腸道病毒感染病例標(biāo)本的處理、細(xì)胞接種和觀察

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1、腸道病毒感染病例標(biāo)本的處理、細(xì)胞接種和觀察湖南CDC脊灰實(shí)驗(yàn)室 張帆2008.5.8 人腸道病毒簡(jiǎn)介和分類(lèi) 小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成員，主要在腸道內(nèi)復(fù)制, 但可感染各個(gè)系統(tǒng)和器官。 單正鏈的無(wú)包膜RNA病毒，RNA有感染性。 小球形病毒（ 30 nm）， 20面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。 衣殼有VP1-VP4四種蛋白，VP1-VP3分布在表面， VP4與內(nèi)部RNA結(jié)合。 與鼻病毒不同的是，它們?cè)谒嵝原h(huán)境中穩(wěn)定。 在胞漿增殖，有明顯CPE，破胞釋放。 引起多種疾?。郝楸孕约膊　o(wú)菌性腦膜炎、心肌損傷、手足口病，結(jié)膜炎，皮疹等。 電鏡下的病毒形態(tài) 病毒特性腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下

2、生存與傳播，對(duì)乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感，75%酒精和5%來(lái)蘇亦不能將其滅活，但對(duì)紫外線(xiàn)及干燥敏感。各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能滅活病毒。病毒在50 可被迅速滅活，但1mol濃度二價(jià)陽(yáng)離子環(huán)境可提高病毒對(duì)熱滅活的抵抗力，病毒在4 可存活1年，在- 20 可長(zhǎng)期保存，在外環(huán)境中病毒可長(zhǎng)期存活。 人腸道病毒傳播方式 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便 呼吸道傳播: 空氣飛沫 接觸傳播:一般人腸道病毒在呼吸道飛沫中可存留約一至三周，而經(jīng)胃腸道的糞便排泄可達(dá)到二至三個(gè)月以上。 病毒的組織培養(yǎng)所有已知的人腸道病毒都可以在組織細(xì)胞培養(yǎng)或乳鼠中繁殖；大部分血清型可以在1種以上的人源傳代細(xì)胞中生長(zhǎng)

3、；但是沒(méi)有哪一種細(xì)胞可以支持所有的人腸道病毒生長(zhǎng)；研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒）只能在乳鼠中繁殖。 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法臨床懷疑：夏秋季，嬰幼兒、皮疹、接觸、腦膜炎實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法包括： 1)血清抗體的變化： 血清抗體4倍變化 2)病毒培養(yǎng)及鑒定：理想（金標(biāo)準(zhǔn)）但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且部分腸病毒型別不易培養(yǎng) 3)組織病理切片檢查 4)分子生物學(xué)檢測(cè)，RT-PCR，RealTime PCR，分子雜交等 5)快速抗原檢測(cè)：芯片 病毒分離 診斷腸道病毒感染的最主要手段，也是金標(biāo)準(zhǔn)。 柯薩奇B組病毒和?？刹《究梢院苋菀椎卦诩?xì)胞培養(yǎng)上生長(zhǎng)。適合的標(biāo)本有咽拭子、糞便標(biāo)本，鼻拭子等，也可以從腦脊液中分離到病毒。

4、 一些柯薩奇A組病毒不容易通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行分離，可以通過(guò)乳鼠進(jìn)行分離，但是操作比較復(fù)雜，一般實(shí)驗(yàn)室不常規(guī)使用這種方法。分子生物學(xué)的方法更適合這種病毒的診斷。 血清學(xué)方法 自從細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)可以用做病毒分離后，血清學(xué)方法已經(jīng)不經(jīng)常使用了。 中和實(shí)驗(yàn)，但是非常繁瑣，因此，一般也不做這方面的實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞培養(yǎng)分離方法 1990年以前，大都都采用Vero、GMK細(xì)胞分離； 1994年以后，人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞（Caco-2）取代了Vero細(xì)胞； 1998年人們開(kāi)始用人肺系細(xì)胞（MRC-5）分離CoxA16等毒株，其敏感性與Caco-2細(xì)胞相當(dāng)。 目前，大都使用人源細(xì)胞如人喉癌上皮細(xì)胞（HEp-2）、人橫紋肌肉

5、瘤細(xì)胞（RD）用于病毒分離。RD細(xì)胞支持大多數(shù)柯薩奇A組病毒復(fù)制。 對(duì)一些不能在細(xì)胞上生長(zhǎng)的病毒，可用乳鼠接種分離病毒。但?？刹《疽话悴灰鹑槭蟀l(fā)病。 標(biāo)本的采集（一）糞便標(biāo)本：采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量58g/份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專(zhuān)用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋

6、緊管蓋并密封，以防干燥。4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（三）血清標(biāo)本：采集急性期（發(fā)病03d）和恢復(fù)期（發(fā)病1430d）雙份配對(duì)血清用于抗體檢測(cè)。靜脈采集35ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于20以下冰箱中冷凍保存。 （四）皰疹液：在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒具有很高的診斷價(jià)值，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周?chē)钠つw進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，

7、旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（五）腦脊液標(biāo)本：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原和抗體檢測(cè)，從腦脊液中分離病毒也具有很高的診斷價(jià)值。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.02.0ml。采集后立即裝入無(wú)菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（六）病例密切接觸者的標(biāo)本采集：選擇典型病例所在的托幼機(jī)構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對(duì)象，采集單份糞便和血清標(biāo)本。（七）健康對(duì)照的標(biāo)本采集：選擇患兒發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近

8、無(wú)病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)。采集5歲以下的兒童單份糞 便和血清標(biāo)本。 手足口病引起手足口病的主要為小RNA病毒科、腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus) A組16、4、5、7、9、10 型， B組2、5型；?？刹《荆‥CHO viruses）和腸道病毒71型（EV 71），其中以EV 71及Cox Al6型最為常見(jiàn)。 感染后引起 發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡傳染性極高病程約1周 手足口病發(fā)病機(jī)理 致病性與柯薩奇病毒類(lèi)似，呈多樣性，主要是無(wú)菌性腦炎、類(lèi)脊髓灰質(zhì)炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 感染后對(duì)同型病毒可產(chǎn)生持久免疫 診斷困難，對(duì)可疑患者可采糞便

9、、腦脊液等標(biāo)本做病毒分離和中和試驗(yàn) 尚無(wú)疫苗，預(yù)防以隔離為主 用于病毒分離和鑒定標(biāo)本的種類(lèi)用于HFMD病毒分離的標(biāo)本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本。用于AHC病毒分離的標(biāo)本主要是結(jié)膜拭子或結(jié)膜刮取物。用于HFMD病毒分離的標(biāo)本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本。用于AHC病毒分離的標(biāo)本主要是結(jié)膜拭子或結(jié)膜刮取物。注意：雖然都是腸道病毒，但不同的病例采樣的部位不同，不同的腸道病毒采用的組織培養(yǎng)也是不同的。 標(biāo)本的處理1、糞便標(biāo)本的處理 A）所需試劑和耗材： 15ml或50ml耐氯仿離心管； 1ml 或5ml吸氯仿用的玻璃

10、吸管； 5ml和10ml吸管；木制便簽；外螺旋蓋的凍存管（5ml）；直徑大約23mm的玻璃珠；混有抗生素的完全PBS；完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素500單位/ml，鏈霉素為500g/ ml 氯仿（以乙醇作為穩(wěn)定劑）。 B)糞便標(biāo)本處理操作步驟：生物安全柜中操作將離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào);每一管中加入10ml 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿;在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確認(rèn)原始標(biāo)本號(hào)與離心管上標(biāo)記的編號(hào)一致），剩余原始標(biāo)本最好留在原容器中并凍存于-20。擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20分鐘。將離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào);用冷凍離心機(jī)離心1500g*（約

11、3500轉(zhuǎn)）20分鐘。將每一份標(biāo)本上清吸入2個(gè)有外螺旋蓋的標(biāo)記好的凍存管中（若上清不清澈，應(yīng)再用氯仿處理一次）。將一管糞便懸液凍存于-20作為備份，另一管存于4-8以備接種（用于當(dāng)天接種細(xì)胞）。 2、腦脊液標(biāo)本的處理-通常直接用于病毒分離。 3、皰疹液標(biāo)本的處理-通常直接用于病毒分離。 4、咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在保存液中充分?jǐn)噭?dòng)（40下左右），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，然后4條件下10000rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，用濾器過(guò)濾除菌。 5、眼結(jié)膜拭子標(biāo)本的處理同咽拭子標(biāo)本的處理。 病毒分離標(biāo)本接種和觀察 A）所需試劑和耗材：細(xì)胞培養(yǎng)管培養(yǎng)的

12、RD細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞；維持液（MM）； 1ml和5ml的一次性塑料移液管 B）操作步驟：顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后3d左右形成； 倒掉（GM），換上11.2ml（MM）；每一份標(biāo)本同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記細(xì)胞管（包括標(biāo)本編號(hào)、日期、傳代數(shù)）；每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；每支試管接種0.2ml標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36（對(duì)于AHC標(biāo)本病毒分離，尤其是EV70，強(qiáng)烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為35）；使用倒置顯微鏡逐日觀察并如實(shí)記錄細(xì)胞培養(yǎng)管的變化，至少一周。包括記錄： CPE（1+4+）： （1+，25%; 2+,

13、25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100%）；細(xì)胞毒性反應(yīng);細(xì)胞老化或污染.關(guān)于腸道病毒CPE：即有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)， 表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加， 折光性增強(qiáng)至細(xì)胞從管壁脫落。 如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)至觀察到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+ CPE），凍存于-20以備二次傳代。同一病例二次傳代的病毒分離物其滴度高于一代病毒，二代分離物可放到一起用于進(jìn)一步鑒定；第1代培養(yǎng)見(jiàn)可疑CPE至觀察滿(mǎn)7天后再繼續(xù)凍融傳代，待CPE穩(wěn)定出現(xiàn)后-20或-70凍存以備進(jìn)一步鑒定；如果7天之后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，需盲傳2代繼續(xù)觀察。（注意：同一病例標(biāo)本的不同細(xì)胞的培養(yǎng)

14、物應(yīng)單獨(dú)傳代）；盲傳2代后仍不出現(xiàn)CPE，則判定為陰性；注意：盲傳不可超過(guò)3代。 相關(guān)概念 A：毒性反應(yīng)：如果在接種后12d內(nèi)細(xì)胞快速地凋亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。將這些已接種標(biāo)本的試管凍存于-20，融化后取0.2ml接種到同一類(lèi)型細(xì)胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應(yīng)，可重取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。 B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無(wú)法確定或根本無(wú)法出現(xiàn)。重新取原始標(biāo)本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。 C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞

15、對(duì)照也出現(xiàn)了病變?？蓪⒁呀臃N標(biāo)本試管于-20凍存，融化后取0.2ml再接種到同一類(lèi)型健康單層細(xì)胞，再觀察7天。若盲傳2代仍未產(chǎn)生CPE，即可確認(rèn)此標(biāo)本為陰性。 HFMD結(jié)果解釋 1.RD細(xì)胞支持CA16和EV71的復(fù)制，但一般要經(jīng)過(guò)2次以上傳代才出現(xiàn)明顯病變，若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒(如COXB及ECHO）分離率。 2.從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等分離出病毒有診斷價(jià)值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。需滿(mǎn)足以下2 個(gè)要求。才有診斷的參考價(jià)值： 1）從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復(fù)分離到同一型病毒; 2）病毒分離率遠(yuǎn)高于正常人群。

16、 3.相同滴度的CA16和EV71在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的速度不同，EV71的生長(zhǎng)速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CA16早。兩者在HEp-2細(xì)胞中均不繁殖。 需要注意的兩個(gè)問(wèn)題 A額外的傳代：在進(jìn)行HFMD/AHC標(biāo)本病毒分離過(guò)程中，為防止從病例中分離出的標(biāo)本中有人腸道病毒漏檢情況，此時(shí)接種過(guò)病毒的細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)凍化后，可重新接種到新的健康單層細(xì)胞上以釋放存在的病毒。在標(biāo)本培養(yǎng)沒(méi)有產(chǎn)生CPE的情況下，特別是發(fā)生毒性反應(yīng)或污染時(shí)，使用新的健康細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生可識(shí)別CPE。但病毒傳代不要超過(guò)3次，因?yàn)槊恳淮尾僮鞫紩?huì)增加病毒交叉污染的機(jī)會(huì)，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。 B標(biāo)本吸附到

17、單層細(xì)胞上方法：先將細(xì)胞生長(zhǎng)液倒掉，用無(wú)菌PBS清洗單層健康細(xì)胞，再接種0.2ml標(biāo)本懸液使其先吸附到單層細(xì)胞上。吸附過(guò)程(1h)中輕搖并偶爾旋轉(zhuǎn)使接種液分布均勻，以防止周?chē)鷮蛹?xì)胞干燥。然后再加入1ml的維持液。優(yōu)點(diǎn)：可檢測(cè)到稍低濃度的病毒/ 減少標(biāo)本的毒性反應(yīng)/可使CPE提前出現(xiàn)。缺點(diǎn)：增加病毒（和可能的細(xì)菌）交叉污染的機(jī)會(huì)，因?yàn)榇朔椒ㄔ黾恿碎_(kāi)蓋/關(guān)蓋的次數(shù)。 注意：當(dāng)使用含有很高滴度病毒標(biāo)本時(shí)交叉污染的可能性更大，所以此方法不可用于接種病毒分離物。 正常的RD細(xì)胞(人胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞，形態(tài)學(xué)為紡錘形及巨型多核細(xì)胞） EV71T和CA16出現(xiàn)的CPE（接種后第7天） 正常的Hep-2細(xì)胞（人喉上皮癌細(xì)胞，形態(tài)學(xué)為上皮樣細(xì)胞） CA24和EV70出現(xiàn)的CPE（接種后第7天）