分析化學(xué)高效液相色譜-HPLC.ppt

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第8章高效液相色譜法HPLCHighPerformanceLiquidChromatography 特點(diǎn) 高壓 高效 高速高沸點(diǎn) 熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法 8 1高效液相色譜儀四大部分組成 溶劑輸送系統(tǒng) 貯液器 高壓泵 進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣閥等 分離系統(tǒng) 色譜柱等 檢測(cè)記錄系統(tǒng) 檢測(cè)器 記錄儀等 1 高壓輸液泵主要部件之一 壓力 150 350 105Pa為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相 10 m 液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí) 將產(chǎn)生很高的壓力 因此高壓 高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一應(yīng)具有壓力平穩(wěn) 脈沖小 流量穩(wěn)定可調(diào) 耐腐蝕等特性 2 進(jìn)樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置 3 分離系統(tǒng)包括色譜柱 恒溫器和連接管等部件 色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成 其內(nèi)徑為2 6mm 柱長(zhǎng)為10 50cm 柱形多為直形 內(nèi)部充滿3 10mm高效微粒固定相 柱溫一般為室溫或接近室溫勻漿法填充柱 將填料制成懸浮液 在高壓泵的作用下壓入裝有洗脫液的色譜柱 理論塔板數(shù)可達(dá)8萬(wàn) 米 4 檢測(cè)器要求 靈敏度高 噪音低 線形范圍寬 響應(yīng)快 對(duì)溫度和流速的變化不敏感兩種類(lèi)型溶質(zhì)型檢測(cè)器 僅對(duì)被分離組分的物理或理化性質(zhì)響應(yīng)如紫外 熒光 二極管陣列 電化學(xué)檢測(cè)器總體型檢測(cè)器 對(duì)試樣和洗脫劑均有響應(yīng)如示差折光 介電常數(shù)檢測(cè)器 UV檢測(cè)器最常用 占70 池體積 1 10 L光程常 2 10mm波長(zhǎng) 254nm窗口 石英 折光計(jì)由測(cè)量池和參比池組成 示差折光計(jì) 因n f T 故需精密恒溫 0 001 靈敏度低于UV檢測(cè)器 且不適合于梯度洗脫用于無(wú)紫外吸收的化合物 如糖類(lèi) 伏安計(jì) 安培計(jì) 庫(kù)侖計(jì)和電導(dǎo)計(jì)等 首選安培計(jì)可用于在工作電極的工作電壓范圍能還原或氧化的物質(zhì)電極表面易中毒 5 梯度洗脫分配比k相差很大的復(fù)雜混合物用一種溶劑很難完全分開(kāi)可采用兩種或兩種以上極性不同但可以相互溶解的溶劑 隨時(shí)間按一定比例混合 連續(xù)改變洗脫劑的極性 離子強(qiáng)度或pH 以便改變被測(cè)組分的相對(duì)保留值 達(dá)到提高分離效果 縮短分析時(shí)間的目的 梯度洗脫裝置分為兩類(lèi) 外梯度裝置 又稱低壓梯度 流動(dòng)相在常溫常壓下混合 用高壓泵壓至柱系統(tǒng) 僅需一臺(tái)泵即可 內(nèi)梯度裝置 又稱高壓梯度 將兩種溶劑分別用泵增壓后 按電器部件設(shè)置的程序 注入梯度混合室混合 再輸至柱系統(tǒng) 梯度洗脫的實(shí)質(zhì) 通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度 調(diào)整混合樣品中各組分的k值 使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱 它在LC中所起的作用相當(dāng)于GC中的程序升溫 通過(guò)改變?nèi)苜|(zhì)的極性 pH值和離子強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)溶質(zhì)的k值 在GC中借程序調(diào)節(jié)溫度改變k值 8 2幾種常見(jiàn)的液相色譜形式 1 液液色譜 分配色譜 1941年Martin發(fā)明 用吸著在硅膠上的水作為固定相 用氯仿為流動(dòng)相應(yīng)用范圍 最常用方法 相對(duì)分子量小于3000 不帶電的極性化合物 分離原理固定液通過(guò)分子間的親和力或化學(xué)鍵合力附著在粒度很細(xì)的惰性載體表面上 被分離的組分溶解在流動(dòng)相中 并按其分配系數(shù)K在兩相之間進(jìn)行分配K不同導(dǎo)致遷移速度不同 從而使不同組分得到分離 固定液的流失樣品一定要在兩相中均能溶解才能分 分離 因而兩相在某種程度上互溶長(zhǎng)時(shí)間使用將導(dǎo)致固定液流失 不利分離防止固定液流失的方法 防止固定液流失的方法方法一 抑制柱在分析柱之前 加一根與分析柱有相同固定液的預(yù)處理柱 在試樣進(jìn)樣前 讓流動(dòng)相預(yù)先通過(guò)預(yù)處理柱 以便使流動(dòng)相預(yù)先被固定液飽和 而使分析柱的固定液不受損失缺點(diǎn) 麻煩不能采用梯度洗脫技術(shù) 方法二 化學(xué)鍵合固定相將固定液以Si O R鍵合在SiO2載體表面 反相色譜固定液為非極性洗脫液為極性 如水 常用方法 75 C18柱 十八烷基化的SiO2填充柱 為標(biāo)準(zhǔn)色譜柱應(yīng)用 醇類(lèi) 芳香族 蒽醌素 抗菌素 低聚物 甾族化合物 維生素等極性不太大的組分 正相與反相液液分配色譜正相色譜 固定液為極性 洗脫液為非極性常用于分離極性化合物 極性大的組分保留時(shí)間長(zhǎng) 后出峰固定液 水 甘油 氧化二丙腈 極性 流動(dòng)相 己烷 苯 氯仿 非極性 2 液固色譜 吸附色譜 分離原理固定相為固體吸附劑 被分離組分在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的固體相 極性的硅膠 Al2O3 MgSiO3等硅膠柱的柱效高 容量大 最常見(jiàn)流動(dòng)相 相似相用 如極性大的組分選用極性強(qiáng)的洗脫劑 否則不易被洗脫 洗脫液的極性可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)e表征 e越大 極性越強(qiáng)應(yīng)用分離極性不同的化學(xué)物 同分異構(gòu)體不適用同系物的分離 3 離子交換色譜1975年H Small發(fā)明 現(xiàn)為發(fā)展最快的分支分離原理 離子交換樹(shù)脂為固定相 試樣中的離子與離子交換樹(shù)脂上的離子發(fā)生離子交換反應(yīng) 平衡常數(shù)K NR4 X Cl NR4 Cl X K越大 溶質(zhì)的離子與離子交換劑的相互作用愈大 保留值愈大磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 陽(yáng)離子的保留值大小 一價(jià)陽(yáng)離子 Cs Rb K NH4 Na H Li 二價(jià)陽(yáng)離子 Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Cd2 Cu2 Zn2 Mg2 強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂 保留值大小順序 PO43 SO42 C2O42 I HSO4 NO3 CN NO2 Cl HCOO OH F CH3COO 流動(dòng)相H2O H2O 乙醇 H2O pH緩沖劑應(yīng)用無(wú)機(jī)離子 有機(jī)和生物酸堿 如氨基酸 核酸 蛋白質(zhì)等 4 尺寸排阻色譜法sizeexclusionchromatographySEC凝膠過(guò)濾色譜 水為流動(dòng)相gelfiltrationchromatgraphyGFC凝膠滲透色譜 非水流動(dòng)相gelpermeationchromatographyGPC1959年P(guān)orath和Flodin發(fā)明分離原理 試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離 GPC流動(dòng)相 水 四氫呋喃應(yīng)用 聚合物的分級(jí)生物聚合體 蛋白質(zhì) 核酸 低聚糖 多肽 的分離 8 3色譜分離方法的選擇 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度 極性和穩(wěn)定程度化學(xué)結(jié)構(gòu)熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍 1 流動(dòng)相種類(lèi)與極性 液相色譜的流動(dòng)相又稱為 淋洗液 洗脫劑它可顯著改變組分分離狀況選擇流動(dòng)相在液相色譜中特別重要 按組成可分為 單組分和多組分 按極性可分為 極性 弱極性 非極性 按使用方式可分為 固定組成淋洗和梯度淋洗常用溶劑 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性 以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 1 盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相 防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加 2 避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子 如使固定液溶解流失 酸性溶劑破壞氧化硅固定相等 3 試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度 防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積 4 流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求 當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí) 流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收 8 4應(yīng)用實(shí)例 方針 要解決一個(gè)分析問(wèn)題 先試反相色譜法C18標(biāo)準(zhǔn)柱 改變流動(dòng)相調(diào)節(jié)k 保留行為 和 選擇性 反相色譜法優(yōu)點(diǎn) a 色譜柱平衡快 適宜梯度洗脫b 流動(dòng)相主體為水 甲醇為有機(jī)改性劑 價(jià)廉易純化c tR隨溶質(zhì)的疏水性增加而增大 可預(yù)計(jì)出峰順序d 改變基本流動(dòng)相的pH 添加鹽緩沖劑 金屬螯和物 手性試劑等 可分離非電離 弱電離 金屬離子 手性異構(gòu)體 多環(huán)芳香烴的分析 反相分配色譜法 固定相 十八烷基SiO2 薄殼型流動(dòng)相 20 CH3OH H2O 100 CH3OH 2 min流速 1mL min柱溫 50 紫外光度檢測(cè)器 254nm 鎮(zhèn)痛劑的分析 陰離子交換色譜法 固定相 強(qiáng)陰離子交換劑流動(dòng)相 pH9 2 0 005mol LNaNO3水溶液流速 1 2mL min紫外光度檢測(cè)器 8 4進(jìn)展柱微型化高柱效高分辨率高選擇性快速分離 HighefficiencypCECseparation 500 000plates m of14explosivesin7min Seeref C Baliey C Yan Anal Chem 1998 70 3275 聯(lián)用技術(shù) HPLC AASHPLC AFSHPLC ICP AESHPLC UV VisHPLC ICP MSHPLC IR HPLC聯(lián)用技術(shù)在元素的化學(xué)形態(tài)分析中的應(yīng)用 元素的化學(xué)形態(tài) 元素的生理學(xué)毒性大小對(duì)環(huán)境的污染程度在生命過(guò)程中所起的作用如砷化合物毒性大小砷酸 As V 亞砷酸 AS III 甲砷酸 二甲砷酸它們對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的半數(shù)致死量分別為 1 5 5 50 500mg kg而砷甜菜堿和砷膽堿 AsC 并未發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠有毒僅僅知道元素的總量是不夠的 而需要了解它們的形態(tài) 作業(yè) 試從分離的基本原理 基本理論 檢測(cè)方式以及應(yīng)用范圍等多方面 對(duì)液相色譜與氣相色譜進(jìn)行全面比較 溫度 10 30 相對(duì)濕度 80 最好是恒溫 恒濕遠(yuǎn)離高電磁干擾 高振動(dòng)設(shè)備 有良好的通風(fēng)設(shè)施 8 5HPLC的日常維護(hù)與保養(yǎng) HPLC的日常操作條件 工作原理 手柄位在Load位置時(shí) 用微量進(jìn)樣針將樣品從進(jìn)樣孔注射進(jìn)入定量環(huán)中 定量環(huán)充滿后 多余樣品從放空孔排出 手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至Inject位置時(shí) 閥與液相流路接通 由泵輸送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán) 將樣品進(jìn)入色譜柱中進(jìn)行分析 1 六通閥進(jìn)樣器的使用及保養(yǎng) 手柄轉(zhuǎn)動(dòng)要快速 手柄處于Load和Inject之間時(shí) 由于暫時(shí)堵住了流路 流路中壓力驟增 再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位 過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞 應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥 不能在中途停留 部分裝液法 進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75 要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確 相同完全裝液法 進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍將定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液完全置換樣品 達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性 兩種裝液方法 樣品必須過(guò)濾 用0 45 0 22 m的濾膜過(guò)濾防止微粒阻塞進(jìn)樣閥減少對(duì)進(jìn)樣閥的磨損進(jìn)樣結(jié)束沖洗進(jìn)樣器 用不含鹽的稀釋劑 水或不含鹽的流動(dòng)相沖洗 在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗再用無(wú)纖維紙擦凈注射器針頭的外側(cè) 2 泵的保養(yǎng) 使用流動(dòng)相盡量要清潔進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡每次分析結(jié)束后 要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口 防止樣品的交叉污染 在任何情況下不能碰撞 彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)色譜柱當(dāng)色譜柱和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí) 閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動(dòng)相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)樣樣品要提純 嚴(yán)格控制進(jìn)樣量 2 色譜柱的保養(yǎng) 每天分析工作結(jié)束后 要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天分析測(cè)定結(jié)束后 都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱若分析柱長(zhǎng)期不使用 應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉 3 紫外燈的保養(yǎng) 在分析前應(yīng)先平衡色譜柱 差不多后 再開(kāi)檢測(cè)器 在分析完成后馬上關(guān)閉檢測(cè)器