原位雜交原理及具體操作.doc

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原位雜交實(shí)驗(yàn)原理與方法 一、目的 本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 二、原理 原位雜交組化（簡(jiǎn)稱原位雜交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測(cè)核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來(lái)。 當(dāng)然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。 探針的種類按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。 探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。 原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。 菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）　　菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。 組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）　　組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。 （一）探針的選擇 根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因?yàn)樗灰淄高^細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。 在選用探針時(shí)經(jīng)常會(huì)受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫(kù)時(shí)，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時(shí)就可用寡核苷酸探針來(lái)代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測(cè)定6個(gè)以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動(dòng)物的同種基因克隆，因?yàn)槿祟惡蛣?dòng)物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動(dòng)物基因作探針來(lái)篩選人類基因克隆。對(duì)于基因核苷酸序列背景清楚而無(wú)法獲得克隆探針時(shí)，可采用PCR方法擴(kuò)增某段基因序列，并克隆人合適的質(zhì)粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡(jiǎn)便，無(wú)論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測(cè)方法，與探針雜交方法可作對(duì)比，可謂一舉兩得。 （二）探針的標(biāo)記方法 在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。 （三）探針的濃度 總的來(lái)說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。 （四）雜交率 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。 （五）雜交最適溫度 雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見表18-3。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃ 苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – （10或15℃） 非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – （30或35℃） （六）雜交的嚴(yán)格性 影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體?（七）雜交反應(yīng)時(shí)間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中 未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來(lái)說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。 Tm值25℃時(shí)雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。 （八）雜交促進(jìn)劑 惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。 硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90 000）。 小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。 （七）雜交反應(yīng)時(shí)間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來(lái)說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。 Tm值25℃時(shí)雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體 Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。 （八）雜交促進(jìn)劑 惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用?？傊蛩崞暇厶呛途垡叶家蚰苡糜诠滔嚯s交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。 三、主要器材 醫(yī)用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。 四、試劑 （二）? 試劑: ●? 2.5ml/L 的醋酸－－2.5ml/L醋酸酐: 三乙醇胺 13.2ml 氯化鈉 5g 濃鹽酸 4ml 醋酸酐（用前加） 2.5ml； ●? 20×SSC（pH7.0）： 氯化鈉 175.3g 枸櫞酸鈉 88.2g 雙蒸水定容至1L； ●? 100×Denhardt‘s: Ficoll 1g PVP 1g BSA 1g ddH2O 定容至50ml； ●? 雜交液：（50ml） 用量 終濃度 100%去離子甲酰胺 25ml 50% 100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10% 100×Denhard‘s 0.5ml 1 1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm 5M NaCl 3ml 0.3M 0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM 10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/ml ddH2O定容至25ml ●? 0.1M甘氨酸/PBS: 甘氨酸 7.5g Na2HPO4 30.8g NaH2PO4 2.8g NaCl 8.5g 溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲(chǔ)存； ●TSM1 （1000ml）： 1MTris-HCL（PH8.0） 100ml 5M NaCl 20ml 1M MgCl2 10ml ddH2O定容至1000ml； ●TSM2 （1000ml）： 1MTris-HCL（PH8.0） 100ml 5M NaCl 20ml 1M MgCl2 50ml ddH2O定容至1000ml； ●? 抗體稀釋液： 100ml BSA 1.0g Tris X-100 0.4ml 疊氮鈉 0.4g 0.05M PBS （PH7.2）調(diào)至100ml； ●? 0.05M PBS （PH7.2）：1000ml Na2HPO4 15.4g NaH2PO4 1.4g NaCl 4.25g ●去內(nèi)源性酶液（40ml）： 儲(chǔ)存液 用量 終濃度 10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5% 冰醋酸 10.0ml 25.0% 加0.05MPBS至40ml ●? 0.4% Triton-X 100 五、操作 （一）? 脫蠟，水化： 1、? 二甲苯10min 兩次 2、 無(wú)水乙醇3min 兩次 ３、95%乙醇3min 一次 ４、75%乙醇3min 一次 ５、50%乙醇2min 一次 ６、重蒸水2min 一次 ７、PBS洗滌5min （二）? 將組織芯片放入去內(nèi)源性酶液中浸泡30min；PBS洗滌5min （三） 0.1M甘氨酸去游離醛基 15min；0.4%tritonX-100 洗10min； （四） 用蛋白酶K與37℃孵育30min ，PBS振洗5min （五）? 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ； （六）? 滴加預(yù)雜交液42℃,30min；將RNA探針用預(yù)雜交液稀釋（1ng/ｕL~2ng/ｕL） （七）? 雜交 １、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加20~50ｕL的雜交液到組織芯片TMA上，42℃~44℃濕盒中過夜。 ２、在4×SSC中37℃洗滌15min ３、2×SSC，加入RNA酶（大致為10ｕg/ml）37℃中洗滌30min， ４、0.5×SSC,37℃洗滌15min （八）封閉 １、1%正常山羊血清孵育30min ２、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（1：500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min ３、TSM1洗； ４、TSM2洗； （九）顯色：用TSM2將NBT/BCIP按2：1稀釋進(jìn)行顯色；顯微鏡下掌握染色程度 （十）終止顯色：用水終止 （十一）脫水，透明，封固 １、85%乙醇脫水，2min ２、95%乙醇脫水5min ３、無(wú)水乙醇脫水15min ４、二甲苯20min ５、封片，鏡檢 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 點(diǎn)擊次數(shù)：236 發(fā)布時(shí)間：2010-2-1 8:13:09 ? 一、核酸分子雜交技術(shù) 1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，核酸自動(dòng)合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來(lái)源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點(diǎn)雜交法（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。 二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來(lái)及發(fā)展 原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測(cè)某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測(cè)的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時(shí)，Buongiorno– Nardelli和Amaldi, John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測(cè)了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。 由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報(bào)道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來(lái)識(shí)別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來(lái)定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。 Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來(lái)做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識(shí)別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對(duì)雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化DAN探針標(biāo)記簡(jiǎn)便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢(shì)。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測(cè)了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個(gè)部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素（圖20-1）。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡(jiǎn)單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個(gè)堿基才能標(biāo)記一個(gè)生物素，對(duì)于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。 近年來(lái)，地高辛（Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場(chǎng)。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間。同時(shí)在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測(cè)出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。 核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章）。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時(shí)制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動(dòng)子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補(bǔ)RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對(duì)照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。 DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號(hào)高。 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點(diǎn)是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來(lái)將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 Coulton（1991）建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（Affinity– Complex Labelled Probes, ACLP ）。因?yàn)椤胺牵?non）“在英文里是一個(gè)否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個(gè)標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個(gè)學(xué)科的研究帶來(lái)突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們?cè)谙鹿?jié)將詳加敘述。 三、位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 如前所述，由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visual－ization）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。 a）??????????? 固定 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對(duì)穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對(duì)于DNA的定位來(lái)說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對(duì)RNA保存所帶來(lái)的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對(duì)于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè)DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對(duì)組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。 b）?????????? 玻片和組織切片的處理 1．玻片的處理　　玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無(wú)塵存放 由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。 2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性　　此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無(wú)疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。蛋白酶K（ Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時(shí)間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1μg/ml（于0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中）,37℃孵育15～20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1N HCl 配）37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。 不少實(shí)驗(yàn)工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/L NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學(xué)者卻對(duì)此持有異議，根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。 3．減低背景染色　　和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 有的實(shí)驗(yàn)室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。 4．防止RNA酶的污染　　由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國(guó)外實(shí)驗(yàn)室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時(shí)空氣污染。在無(wú)高溫消毒的烤箱時(shí)，亦可用國(guó)內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)）。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。 c）??????????? 雜交（Hybridisation） 在ISHH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比較長(zhǎng)的，實(shí)驗(yàn)程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國(guó)內(nèi)向正華等采用無(wú)菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時(shí)可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無(wú)雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進(jìn)行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。 如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在雜交這一實(shí)驗(yàn)過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。 1．探針的濃度　　很難事先確定每一種實(shí)驗(yàn)探針的濃度，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)工作者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們?cè)诿庖呒?xì)胞化學(xué)試驗(yàn)中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。 探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)及所查閱文獻(xiàn)，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根據(jù)Heinz、Hofelt實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，對(duì)放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛） cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長(zhǎng)抑素cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/μl。 必須強(qiáng)調(diào)的是，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。 2．探針的長(zhǎng)度　　一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長(zhǎng)度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。據(jù)報(bào)告，長(zhǎng)500個(gè)堿基的探針，其雜交時(shí)間約需20h左右。200～500個(gè)堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過500個(gè)堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。 3．雜交的溫度和時(shí)間　　雜交的溫度也是雜交成功與否的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡(jiǎn)稱Tm）。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對(duì)保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報(bào)告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來(lái)調(diào)節(jié)Tm。Tm的計(jì)算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長(zhǎng)度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時(shí)間5～15min，（有作用報(bào)告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。 雜交的時(shí)間如過短會(huì)造成雜交不完全，而過長(zhǎng)則會(huì)增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時(shí)間在3h左右。Barns等（1987）報(bào)告用DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時(shí)間為2～4h。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應(yīng)時(shí)間定為16～20h，或?yàn)楹?jiǎn)便起見雜交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)告看無(wú)不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時(shí)間與核酸探針長(zhǎng)度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時(shí)間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定。有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楣饩€會(huì)促進(jìn)甲酰胺的電離作用。 4．雜交嚴(yán)格度（Hybridization stringency）　　雜交條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對(duì)（mismatch）雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來(lái)說，低嚴(yán)格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm-35℃至Tm–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度， Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴(yán)格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。麥躍行裝用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)檢測(cè)尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽(yáng)性率明顯低于非嚴(yán)格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。因?yàn)?，在?yán)格條件下只有同源性很強(qiáng)的DNA才被檢出，而在非嚴(yán)格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對(duì)病毒DNA分型需在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行，而低嚴(yán)格條件則可用于對(duì)病毒感染進(jìn)行篩選。 由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無(wú)疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進(jìn)行細(xì)胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實(shí)驗(yàn)證明，cRNA產(chǎn)生的信號(hào)比雙鏈cDNA要強(qiáng)。單鏈的RNA探針其雜交信號(hào)大于雙鏈的cDNA的約8倍。 5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）　　硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。 甲酰胺的主要作用在上節(jié)已提及，在調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。 d）?????????? 雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)程序中，這也是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。特別因?yàn)榇蠖鄶?shù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)是在低嚴(yán)格度條件下進(jìn)行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強(qiáng)了背景染色。RNA探針雜交時(shí)產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對(duì)RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測(cè)背景染色（非特異性標(biāo)記的多少）作為改善漂洗程序的指針。在35S標(biāo)記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35S標(biāo)記的核酸探針被氧化?？傊绾慰刂破吹膰?yán)格度從而達(dá)到理想的信/噪比無(wú)既定方案可循，必須從反復(fù)的實(shí)踐中取得經(jīng)驗(yàn)。 e）??????????? 顯示（Visualization） 顯示又可稱為檢測(cè)系統(tǒng)（Detection system）。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀（computer– assisted image analysis）檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。但利用ISHH做半定量測(cè)定必須注意嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時(shí)間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。 f）??????????? 對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷 和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，并非ISHH的任何陽(yáng)性信號(hào)都是特異性的，故必須同時(shí)有對(duì)照試驗(yàn)以證明其特異性。對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。從理論上講，對(duì)照試驗(yàn)設(shè)置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實(shí)是不可能的。因此，在上述對(duì)照試驗(yàn)中應(yīng)任選設(shè)至少3～4種用以證實(shí)ISHH結(jié)果的可靠性。在上述試驗(yàn)中，標(biāo)明*者為比較可靠的對(duì)照試驗(yàn)。①Northern 和 Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測(cè)抗體（蛋白質(zhì)）的特異性一樣，是比較可靠的。②如果具備相當(dāng)?shù)拿庖呓M化抗血清，可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。③預(yù)先將切片用 DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗(yàn)一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同義RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。④檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無(wú)標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。 ISHH的最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測(cè)定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)mR－NA，其敏感度可達(dá)到20個(gè)mRNA拷貝/每個(gè)細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時(shí)很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片 ，長(zhǎng)于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。正因?yàn)槿绱?，?duì)ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報(bào)告過的新發(fā)現(xiàn)。因?yàn)槿缜八?，影響ISHH實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒?yàn)取材后未及時(shí)的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進(jìn)入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟 一質(zhì)粒制備 1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增 1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌 1． 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、100 rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min， 離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌， 分裝(200 μ／tube)，-80 ℃保存。 2． 轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒 DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。 3． 輕輕搖勻，冰浴30 min。 4．42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。 5． 加入LB培養(yǎng)液(無(wú)氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育 60 min。 6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨芐青霉素50 mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。 1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落 1． 用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管 中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50μl 10mmol／L EDTA(pH 8.0)。 2． 加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩 3O秒。 3． 在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。 4． 加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5 min。 5． 12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。 6． 制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中， 其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。 7． 當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長(zhǎng)的2／3-3／4時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒 DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。 1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化 1． 用無(wú)菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg／ml) 培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。 2． 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200 轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。 3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素 溶液，終濃度為170 μ／ml)。37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)12-16h。 4. 將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。 5. 棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min 6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。 7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 8． 6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。 9． 將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6 倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃過夜，可 便核酸沉淀) 10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘 兼上清液流盡。 11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min， 充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。 12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。 13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離 心15 min，以沉淀高分子量的RNA。 14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室 溫靜置10min。 15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘 余上清液流盡。 16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min， 充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。 17.400μl含無(wú)DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉 淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf 管中30min。 18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混勻，4 ℃ 12000 rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。 19．加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、 酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。 20．將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M 的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無(wú)水乙醇，充分混勻后于4 ℃放置30 min。 21．于4 ℃ 12