細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件

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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),1,參考書(shū)目,《細(xì)胞培養(yǎng)》，世界圖書(shū)出版公司，1996年 《培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》 ，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004年,2,本次課內(nèi)容 細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí),一、緒論 培養(yǎng)法的種類(lèi)、培養(yǎng)法的發(fā)展、細(xì)胞培養(yǎng)的常用術(shù)語(yǔ)、培養(yǎng)細(xì)胞的作用及意義、培養(yǎng)法的應(yīng)用 二、培養(yǎng)細(xì)胞的特征 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類(lèi)型、 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生長(zhǎng)增殖過(guò)程、 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,3,一、緒論,4,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 即：從活體中取出小塊組織分離出細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長(zhǎng)、增殖的一種方法。 涉及有細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)與植物學(xué)、病原學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、生物工程學(xué)甚至光學(xué)、物理學(xué)等等學(xué)科。因其涉及面很廣所以已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。,細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture),5,組織培養(yǎng)的概念,組織培養(yǎng)（tissue culture）： 其本意是指從體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。,6,器官培養(yǎng)（Organ culture）： 指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法，以上三個(gè)層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（in vitro）。,7,培養(yǎng)法的種類(lèi),體外培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng),,8,體 外 培 養(yǎng) 種 類(lèi),9,細(xì)胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。 群體培養(yǎng)（mass culture）：即將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長(zhǎng)，形成均勻的單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液。 克隆培養(yǎng)（clone culture）：即將少數(shù)細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)繁殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆。,10,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）,11,原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，個(gè)別集落形成，細(xì)胞圍繞中心漩渦狀排列﹙100﹚,12,原代培養(yǎng)第7天，多個(gè)集落形成并融合﹙100﹚,,,13,培養(yǎng)法的發(fā)展,組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。 德國(guó)人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存活數(shù)月被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗(yàn)。 1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞生活一個(gè)月，提示組織或細(xì)胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍能生存。,發(fā)展簡(jiǎn)史,14,培養(yǎng)法的發(fā)展,關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭(zhēng)議。 哈里森（生理學(xué)家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓節(jié)段在淋巴液中進(jìn)行培養(yǎng)。 在顯微鏡下觀察到從神經(jīng)芽細(xì)胞延伸出神經(jīng)軸突的狀況。 建立起一套合理的無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù) ——哈里森懸滴培養(yǎng)法,發(fā)展簡(jiǎn)史,15,哈里森懸滴培養(yǎng)法,將蛙胚原始脊髓節(jié)段，移到事先滴有從成體蛙淋巴囊吸取的新鮮淋巴的蓋玻片上， 淋巴很快凝固，使組織小塊固定在一定的位置上。 然后將蓋玻片倒置于一塊中央凹陷的厚載玻片上，蓋玻片的周緣用蠟封固。 蛙胚神經(jīng)組織存活了數(shù)周——體外培養(yǎng)組織和細(xì)胞的基本模式系統(tǒng)。,發(fā)展簡(jiǎn)史,卡氏瓶的發(fā)明,Carrel用反復(fù)傳代的方法使細(xì)胞系存活34年。他采用的無(wú)菌技術(shù)，以及后來(lái)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是對(duì)組織培養(yǎng)的重要貢獻(xiàn)。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來(lái)的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。,發(fā)展簡(jiǎn)史,17,組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖,1923年，Carrel設(shè)計(jì)了卡式瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織的生存空間。 1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染。,發(fā)展簡(jiǎn)史,18,1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了的單層細(xì)胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)成了組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。促進(jìn)了細(xì)胞系(cell line)的建立。 近年各種條件已商品化系列化，應(yīng)用冷凍技術(shù)，各國(guó)建立細(xì)胞庫(kù),發(fā)展簡(jiǎn)史,19,我國(guó)組織培養(yǎng)的發(fā)展,20世紀(jì)30年代傳入我國(guó)。 20世紀(jì)50年代起步。 20世紀(jì)70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中應(yīng)用的手段。,20,組織培養(yǎng)常用術(shù)語(yǔ),原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開(kāi)始的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)（passage culture）：將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 注：傳代（passage，subculture）,21,原代培養(yǎng),胎兒細(xì)胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞比較容易，上皮細(xì)胞培養(yǎng)難。 細(xì)胞間的分離酶：胰蛋白酶、膠原酶、 單一種類(lèi)細(xì)胞的分離培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)條件——培養(yǎng)基、細(xì)胞接著面的條件、接著速度、離心法等。,術(shù)語(yǔ),22,細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。 細(xì)胞株（cell strain）：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的特殊性質(zhì)或標(biāo)志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物。 克?。╟lone）：指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳性狀相同的細(xì)胞群體。,術(shù)語(yǔ),23,有分化特性的細(xì)胞系和細(xì)胞株,24,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià),優(yōu)點(diǎn)： 1、活細(xì)胞： 能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)； 2、可控制： 選擇對(duì)象：均一性、重復(fù)性（類(lèi)型、性質(zhì)、階段） ； 調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學(xué)、生物等因素）； 利用方法：研究技術(shù)、記錄方法； 3、應(yīng)用廣： 領(lǐng)域多：醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、基因工程等 對(duì)象廣：各種動(dòng)物（低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類(lèi)） 一種動(dòng)物（不同年齡、不同組織） 正?；虍惓＃[瘤） 4、較經(jīng)濟(jì)： 可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；,25,缺點(diǎn)： 1、培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生改變； 2、對(duì)人員、設(shè)備等要求較高。 與體內(nèi)主要不同 相對(duì)孤立、相對(duì)單一、缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱、細(xì)胞趨向單一化。 提示 要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià),26,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究、觀察內(nèi)容,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)：例如能量的代謝、DNA轉(zhuǎn)錄、凋亡及蛋白合成等。 細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間的作用：如細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)、藥物對(duì)細(xì)胞的作用、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌等。 細(xì)胞間的相互作用：如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞間的粘著作用、接觸抑制、密度抑制等。 細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、鈣離子的流動(dòng)、RNA的移動(dòng)、激素受體復(fù)合物的易位等。 遺傳學(xué)：如遺傳分析、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等。,27,細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域,（一）、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用 （二）、在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 （三）、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 （四）、在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 （五）、在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用 （六）、在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用 （七）、在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用 （八）、在器官移植中的應(yīng)用,28,病毒檢驗(yàn)方法,病毒學(xué),29,檢測(cè)病毒,30,雜交瘤技術(shù)Hybridomas,免疫學(xué),31,單克隆抗體制備,免疫學(xué),32,在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用,1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 2、 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 3、基因診斷和基因治療,33,器官移植→組織工程,種子細(xì)胞（干細(xì)胞） 支架材料,34,組織工程,,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,二、培養(yǎng)細(xì)胞的基本特征,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類(lèi)型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生長(zhǎng)增殖過(guò)程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,45,（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類(lèi)型,粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才 能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 如：成纖維細(xì)胞、心肌與平滑肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞 懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 如：血、脾及骨髓培養(yǎng)的細(xì)胞及某些癌細(xì)胞,46,粘附型（貼壁型）細(xì)胞,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí) 明顯不同。,47,粘附型細(xì)胞,48,成纖維型細(xì)胞,上皮型細(xì)胞,49,游走型細(xì)胞,多形型細(xì)胞,50,成纖維型細(xì)胞,來(lái)源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細(xì)胞，如：成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。 形態(tài)：類(lèi)似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中央有卵圓形核。 生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀生長(zhǎng)。,51,上皮型細(xì)胞,來(lái)源：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如：皮膚及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性腫瘤等。 形態(tài)：類(lèi)似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，呈扁平、不規(guī)則、多角形，中有圓形核。 生長(zhǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞緊密相連成單層膜 相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀,52,培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而發(fā)生改變，如pH、細(xì)胞密度、污染等因素。 HeLa細(xì)胞： 血清 高血清——成纖維樣細(xì)胞 低血清——上皮樣細(xì)胞 pH 標(biāo)準(zhǔn)pH——上皮樣細(xì)胞 太酸或太堿——成纖維樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 低密度——成纖維樣細(xì)胞 高密度——上皮樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化——成纖維樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化后——上皮樣細(xì)胞,粘附型細(xì)胞,53,,,54,55,懸浮型細(xì)胞,概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。 來(lái)源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞為主。 特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形，呈單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)。,56,,,優(yōu)點(diǎn)： 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)： 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞),懸浮型細(xì)胞,57,58,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn),粘附并伸展 是大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。細(xì)胞在接種后很快便可見(jiàn)到細(xì)胞伸出偽足附著，與支持物形成一些接觸點(diǎn)，接著細(xì)胞逐漸呈扁平或放射狀伸展，逐漸形成上皮型或成纖維型或其他類(lèi)型生長(zhǎng)。 密度依賴性 細(xì)胞接種密度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。當(dāng)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)、融合成單層時(shí)，細(xì)胞變得較為擁擠，而扁平形狀的程度減少，與培養(yǎng)基的接觸面減少，同時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物逐漸消耗，細(xì)胞分裂減弱，增殖減慢。,59,二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程,單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle） 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程 培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期,60,單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle）,生長(zhǎng)增殖過(guò)程,61,組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期,原代培養(yǎng)期 傳 代 期 衰 退 期,62,原代培養(yǎng)期,又稱初代培養(yǎng)期 （primary culture），從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1～4周。 此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛；細(xì)胞形態(tài)相似。 細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。,63,傳代培養(yǎng)期 初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系cell line。 此期為三期中最長(zhǎng)，可維持二倍體核型（二倍 體細(xì)胞系）。 當(dāng)傳代30～50代后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致 完全停止。 衰退期 細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài) 輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。,64,體外培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長(zhǎng)過(guò)程,65,第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線,66,接觸抑制（contact inhibition）：貼壁生長(zhǎng)的體外正常細(xì)胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進(jìn)入S期，也不會(huì)出現(xiàn)交叉重疊生長(zhǎng)。 惡性細(xì)胞無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，所以可將其作為區(qū)別正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。 密度抑制（density inhibition）：培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的特點(diǎn),67,傳代細(xì)胞可連續(xù)傳7——10代，細(xì)胞形狀基本相同，但隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞逐漸呈老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為:細(xì)胞增殖速度明顯減慢，胞漿中出現(xiàn)空泡及顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄剑ベN壁能力，從培養(yǎng)瓶底脫落。,68,三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件,水——高度純化 糖——葡萄糖 氨基酸——12種 維生素 無(wú)機(jī)離子和微量元素 促生長(zhǎng)因子,69,各種培養(yǎng)基,70,71,72,血 清,血清的種類(lèi) 血清的主要成分及主要作用 血清的使用與儲(chǔ)存 影響血清的各種因素 細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn),73,1、血清的種類(lèi) 胎牛血清：剖腹產(chǎn)的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之內(nèi)的新生牛 小牛血清：出生10～30d的小牛 （人血清、馬血清、羊血清） 2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)活性是達(dá)到生理平衡的。,74,75,76,血清的主要作用,提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 提供貼壁和擴(kuò)展因子（FN、LN） 提供激素及各種生長(zhǎng)因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細(xì)胞障礙因素） 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用注意點(diǎn)： 血清型號(hào)、種類(lèi)不同，所含營(yíng)養(yǎng)因素有差別，不可忽視； 在需要觀察細(xì)胞某種特性時(shí)，血清使問(wèn)題變復(fù)雜，要除去。,77,血清的使用與儲(chǔ)存,使用前的處理 56℃滅活30min → 去除補(bǔ)體成分 （趨勢(shì)：大部分細(xì)胞培養(yǎng)不需滅活； 需要滅活的：巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等） 儲(chǔ)存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），－20 ℃儲(chǔ)存；使用前4 ℃融化。 使用濃度 一般為5％～20％，最常用的是10％。,78,影響血清的各種因素,年齡：較老動(dòng)物的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好,79,細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn),使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。 如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)會(huì)抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 血清中含有一些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶 每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。 取材過(guò)程中有可能帶入支原體、病毒，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。,80,影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素,溫度 滲透壓 氣體環(huán)境和pH 無(wú)毒和有毒 輻射線和超聲波 細(xì)胞接種密度 容器轉(zhuǎn)動(dòng)速度和懸浮攪動(dòng)速度,81,溫 度,一般哺乳類(lèi)及禽類(lèi)細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度37～38℃，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)。,溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,82,低 溫,在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低。 溫度不低于0 ℃時(shí)，雖影響細(xì)胞代謝，但并無(wú)傷害作用；再把細(xì)胞置于25～35 ℃時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度減慢。 若溫度過(guò)低，在降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。 若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲基亞砜等，封入凍存管，置于液氮中，細(xì)胞可耐受－70 ℃以下溫度，能長(zhǎng)期儲(chǔ)存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長(zhǎng)增殖，生物性狀不受影響。,83,高 溫,細(xì)胞在40℃數(shù)小時(shí)后，再置回37 ℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)；但如果在40 ℃下暴露時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，甚至變圓脫離瓶底。 細(xì)胞在39～40 ℃培養(yǎng)1h，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2 ℃，持續(xù)數(shù)小時(shí)，即在41～42 ℃中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，溫度至43 ℃以上時(shí)細(xì)胞多數(shù)被殺死。 高溫主要引起酶的滅活、類(lèi)脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性。,84,氣體環(huán)境和pH,氧（O2） 參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種所需成分。 采用開(kāi)放式培養(yǎng)時(shí)（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。,85,二氧化碳（CO2）,CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。 大多數(shù)細(xì)胞適于在pH 7.2～7.4條件下生長(zhǎng)，低于pH 6.8或高于pH 7.6對(duì)細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。 細(xì)胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。 隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放CO2增多，使pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動(dòng)，在開(kāi)瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值。,86,無(wú)污染及無(wú)毒,直接或間接接觸的器皿、材料 污染：細(xì)菌等微生物、細(xì)胞間、有害物質(zhì),87,本章小結(jié),培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類(lèi)型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生長(zhǎng)增殖過(guò)程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,88,細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè) 置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作,89,一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施,無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室 超凈工作臺(tái) 恒溫培養(yǎng)箱 其他設(shè)備 （電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）,90,無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室,設(shè)計(jì)原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無(wú)煙塵。 組成： 更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。 緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與 幾個(gè)操作間相通。 操作間：放在內(nèi)間，供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)， 房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。,91,92,超凈工作臺(tái),分類(lèi) 側(cè)流式：氣流由左側(cè)或右側(cè)通過(guò)臺(tái)面流向?qū)?cè) 直流式：氣流從上向下或從下向上流動(dòng) 外流式：氣流向操作者方向吹來(lái) 注意事項(xiàng)： 使用前半小時(shí)先開(kāi)紫外線燈滅菌，再關(guān)滅菌燈啟動(dòng)風(fēng)機(jī)，然后進(jìn)行操作。 使用后用1：1000的來(lái)蘇水或75％的酒精擦洗臺(tái)面。 切記：不要用有機(jī)溶劑擦拭擋風(fēng)玻璃。,93,94,恒溫培養(yǎng)箱,95,96,其 他 設(shè) 備,97,98,99,100,101,二、細(xì)胞培養(yǎng)常用器材及處理方法,玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金屬器材 其他用品,102,玻璃器材,常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管。 首次使用： 重復(fù)使用的處理步驟：,103,塑料器材,常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、6孔、12孔、24孔、96孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。 重復(fù)使用的處理步驟：,104,105,,106,橡皮器材,首次使用：,4％HCl鹽酸煮沸15min,自來(lái)水沖洗8次,,,107,重復(fù)使用的處理步驟： 注意：橡膠器材需用鋁鉑包裝，放在鋁盒內(nèi)高壓蒸汽滅菌。,108,其他用品,緩沖液（PBS）：高壓蒸汽消毒 血清：56℃水浴滅活30min 合成培養(yǎng)基：過(guò)濾除菌 （0.22μm、0.45μm）,109,小 結(jié),一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、其他設(shè)備 二、細(xì)胞培養(yǎng)常用器材及處理方法 玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金屬器材、其他用品,110,,,謝 謝,111,