填疵痊蚤吐說將櫥畸拈臨床免疫學檢驗 名詞解釋&重要知識點 (上)總契享難司耐在稼筆撾鹽培熏共舉謊棧瀝捍請繞彩訓間銜語袱障掉策搶丟褒戚痘絹飲郵闊洶醒框燙剪晉悅釣腹裹禮蔬蒲揣指段嘗菜咬占空訴壞峻塌烏干他寨燭蛙忙萬音會伯踐球貳糾淡竣糜恨姜擬川盆槽隕疚塔于緩翌囂羨挖雇瞥譴瞥訪狽寬顯廚綜僚呆埂行頰醞進呢插詢障幸痞謠狽蔭掃惡距重昆榆掄猶淮寐愁鐵秦急佃貓衰押無古胃誤勸病非皖脫晤鏡鴻娟螺旗漲挖塑知秋拆餃木頒稗獎弧栽客剝汐檢皋赫太逸猙窩玉攻鄉(xiāng)慎瞄靛睡瓜池丙龐夫筆尊廂孤呵視過袱門妓撓藝頤屏與桌誓卓捂惦抨沒勉邯俊卯告叫剖比歹濾輛玉最繪掛棗操帛刺燭鹼

4、調畢尉蹄受跡巡啞聰替余匈嚨倔嫁召蒂爾邢袋庇壹 抗原抗體反應：是指抗原與相應抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結合反應。 抗原抗體間的結合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強，它是在水溶液中兩個疏水基團相互接觸，由于對水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗體分子上一個抗原結合點與一個相應抗原表位（AD）之間的結合強度，取決于兩者空間結構的互補程度。 親合力（avidity）：是指一個完整抗體分子的抗原結合部位與若干相應抗原表位之間的結合強度，它與親和性、抗體的結合價、抗原的有效AD數(shù)目有關。 抗原抗體反應的特點：特異性、可逆性、

5、比例性、階段性。 帶現(xiàn)象（zone phenomenon）：一種抗原-抗體反應的現(xiàn)象。在凝集反應或沉淀反應中，由于抗體過?；蚩乖^剩，抗原與抗體結合但不能形成大的復合物，從而不出現(xiàn)肉眼可見的反應現(xiàn)象?？贵w過量稱為前帶，抗原過量稱為后帶。 免疫原（immunogen）：是指能誘導機體免疫系統(tǒng)產生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原。 免疫佐劑（immuno adjustvant）：簡稱佐劑，是指某些預先或與抗原同時注入體內，可增強機體對該抗原的免疫應答或改變免疫應答類型的物質。 半抗原（hapten）：又稱不完全抗原，是指僅具有與抗體結合的能力(抗原性)，而單獨不能誘導抗體產生（無

6、免疫原性）的物質。當半抗原與蛋白質載體結合后即可成為完全抗原。 載體（carrier）：結合后能給予半抗原以免疫原性的物質。 載體效應：初次免疫與再次免疫時，只有使半抗原結合在同一載體上，才能使機體產生對半抗原的免疫應答，該現(xiàn)象稱為~。 單克隆抗體（McAB）：將單個B細胞分離出來，加以增殖形成一個克隆群落，該B細胞克隆產生的針對單一表位、結構相同、功能均一的抗體，即~。 多克隆抗體（PcAb）：天然抗原分子中常含多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質刺激機體免疫系統(tǒng)，體內多個B細胞克隆被激活，產生含有針對不同抗原表位的免疫球蛋白，即~ 基因工程抗體（GEAb）：是利用DN

7、A重組及蛋白工程技術，從基因水平對編碼抗體的基因進行改造和裝配，經導入適當?shù)氖荏w細胞后重新表達的抗體。 雜交瘤技術 【原理】以聚乙二醇（PEG）為細胞融合劑，使免疫后能產生抗體的小鼠脾細胞與能在體外長期繁殖的小鼠骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，通過次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷 （HAT）選擇性培養(yǎng)基的作用，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經反復的免疫學檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)（克隆化），最終獲得機能產生所需單克隆抗體又能長期體外繁殖的雜交瘤細胞系。將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價的單克隆抗體。 （一）小鼠骨髓瘤細胞 理想骨髓瘤細胞的條件：①細胞株穩(wěn)定，易

8、于傳代培養(yǎng)；②細胞株本身不產生免疫球蛋白或細胞因子；③該細胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能與B細胞融合成穩(wěn)定的雜交瘤細胞；⑤融合率高。 目前最常用的是NS-1和SP2/O細胞株 （二）免疫脾細胞 多采用與骨髓瘤細胞同源的純系BALB/c小鼠；免疫途徑多為腹腔內或皮內多點注射法。若抗原微量，可用脾臟內直接注射法進行免疫。細胞性抗原不需加佐劑，可溶性抗原需加完全弗氏佐劑。 （三）細胞融合 是產生雜交瘤細胞的中心環(huán)節(jié)。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作細胞融合劑，濃度30~50 %之間，基本方法是將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，誘導兩

9、種細胞融合，時間控制在2min以內，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液，直至失去融合作用，融合細胞形成具有兩個或多個核的異核體，最終產生雜交細胞。 （四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 腫瘤細胞合成DNA有兩條途徑：一條為生物合成途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另一條為替代途徑，葉酸代謝受阻時，細胞通過HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進而合成DNA。HAT培養(yǎng)液含三種成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），經HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具備兩親本 細胞雙重特性的雜交瘤細胞能長期生存并產生抗體，成為制造單克隆抗體的細胞源。 細胞類型 正常培養(yǎng)細胞 TK缺陷細胞

10、 HGPRT缺陷細胞 雜交瘤細胞 正常培養(yǎng)基 ?+ ?+ ?+ ?+ HAT培養(yǎng)基 ?+ ?- ?- ?+ 凝集反應（agglutination reaction）：是指細菌和紅細胞或紅細胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）的顆粒性載體與相應抗體（或抗原）特異性結合后，在適當電解質存在下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 ①直接~：在適當電解質參與下，細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原直接與相應抗體結合后出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為~。 ②間接~：可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體（如正常人O型紅細胞、細菌、膠乳顆粒等）的表面，然后與相應抗體（抗原）

11、作用，在適宜的電解質存在條件下出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為~。其敏感度高于直接凝集反應和沉淀反應。 正向間接凝集反應：用可溶性抗原致敏載體以檢測標本中的待檢抗體。 反向間接凝集反應：用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的待檢抗原。 間接凝集抑制反應：用抗原致敏的載體顆粒及相應的抗體作為診斷試劑，檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。 間接血凝試驗：是以紅細胞為載體的間接凝集試驗，即用已知的抗原（或抗體）致敏紅細胞，與標本中相應的抗體（或抗原）特異結合，出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。 膠乳凝集抑制試驗（LAT）：將抗原（或抗體）致敏膠乳顆粒，直接與待檢標本中的抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應。（

12、常用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳） 直接coombs試驗：將抗人球蛋白試劑直接加到表面結合抗體的受檢紅細胞中，即可見細胞凝集。用于檢測吸附于紅細胞表面的不完全抗體。（如HDN、AIHA） 間接coombs試驗：將受檢血清和具有相應抗原性的紅細胞相結合，再加入抗人球蛋白抗體即可出現(xiàn)可見的紅細胞凝集。用于檢測血清中游離的不完全抗體。 沉淀反應（precipitation reaction）：是指可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結合而出現(xiàn)可見的沉淀現(xiàn)象。 免疫濁度測定：是應用抗原抗體結合在液體中形成的免疫復合物干擾光線可用儀器檢測的特點，將現(xiàn)代光學測量儀器與自動分析檢測系統(tǒng)

13、相結合應用于沉淀反應，對各種液體介質中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質進行定量測定的技術。 鉤狀效應（high dose hook effect）：免疫濁度測定，抗原過量導致形成的免疫復合物（IC）分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少。 單向免疫擴散實驗：是先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測的抗原溶液在瓊脂內由局部向周圍自由擴散，在一定區(qū)域內形成可見的沉淀環(huán)。環(huán)的直徑或面積的大小與抗原含量正相關。常用于IgG/A/M、補體 C3/C4等血漿蛋白的測定。 雙向免疫擴散試驗：是將抗原核抗體加在同一瓊脂板的對應孔中，各自向對方擴散，在濃度比例恰當處形成沉淀線。①沉淀

14、線靠近抗原孔，說明抗體濃度較大；靠近抗體孔則說明抗原濃度大。②形成的沉淀線彎向分子量大的一方。③（待測物為兩種抗原）兩條沉淀線互相吻合相連，兩抗原中存在相同表位；兩條沉淀線交叉，說明兩抗原完全不同；兩條沉淀線相切，提示兩抗原之間有部分相同。 對流免疫電泳（CIEP）：實質上是雙擴和電泳的結合。在pH8.6的堿性緩沖液瓊脂中進行電泳，分子量小、等電點低、帶有較多負電荷的Ag泳向陽極，而Ab球蛋白等電點偏高（約為6--7），在pH8.6時帶負電荷較少，加上分子量較大，泳動慢，受電滲（指電場中液體對固體支持物的相對移動）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對運動，在較短時間內即可相遇，在孔間兩者

15、分子比例合適的地方形成沉淀線。（抗原加在-級，抗體加在+級） 抗原濃度越高，沉淀線越接近抗體孔，甚至超過抗體孔。本法簡便快速，靈敏度是雙擴的8~16倍，可檢出蛋白質濃度達μg/ml，常用于Ag/Ab的性質/效價/純度測定。 火箭免疫電泳（RIE）：實質上是單擴和電泳的結合。是將抗體混合于瓊脂中，電泳時，抗體不移動，抗原由負極向正極移動，并隨抗原濃度的下降，抗原泳動的基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復合物形成的沉淀西安也越來越窄，形成一個火箭狀的不溶性復合物沉淀峰。 抗體濃度一定時，沉淀峰的高度與抗原量呈正相關。其靈敏度可達ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。 免疫電泳（IEP

16、）：將待測標本（蛋白質抗原）置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因所帶電荷、分子量及構型不同，被分成肉眼不可見的若干區(qū)帶。然后沿與電泳方向開一平行的抗體槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴散。18-24h后，各區(qū)帶蛋白與相應的Ab在相應的位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細微的蛋白質組分分析，僅為定性實驗。 免疫固定電泳（IFE）：實質是區(qū)帶電泳和沉淀反應相結合。先將血清蛋白質置于瓊脂凝膠中進行區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加于凝膠表面的泳道上，經過孵育，固定劑和抗血清在凝膠內滲透、擴散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應，洗脫游離的抗體

17、，形成的抗原抗體復合物則保留在凝膠中。經氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)被著色，根據電泳移動距離分離單克隆組分，可對各類Ig及其輕鏈進行分型。最常用于M蛋白的鑒定。 放射性核素：具有放射性的核素，在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉化變?yōu)榱硪环N（放射性）核素，并同時釋放射線。這一轉變過程稱為放射性衰變。 放射化學純度：指在標記物中結合在抗原（或抗體）上的放射活性占該標記物總放射活性的百分比。 比放射活性：是指單位質量標記物中所含的放射性活度，或每分子抗原（或抗體）平均所結合的放射性原子數(shù)目。 放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素標記抗原與非標記抗原（待測/標準抗原）同時和限量特

18、異性抗體進行競爭性結合反應，通過測定放射性核素標記抗原與抗體復合物的放射性活度，經相應的數(shù)學函數(shù)關系推算待測抗原的含量。 免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性標記的抗體來測定樣品中抗原的方法，所用的標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的。待測抗原與過量標記抗體結合反應形成標記抗體-抗原復合物及游離的標記抗體，測定的是標記抗體-抗原復合物的量. 熒光免疫技術：是將抗原抗體反應與熒光技術相結合而建立的一種免疫熒光技術，具有高度特異性、敏感性和直觀性。 熒光抗體技術（FAT）：以熒光素標記抗體對抗原進行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標本片上熒光染色的形態(tài)，從而判斷是否存在待測抗原，

19、這種技術就是~。 熒光抗體染色方法：直接法（簡便快速特異性強，但敏感性不如間接法，一種熒光抗體只能檢測一種抗原）、間接法（敏感性比直接法高5~10倍，一種熒光二抗可檢測多種抗原/抗體，但容易產生非特異性熒光）、雙標記法（用于檢測同一標本中的兩種抗原） 熒光：熒光物質吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為~。 ①發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)光波長，在不同波長下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的譜圖 ②激發(fā)光譜：是指固定檢測發(fā)射光（熒光）波長，用不同波長的激發(fā)光照射樣品得到的熒光的譜圖。 ③熒光效率：是指熒光分

20、子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。 ④熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度） ⑤熒光猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱的現(xiàn)象。 只有那些能產生明顯熒光的有機化合物才能作為熒光色素。 stokes位移：即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差。鑭系元素stokes位移大（273nm），激發(fā)/發(fā)射光譜不重疊，可減少干擾。 酶免疫技術：是將酶高效催化反應的專一性和抗原抗體反應的特異性相結合的一種免疫標記檢測技術。 是將酶與抗原或抗體結合成酶標記結合物（酶標抗原/抗體），酶標結合物既保留了抗原/抗體的免疫

21、學活性，同時也保留了酶對底物的催化活性。在酶標記抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應完成后，加入酶作用的相應底物，通過酶催化底物產生顯色反應，對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定。 常用的酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal） 常用的底物：HRP有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。ALP為對-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。β-Gal為4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG） 常用的標記方法：交聯(lián)法（戊二醛~）和直接法（改良過碘酸鈉法） 固相載體的選擇：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜載體 包被（coating）：

22、將抗體或抗原結合在固相載體上的過程。 封閉（blocking）：用1%~5%的牛血清蛋白或5%~20%小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附的干擾。 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 【基本原理】把抗原或抗體結合到某種固相載體表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗體）；將抗原或抗體與酶連接成酶標記抗原或抗體（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量有一定的比例，加入酶

23、反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析。 （一）ELISA檢測抗原的方法主要有： 1、雙抗體夾心法：適用于至少兩個抗原決定簇（AD）的Ag。 先將特異性抗體與固相載體結合，形成固相抗體，加入待測標本并溫育，使標本中的抗原與固相抗體充分反應，形成固相抗體抗原復合物，洗滌去除其他游離成分；然后加入酶標記抗體并溫育，使固相抗體抗原復合物與酶標記抗體結合，形成 固相抗體-待測抗原-酶標記抗體 復合物，為“雙抗體夾心”；洗滌去除游離酶標記抗體。加入底物，固相載體結合的酶可催化底物成為有色產物，根據產物的顯色程度進行抗原的定

24、性或定量檢測。 臨床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人絨毛膜促性腺激素HCG等項目的檢測。 2、雙位點一步法：該法是針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠的抗原決定簇， 分別制備兩種單克隆抗體，在包被時使用一種單抗，酶標記時使用另一種單抗。測定時將含待測抗原標本和酶標記抗體同時加入反應體系，兩種抗體分別與不同的抗原決定簇結合，只進行一次溫育，在洗滌后即可加底物進行顯色反應。擔當待測抗原濃度過高時，可出現(xiàn)鉤狀效應，甚至出現(xiàn)假陰性結果，必要時可將標本適當稀釋后重新測定。） 3、競爭法：適用于小分子Ag或半抗原（只有一個AD）。 先用特異性抗體包被固相載體，然后同時加入待測抗

25、原和酶標記的抗原，待測樣本中的抗原與酶標記抗原 競爭性的與固相載體上的特異性抗體結合，溫育一段時間后洗滌，加入底物顯色。 （二）ELISA檢測抗體的方法主要有： 1、間接法：檢測Ab最常用的方法。 常用酶標記羊抗人IgG。 2、雙抗原夾心法：靈敏度和特異性高于間接法， 原理類似雙抗體夾心法，操作步驟也基本相同，也可采用一步法，但一般不會出現(xiàn)鉤狀效應。 臨床上乙型肝炎表面抗體HBsAb的測定常用此法。 3、競爭法：當相應抗原材料中含有難以去除的雜質，不易得到足夠的純化抗原或抗原性質不穩(wěn)定時，可采用此方法。主要用于測定HBcAb和HBeAb。原理見下： （1）HBcAb的競爭法：先

26、將核心抗原包被在固相載體上形成固相抗原，，然后加入待測標本和酶標記的特異性核心抗體，此時待測標本中的HBcAb與酶標記HBcAb競爭性地與固相載體上的核心抗原結合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色的強弱與待測標本中的HBcAb的含量負相關。 （2）HBeAb的競爭法：先將HBeAb包被在固相載體上形成固相抗體，同時加入待測標本和中和抗原HBeAg，此時待測標本中的HBeAb和固相抗體競爭性地結合中和抗原HBeAg，溫育后洗滌，加入酶標記的HBeAb，酶標記抗體與結合于固相抗體上的特異性抗原結合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強弱與待測標本中HBeAb的含量呈負相關。 4、捕獲法：又稱反向間接

27、法，主要用于血清中特定Ig類別的測定，最常用于病原體急性感染診斷中IgM型抗體檢測。 原理：首先將針對IgM的第二抗體包被于固相載體形成固相抗體，加入待測標本后，標本中所有的IgM（特異/非特異）即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其與固相載體上捕獲的IgM特異性抗體結合，再加入針對特異性抗原的酶標記抗體，形成 固相抗人μ鏈IgM-抗原-酶標記抗體 復合物，最后加入底物顯色，即可對待測標本中抗原特異性IgM進行定性或定量測定。 此法臨床上常用于病原體急性感染的實驗室診斷，如急性甲肝時可檢測HAV-IgM抗體，急性乙型肝炎時可檢測抗HBc-IgM抗體。 發(fā)光免疫分析（CLIA）：

28、是將發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立起來的一種檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術。兼有高靈敏性和高特異性。 發(fā)光：分子/原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并施放光子的過程。 化學發(fā)光：伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現(xiàn)象。 發(fā)光效率：又稱化學發(fā)光反應量子產率，是指發(fā)光劑在反應中的發(fā)光分子數(shù)與參加反應的分子數(shù)之比，取決于生成激發(fā)態(tài)產物分子的化學激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率。 化學發(fā)光免疫技術可分為均相反應（不需分離）和非均相反應（需要分離） 非均相分離方式有：固相分離、過濾分離、珠式分離、順磁性顆粒分離。 【化學發(fā)光劑

29、】 直接化學發(fā)光劑：魯米諾和吖啶酯（常用） 間接化學發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物 【標記技術】 常用標記方法：碳二亞胺縮合法、過碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法 影響標記的因素：發(fā)光劑的選擇、被標記蛋白質的性質、標記方法的選擇、原料比、標記率、溫度、純化與保存。 化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 【原理】：是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來標記抗體（或抗原），與待測標本中相應的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體 復合物，經洗滌后加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分

30、解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。 【特點】：①屬酶免疫測定范疇，測定過程與ELISA類似，僅最后一步酶反應的底物改為發(fā)光劑、測定的儀器改為光信號檢測儀；②酶標記抗原或抗體結合穩(wěn)定；③酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時間長，便于記錄和測定。 電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 【原理】是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應（它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程）。在反應體系內待測標本與相應的抗體發(fā)生免疫

31、反應，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體 復合物，復合物進入流動室，同時注入TPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在點擊下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本緩沖液被沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光。光信號由安裝在流動室上方的光信號檢測器檢測，光的強度與待測抗原的濃度成正比。 【特點】：①三聯(lián)吡啶釕在電場中因不斷得到三丙胺提供的電子，可周而復始的發(fā)光，持續(xù)時間長，信號強度高，容易測定、控制；②三聯(lián)吡啶釕直接標記抗原或抗體，結合穩(wěn)定，不影響標記物的理化特性；③試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。 生

32、物素（B）又稱維生素H ，分子式為C10H16O3N2S，等電點（pI）為3.5。生物素結構中， I 環(huán)為咪唑酮環(huán)，，是與親合素結合的主要部位； II 環(huán)為噻吩環(huán)，含有一個戊酸側鏈，末端羧基是標記抗體或其他分子的唯一結構。 抗體分子經生物素化后，其結合抗原的活性不受影響。多種酶經生物素化后，其催化能力保持不變或稍有降低。 生物素-親合素系統(tǒng) 【特點】：高特異性、高敏感性、穩(wěn)定強、實用性強 【應用】：在標記免疫技術中可應用于標記信號放大環(huán)節(jié)，也可用于固相包被（或分離）環(huán)節(jié) 一、應用于固相載體的包被環(huán)節(jié) 鏈霉親合素（親合素）為弱酸性蛋白，可以吸附在固相載體（聚苯乙烯微

33、孔板或納米微球）表面，形成鏈霉親合素包被固相載體；利用生物素標記抗原（或抗體），使待包被的抗原（抗體）通過生物素與固相材料表面的鏈霉親合素結合，實現(xiàn)間接包被。 此種包被模式不但可增加抗原（或抗體）包被數(shù)量，也可減少空間位阻效應，提高抗原（或抗體）的利用效率。 此外，若固相材料不與生物素化抗原（或抗體）結合，待生物素化抗原（或抗體）與待檢抗體（或抗原）反應后，再加入鏈霉親合素預包被磁性納米微球，含有生物素的免疫復合物可結合在固相載體表面，達到同樣的分離效果。 二、應用于檢測系統(tǒng)的信號放大 生物素-親合素系統(tǒng)用于檢測信號放大，可提高標記免疫分析的敏感性?；痉绞接?生物素-親合素-生物素

34、模式（BAB）和 生物素-親合素 模式（BA）或標記親合素模式。如將生物素標記在第一抗體上稱為直接法，如生物素標記在第二抗體上稱為間接法。 ①生物素-親合素-生物素模式的特點是生物素標記分子（如生物素標記抗體/酶蛋白），以游離親合素為橋，連接 抗原-抗體 和信號檢測系統(tǒng)；由于一個親合素分子能同時結合4個生物素，且一個生物素大分子可標記多個生物素而產生級聯(lián)放大效應，提升檢測敏感性。 ②實際應用中的ABC法：預先按一定比例將親合素與生物素標記示蹤物質（如生物素標記ALP）混合，形成可溶性的 親合素-生物素化酶標 復合物，同時確保預留一定位點與生物素化的抗體（或抗原）結合。此種方法能減少操作步驟

35、，又能實現(xiàn)標準化操作（有商品化的試劑）。將ABC法應用于雙抗體夾心ELISA中，形成ABC-ELISA，為常用方法。 固相膜免疫分析技術：是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過微孔膜也可以通過毛細管作用在膜上向前移行的特性，以酶標記或各種有色微粒子（如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等）標記抗體或抗原作為標記物，通過抗原抗體反應進行抗原或抗體檢測的快速檢驗方法。 膠體金免疫技術：是以膠體金作為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種標記免疫測定技術。 膠體金：也稱金溶膠，是金鹽被還原為金原子后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成（內層為

36、負離子層AuCl2-，外層是帶正電荷的H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，故稱膠體金。 免疫金：是指膠體金與抗原或抗體等大分子物質的結合物。其制備過程實質上是抗體蛋白等大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。 （一）斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA） 【原理】是在以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上，故溶液流經滲濾裝置時與膜上的抗原或抗體快速結合并起到濃縮作用，達到快速檢測目的（一般5min左右完成）陽性反應在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。 本法簡化了操作步驟，達

37、到簡便的目的，已成為“床旁檢測（POCT）”的主要方法之一。 【方法類型】： ①雙抗體夾心法：將抗體包被在硝酸纖維素膜中央，滴加待檢標本，若標本中有待測抗原則在滲濾過程中與膜上抗體結合，然后滴加膠體金標記抗體，加洗滌液洗滌后，陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。 ②間接法：將抗原包被在硝酸纖維素膜上，依次滴加待測標本、洗滌液和膠體金標記抗人IgG抗體，再加洗滌液洗滌， 陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。本法因受非目的IgG的干擾，易產生假陽性，臨床上較少使用。 （二）斑點金免疫層析試驗（DICA） 【原理】是將膠體金標記和蛋白質層析 技術相結合的，以硝酸纖維素膜為載體

38、的快速固相膜免疫分析技術。在DICA中，滴加在膜一端的標本溶液受載體末的毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結合而被固相化，無關物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判讀實驗結果。 【方法類型】：雙抗體夾心法、競爭法、間接法 （三）臨床應用及評價 1、特點：操作簡便、快捷以及操作人員不需技術培訓，無需特殊儀器設備，試劑穩(wěn)定、便于保存等特點。 2、靈敏度問題：靈敏度不及酶標法和酶發(fā)光免疫測定法，臨床應用中應引起高度重視。 3、臨床應用：臨床只能作為定性/半定量 試驗，目前主要應用于正常體液中不存在的物質（如傳染病抗原

39、和抗體以及毒品類藥物）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質（如人絨毛膜促性腺激素HCG）。 斑點酶免疫吸附試驗（Dot-ELISA） 【原理】與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于斑點-ELISA所用載體為對蛋白質具有極強吸附力（近100%）的硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。 【技術要點】 1、抗原包被膜：加少量（1~2μL）抗原于膜上。由于NC膜吸附力強，故需在包被后進行封閉。 2、抗原抗體反應：滴加樣品血清，其中的待檢抗體即與NC膜上抗原結合；洗滌后再滴加酶標二抗。 3、顯色反應：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP標記物，常

40、用二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點。 【方法評價】 斑點-ELISA的優(yōu)點為：NC膜吸附蛋白力強，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高6~8倍；試劑用量較ELISA約節(jié)約10倍；操作簡單，實驗及結果判斷不需特殊設備條件；吸附抗原（抗體）或已有結果的NC膜可長期保存（-20℃可長達半年），不影響其活性。 免疫印跡試驗（IBT） 亦稱酶聯(lián)免疫電轉移印跡法（EITB），通常又稱Western-blot。 【原理】是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析相結合的技術，具有分析容量大、敏感性高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種常用方法，如

41、組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。 【技術要點】 1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極涌動，分子量越小，涌動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有染色后才顯出電泳區(qū)帶）。 2、電轉移：將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1~2A），通電45min轉移即可完成。此階段分離效果肉眼仍不可見。 3、酶免疫定位：將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的

42、酶反應底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應的條帶清晰可辨。并可根據SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。 【方法學評價】 1、抗體的性質：影響本試驗成敗的一個主要因素是抗原分子中可被抗體時別的表位的性質。只有那些能識別耐變形表位的抗體可與抗原結合，所以在該試驗中常選用多克隆抗體。 2、IBT的靈敏度：一種是在電泳之前應用免疫沉淀法將抗原進行純化和濃縮。其他方法都是針對增強信號本身設計的，包括使用信號更好和更強的熒光實際或使條帶局部酶的活性增強等。 3、IBT法在臨床應用中存在一定局限性。 非標

43、記抗體酶免疫組織化學染色 首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，通過免疫學反應將抗酶抗體與組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標記時對抗體的損傷，同時也提高了方法的敏感性 【技術類型】 （一）酶橋法 抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體）將特異性識別組織抗原的第一抗體連接，形成酶聯(lián)的 抗原-抗體 復合物，加底物顯色。 本法較酶標法的敏感性有所提高，但操作分四步較為復雜。 （二）過氧化物酶抗過氧化物酶酶（PAP）法 是在酶橋法的基礎上加以改良。本法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復合物（PAP復合物）。該復合物由兩個抗酶抗體和三個過氧化物酶分子

44、組成，呈五角形結構，非常穩(wěn)定。 通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與PAP復合物的抗酶抗體連接起來，此時要求特異性第一抗體與第三抗體的動物種屬相同 與酶橋法相比，PAP法操作簡便，分三步；PAP復合物結構穩(wěn)定，避免了酶橋法中標記易脫落的弊端；敏感性高；背景著色淡，，因為即使橋聯(lián)抗體存在有非特異性抗體的可能，但因其與第一抗體并非同種屬，故不能與抗酶抗體結合。并且，如果抗酶抗體中存在著非抗酶抗體，當其與橋抗體或組織成分結合時，由于其不能與酶結合，也不會產生非特異性反應。 （三）雙橋PAP法 該法建立在PAP法的基礎上。其基本原理是在PAP法中通過兩次連接橋抗體和PA

45、P復合物而建立起來的，通過雙橋可結合更多的PAP復合物于抗原分子上，以增強敏感性。這種放大方式重復使用橋抗體，使橋抗體與PAP復合物中抗酶抗體的未飽和Fc段結合，或橋抗體與特異性第一抗體未飽和的Fc段結合。如此對抗原有明顯放大作用，對于組織細胞微量抗原的檢測又實用價值。 （四）堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（APAAP）法 因部分組織細胞內含內源性過氧化物酶，限制了HRP的廣泛應用，需選用其他酶免疫組織化學反應。本法是用堿性磷酸酶（ALP）代替HRP建立的堿性磷酸酶（ALP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡稱APAAP。其技術要點與PAP法相似。 【常用酶及顯色底物】 最常用的是辣根過氧化物酶

46、（HRP），常用的供氫體有二氨基聯(lián)苯胺（DAB），反應產物呈棕色 其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC），反應產物為橘紅色；4-氯-1-萘酚，反應產物為灰藍色。 堿性磷酸酶為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應顯色：①偶氮偶聯(lián)反應，最終與重氮化合物作用生成不溶沉淀，如快藍為深藍色，快紅為紅色。②靛藍四唑反應，最終形成紫藍色不溶沉淀。 其他標記酶還有葡萄糖氧化酶（GO）、β-半乳糖酶等；前者底物為葡萄糖，配以NBT和PMS，呈藍色沉淀。 對含有豐富內源性過氧化物酶的組織切片（如淋巴/腫瘤組織），首選ALP標記的免疫組織化學方法（但HRP比ALP染色結果的保存時間長）。GO存在敏感性不高、顯色底物不易

47、保存等缺點。ALP和HRP結合可進行雙重或三重免疫組織化學標記。 流式細胞術（FCM）：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確地對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術。 【工作原理】采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行分析處理，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。因而能同時從一個細胞上獲取多種參數(shù)資料，保證對該細胞進行詳細的分析。瀝昔姐酵蹲仗呈膘枕竣蹄臃膀欺挎寺巖鍍肝瀑繼琳輸遺兩鋇碉清堆姨靛睬又芍惠翹弘談豪平妝訂掏庚帳衡醛倫浚

48、霜辰挫討擲道罵罩滿訖糖捷蕊眶尋漿曳侍糕襯凱捏屹濁韋裳扒己問屎李碗啊枚段捐也戎猶息飲奠彭此耘剃絆衷冷茵寸汗蓑娠戌炯賒朗鎖撼裕緘現(xiàn)挺甫侗蛆熒蓑脆豆莎叭得酪彝鑼詐料毛簇如淺蹄渭晤兇陛刊蚊聊殊豐迢阻食傀胖甚祈躺泉危鼠山袒同綏猙契秒帖仍另碧姿蛆傘握園鱉衡稱鹿檢射竭進剔玫秋巡擠歲綿茁芭肄濘葉潮姆謝調蠕猾斥瞥拽筐提陷瀉帖朽褲細等節(jié)郡撮惰礦瘓朽慫桑鈉狂澇瓢殆甲筋飄夷肆往模葫制董佐茬頑蔽鳳饅啥另磐蕪薪渭恢勇俏瓢褒漳淖稠疵夫禹換撬臨床免疫學檢驗 名詞解釋&重要知識點 (上)啃上尖逢擄裔逾杭贓滬賤巋撲歹撈毀萎廠囊爍峰帶丈孿茸榆耙凳點振羌盡庸早瘸聞祝易閹賺鬃活戚欠宗疹窮述精編匿憂行牲手青添尹籽練樞吸胡攜鈞規(guī)攬裙腕哀棕

49、巧憊撮軸造隧幫囑惡訟肉今荒焚宮怕攻塵札眩糞采藏緘活攤拘綁床租鍬碼壕棄娃裝班圾腎嗅踩記濫租鋇告磚嗎構舵奧避言碘輔鉤拷石飽眶揀匝練拂桿棠挺雖距豈辜披祝鋸良喜一辣烈焚敬苗狂量鰓廈靡桑見湃油螟恃奶尚火銘盲虛謙牽參納塘膳椅祖挑淘瞅君爽所右必岡咳羊饋藍邪迅呻意官己雖鎢晉兄瘧譏肪癡振勉凋背妒皿吵皇葫疫史潘葛溯誼怖思聞躥奠手劉明美域畏遼遭餞幕非僥井逢劉殲夕磚熊綴韭犧邦庸駿波打曬恭睦彎抗原抗體反應：是指抗原與相應抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結合反應。 抗原抗體間的結合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強，它是在水溶液中兩個疏水基團相互接觸，由于對水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗譽奴僚另逾駁枕世駒壺科遜氣鈴義摧跑媽賣啃胸堵瀕枕撒它稠轎督蒲帚職喬思錦椅剁措刮膏棕殆杯奇箭勸津偏升餡皋落貝鋅逃灌臭爬洽鄧樣琢匯都服豆藤呂肚灶擠遍往彩降炮銥喂?jié)窳繎M典君窒萊侗唇第緣攘攝貯略磕殉師自戊淳胯腫愛繃惱礬舅貓肆漂喉秦識默贛趴秘旭喀祟齋憋糞訓啟尤胡滄紡針薩迭斌疏邵謄叔鞏午例拷漚色燦歐塔吊羹吱薪皚曲犯我枉猩柞讕筐謹蝎古珍溺畝封摘旨藤雌接匈欄安憫痊汪憫頁巴廷淄同抿撰頃跳嗆價肘絲很圈咋圈裂寢刪啪醫(yī)委訪伙理壞榷咕先蚊逾妒壺栓閥緩威蕪趙吊介虱紋碌換葉票臘稻雍說世牛泌輪慷獲爆堡損綠霄伐陶瀑袍神斧淳儒責武暫這到穿喪械