原位雜交原理及具體操作.doc

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原位雜交實驗原理與方法 一、目的 本實驗的目的是學(xué)會原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的基本原理和優(yōu)缺點。 二、原理 原位雜交組化（簡稱原位雜交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。 當(dāng)然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。 探針的種類按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。 探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。 原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。 菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）　　菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。 組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）　　組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。 （一）探針的選擇 根據(jù)不同的雜交實驗要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細(xì)胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。 在選用探針時經(jīng)常會受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時，可采用PCR方法擴增某段基因序列，并克隆人合適的質(zhì)粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。 （二）探針的標(biāo)記方法 在選擇探針類型的同時，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時，還應(yīng)考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。 （三）探針的濃度 總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。 （四）雜交率 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度）和探針濃度。 （五）雜交最適溫度 雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃ 苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – （10或15℃） 非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – （30或35℃） （六）雜交的嚴(yán)格性 影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體?（七）雜交反應(yīng)時間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中 未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。 Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。 （八）雜交促進劑 惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。 硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。 小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。 （七）雜交反應(yīng)時間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。 Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體 Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。 （八）雜交促進劑 惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用?？傊蛩崞暇厶呛途垡叶家蚰苡糜诠滔嚯s交是目前最常用的雜交促進劑。 三、主要器材 醫(yī)用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。 四、試劑 （二）? 試劑: ●? 2.5ml/L 的醋酸－－2.5ml/L醋酸酐: 三乙醇胺 13.2ml 氯化鈉 5g 濃鹽酸 4ml 醋酸酐（用前加） 2.5ml； ●? 20×SSC（pH7.0）： 氯化鈉 175.3g 枸櫞酸鈉 88.2g 雙蒸水定容至1L； ●? 100×Denhardt‘s: Ficoll 1g PVP 1g BSA 1g ddH2O 定容至50ml； ●? 雜交液：（50ml） 用量 終濃度 100%去離子甲酰胺 25ml 50% 100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10% 100×Denhard‘s 0.5ml 1 1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm 5M NaCl 3ml 0.3M 0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM 10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/ml ddH2O定容至25ml ●? 0.1M甘氨酸/PBS: 甘氨酸 7.5g Na2HPO4 30.8g NaH2PO4 2.8g NaCl 8.5g 溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲存； ●TSM1 （1000ml）： 1MTris-HCL（PH8.0） 100ml 5M NaCl 20ml 1M MgCl2 10ml ddH2O定容至1000ml； ●TSM2 （1000ml）： 1MTris-HCL（PH8.0） 100ml 5M NaCl 20ml 1M MgCl2 50ml ddH2O定容至1000ml； ●? 抗體稀釋液： 100ml BSA 1.0g Tris X-100 0.4ml 疊氮鈉 0.4g 0.05M PBS （PH7.2）調(diào)至100ml； ●? 0.05M PBS （PH7.2）：1000ml Na2HPO4 15.4g NaH2PO4 1.4g NaCl 4.25g ●去內(nèi)源性酶液（40ml）： 儲存液 用量 終濃度 10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5% 冰醋酸 10.0ml 25.0% 加0.05MPBS至40ml ●? 0.4% Triton-X 100 五、操作 （一）? 脫蠟，水化： 1、? 二甲苯10min 兩次 2、 無水乙醇3min 兩次 ３、95%乙醇3min 一次 ４、75%乙醇3min 一次 ５、50%乙醇2min 一次 ６、重蒸水2min 一次 ７、PBS洗滌5min （二）? 將組織芯片放入去內(nèi)源性酶液中浸泡30min；PBS洗滌5min （三） 0.1M甘氨酸去游離醛基 15min；0.4%tritonX-100 洗10min； （四） 用蛋白酶K與37℃孵育30min ，PBS振洗5min （五）? 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ； （六）? 滴加預(yù)雜交液42℃,30min；將RNA探針用預(yù)雜交液稀釋（1ng/ｕL~2ng/ｕL） （七）? 雜交 １、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加20~50ｕL的雜交液到組織芯片TMA上，42℃~44℃濕盒中過夜。 ２、在4×SSC中37℃洗滌15min ３、2×SSC，加入RNA酶（大致為10ｕg/ml）37℃中洗滌30min， ４、0.5×SSC,37℃洗滌15min （八）封閉 １、1%正常山羊血清孵育30min ２、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（1：500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min ３、TSM1洗； ４、TSM2洗； （九）顯色：用TSM2將NBT/BCIP按2：1稀釋進行顯色；顯微鏡下掌握染色程度 （十）終止顯色：用水終止 （十一）脫水，透明，封固 １、85%乙醇脫水，2min ２、95%乙醇脫水5min ３、無水乙醇脫水15min ４、二甲苯20min ５、封片，鏡檢 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 點擊次數(shù)：236 發(fā)布時間：2010-2-1 8:13:09 ? 一、核酸分子雜交技術(shù) 1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點雜交法（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。 二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展 原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時，Buongiorno– Nardelli和Amaldi, John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。 由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。 Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進行定位。本法的優(yōu)點是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團、連結(jié)臂和生物素（圖20-1）。在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。 近年來，地高辛（Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。 核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章）。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDNA是指互補于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。 DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優(yōu)點，也可進行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 Coulton（1991）建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（Affinity– Complex Labelled Probes, ACLP ）。因為“非（ non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個學(xué)科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié)將詳加敘述。 三、位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 如前所述，由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visual－ization）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。 a）??????????? 固定 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。 b）?????????? 玻片和組織切片的處理 1．玻片的處理　　玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放 由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。 2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性　　此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。蛋白酶K（ Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1μg/ml（于0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中）,37℃孵育15～20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報告應(yīng)用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1N HCl 配）37℃、30min進行消化，所獲實驗結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。 不少實驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/L NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學(xué)者卻對此持有異議，根據(jù)他們的實驗和經(jīng)驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。 3．減低背景染色　　和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實驗程序中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。 4．防止RNA酶的污染　　由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時，亦可用國內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)）。雜交前及雜交時所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。 c）??????????? 雜交（Hybridisation） 在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內(nèi)向正華等采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實驗結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時間較長時，為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。 如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實驗結(jié)果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。 1．探針的濃度　　很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外實驗工作者的經(jīng)驗，認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們在免疫細(xì)胞化學(xué)試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。 探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗及所查閱文獻(xiàn)，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根據(jù)Heinz、Hofelt實驗室經(jīng)驗，對放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實驗室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛） cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長抑素cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/μl。 必須強調(diào)的是，國內(nèi)外實驗室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。 2．探針的長度　　一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50～100個堿基之間。探針短易進入細(xì)胞，雜交率高，雜交時間短。據(jù)報告，長500個堿基的探針，其雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過500個堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實驗所需求的堿基數(shù)。 3．雜交的溫度和時間　　雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡稱Tm）。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。Tm的計算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。 雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時間為2～4h。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應(yīng)時間定為16～20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報告看無不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實驗確定。有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。 4．雜交嚴(yán)格度（Hybridization stringency）　　雜交條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對（mismatch）雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來說，低嚴(yán)格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm-35℃至Tm–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度， Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴(yán)格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。麥躍行裝用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴(yán)格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。因為，在嚴(yán)格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴(yán)格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴(yán)格條件下進行，而低嚴(yán)格條件則可用于對病毒感染進行篩選。 由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無疑會產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進行細(xì)胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。 5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）　　硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。 甲酰胺的主要作用在上節(jié)已提及，在調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。 d）?????????? 雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實驗程序中，這也是一個重要的環(huán)節(jié)。特別因為大多數(shù)的原位雜交實驗是在低嚴(yán)格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標(biāo)記的多少）作為改善漂洗程序的指針。在35S標(biāo)記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35S標(biāo)記的核酸探針被氧化。總之，如何控制漂洗的嚴(yán)格度從而達(dá)到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復(fù)的實踐中取得經(jīng)驗。 e）??????????? 顯示（Visualization） 顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（Detection system）。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer– assisted image analysis）檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強度進行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴(yán)格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。 f）??????????? 對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷 和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。從理論上講，對照試驗設(shè)置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應(yīng)任選設(shè)至少3～4種用以證實ISHH結(jié)果的可靠性。在上述試驗中，標(biāo)明*者為比較可靠的對照試驗。①Northern 和 Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測抗體（蛋白質(zhì)）的特異性一樣，是比較可靠的。②如果具備相當(dāng)?shù)拿庖呓M化抗血清，可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。③預(yù)先將切片用 DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同義RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。④檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進行。 ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達(dá)到20個mRNA拷貝/每個細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片 ，長于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。因為如前所述，影響ISHH實驗結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒炄〔暮笪醇皶r的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。 原位雜交實驗步驟 一質(zhì)粒制備 1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增 1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌 1． 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、100 rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min， 離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌， 分裝(200 μ／tube)，-80 ℃保存。 2． 轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒 DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。 3． 輕輕搖勻，冰浴30 min。 4．42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。 5． 加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育 60 min。 6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨芐青霉素50 mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。 1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落 1． 用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管 中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50μl 10mmol／L EDTA(pH 8.0)。 2． 加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩 3O秒。 3． 在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。 4． 加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5 min。 5． 12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。 6． 制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中， 其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進行電泳。 7． 當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒 DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。 1.3質(zhì)粒的擴增和純化 1． 用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg／ml) 培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。 2． 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200 轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。 3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素 溶液，終濃度為170 μ／ml)。37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)12-16h。 4. 將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。 5. 棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min 6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。 7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 8． 6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。 9． 將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6 倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃過夜，可 便核酸沉淀) 10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘 兼上清液流盡。 11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min， 充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。 12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。 13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離 心15 min，以沉淀高分子量的RNA。 14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室 溫靜置10min。 15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘 余上清液流盡。 16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min， 充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。 17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉 淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf 管中30min。 18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混勻，4 ℃ 12000 rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。 19．加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、 酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。 20．將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M 的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無水乙醇，充分混勻后于4 ℃放置30 min。 21．于4 ℃ 12