生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔.doc

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生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔 王 營(yíng)，傅 強(qiáng)，趙仁淹(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科，上海市 200233) 文章亮點(diǎn)： 1 理想的組織工程尿道替代物應(yīng)具有良好的力學(xué)特性，靜態(tài)培養(yǎng)的尿路肌性管腔強(qiáng)度不佳。 2文章的創(chuàng)新性在于應(yīng)用生物反應(yīng)器體外動(dòng)態(tài)構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔，應(yīng)用生物反應(yīng)器引入力學(xué)因素明顯改善了組織工程化尿路肌性管腔的組織結(jié)構(gòu)和膠原分布，為應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)尿道缺損提供了理想的組織替代來(lái)源。 關(guān)鍵詞： 組織構(gòu)建；組織工程；脂肪干細(xì)胞；生物反應(yīng)器；聚羥基乙酸；動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)；靜態(tài)培養(yǎng)；國(guó)家自然科學(xué)基金 主題詞： 干細(xì)胞；組織工程；生物反應(yīng)器，尿道；流式細(xì)胞術(shù) 基金資助： 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30973016)；上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(09ZR1424100) 摘要 背景：理想的組織工程尿道替代物應(yīng)具有良好的力學(xué)特性，足以承受長(zhǎng)時(shí)間的尿液排泄沖擊，而靜態(tài)培養(yǎng)的尿路肌性管腔強(qiáng)度不佳。已有研究表明，力學(xué)刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。 目的：探討生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔的可行性。 方法：酶消化法獲取脂肪干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，將脂肪干細(xì)胞接種于聚羥基乙酸上，形成細(xì)胞-材料復(fù)合物，體外培養(yǎng)1周后，將其置于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)；對(duì)照組為靜態(tài)培養(yǎng)，先采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，而后用成肌誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)4周，行大體觀察及組織學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果與結(jié)論：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD90，CD44，CD105表達(dá)率分別為99.42%，98.12%，93.27%；CD34，CD45表達(dá)率分別為4.92%和0.38%，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的肌性管腔色澤明亮，管腔圓潤(rùn)，免疫組化染色顯示，細(xì)胞材料復(fù)合物在誘導(dǎo)4周后，細(xì)胞表達(dá)結(jié)蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性，細(xì)胞材料復(fù)合物膠原成分多。對(duì)照組構(gòu)建的肌性管腔色澤暗淡，管腔輕度塌陷，細(xì)胞材料復(fù)合物膠原成分較少。提示脂肪干細(xì)胞復(fù)合聚羥基乙酸材料在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可構(gòu)建具有良好結(jié)構(gòu)的尿路肌性管腔。 王營(yíng)，傅強(qiáng)，趙仁淹. 生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔[J].中國(guó)組織工程研究，2014，18(2):165-170. Constructing a tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor Wang Ying, Fu Qiang, Zhao Ren-yan (Department of Urology, the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China) 王營(yíng)，男，1987年生，山東省淄博市人，2013年上海交通大學(xué)畢業(yè)，碩士，醫(yī)師，主要從事泌尿外科組織工程與干細(xì)胞技術(shù)研究。 通訊作者：傅強(qiáng)，博士，主任醫(yī)師，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科，上海市 200233 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.02.001 [http://www.crter.org] 中圖分類號(hào):R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):2095-4344 (2014)02-00165-06 稿件接受：2013-11-06 Wang Ying, Master, Physician, Department of Urology, the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China Corresponding author: Fu Qiang, M.D., Chief physician, Department of Urology, the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China Accepted: 2013-11-06 Abstract BACKGROUND: Ideal tissue-engineered urinary tract should have good mechanical properties to bear long-term attack of urine and excretion. Muscular conduit of urinary tract in static culture exerts poor strength. It is reported that mechanical stimuli promote cellular growth and secretion of extracellular matrix. OBJECTIVE: To investigate the feasibility of constructing tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor. METHODS: Adipose-derived stem cells were harvested by collagen enzyme method. After series culture and expansion in vitro, flow cytometric analysis was carried out to detect the immunophenotypes of adipose-derived stem cells. Then the cell-polyglycolic acid complex was constructed by seeding adipose-derived stem cells on polyglycolic acid fibers. After 1 week of in vitro culture, cell-polyglycolic acid complex was cultured in a bioreactor. The experimental group was subjected to pulsatile stimuli, while the control group was cultured in static state. After 3 weeks of in vitro culture in basic medium, the cell-polyglycolic acid complex was induced in the induced culture medium for 4 weeks, and then engineered tissue was examined both grossly and histologically. RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry demonstrated that the adipose-derived stem cells expressed CD90 (99.42%), CD44 (98.12%) and CD105 (93.27%), but not CD34 (4.92%) or CD45 (0.38%). In the experimental group, tissue-engineered muscular conduit of urinary tract appeared bright color with a round lumen. Immunohistochemical staining showed that after cell-polyglycolic acid complex was induced for 4 weeks, the cells expressed desmin and α-smooth muscle actin. More collagen was found in the complex. In contrast, the control group appeared pale surface and its lumen collapsed slightly. Less collagen was in the complex. Tissue-engineered muscular conduit of urinary tract with good structure can be constructed in a bioreactor. Subject headings: stem cells; tissue engineering; bioreactor, urinary tract; flow cytometry Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30973016; Shanghai Natural Science Foundation, No. 09ZR1424100 Wang Y, Fu Q, Zhao RY. Constructing a tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):165-170. 0 引言 Introduction 先天及后天性的原因?qū)е碌哪虻廊睋p是泌尿外科較為常見的疾病，需要進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)與重建。單純的尿道狹窄切除后端端吻合僅對(duì)距離較短的尿道缺損治療效果較好，而對(duì)于復(fù)雜的長(zhǎng)段尿道缺損，往往需要相應(yīng)的替代材料進(jìn)行修復(fù)重建，目前臨床上常采用生殖器皮瓣、膀胱黏膜、口腔黏膜等多種替代組織進(jìn)行尿道重建治 療[1-5]，但對(duì)于多次尿道修復(fù)治療失敗的患者，由于其局部可替代尿道的組織已被利用，因此治療較為棘手。組織工程技術(shù)的運(yùn)用將為解決這一難題提供有效的方法，組織工程尿道修復(fù)重建的主要內(nèi)容包括3個(gè)方面：種子細(xì)胞、生物支架材料和組織工程尿道的構(gòu)建。文章選用脂肪干細(xì)胞作為組織工程尿路肌性管腔的種子細(xì)胞來(lái)源，利用脂肪干細(xì)胞的多分化潛能，同時(shí)應(yīng)用人工合成的可降解高分子生物材料聚羥基乙酸作為脂肪干細(xì)胞的復(fù)合支架，探討在生物反應(yīng)器內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔，為組織工程技術(shù)在尿道修復(fù)重建中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 1 材料和方法 Materials and methods 設(shè)計(jì)：細(xì)胞材料生物學(xué)水平，對(duì)比觀察動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 時(shí)間及地點(diǎn)：于2011年6月至2012年6月在上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。 材料： 生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔實(shí)驗(yàn)的主要試劑和儀器 來(lái)源 試劑和儀器 SAFC Biosciences，美國(guó) Hyclone，美國(guó) Gibco，美國(guó) 上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 Sigma，美國(guó) Gibco，美國(guó) eBioscience，美國(guó) BD，美國(guó) Abcam，英國(guó) Sigma，美國(guó) Dako，美國(guó) Nikon，日本 Philips，荷蘭 胎牛血清 低糖DMEM培養(yǎng)液 0.25%胰酶 PBS溶液 5-氮雜胞苷 馬血清 PE-CD90,FITC-CD44,PE-CD34, APC-CD45 FITC-CD105 一抗：兔抗鼠結(jié)蛋白、兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 二抗：FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗 EnVision TM Peroxidase Rabbit 倒置相差顯微鏡 XL-30 ESEM型掃描電鏡 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：畢格犬6只，6月齡，體質(zhì)量8 kg，雄性，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)許可證號(hào)SYXK(滬)2011-0128。 聚羥基乙酸材料：購(gòu)自美國(guó)Albany International Research Company Inc公司。聚羥基乙酸材料是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的線性脂肪族聚酯，脂肪族結(jié)構(gòu)單元通過(guò)易水解的酯鍵連接形成聚酯的主鏈，而生物體內(nèi)酸、堿或酶能夠促進(jìn)生物可降解聚酯的水解，最終形成CO2和H2O，生物相容性良好。 實(shí)驗(yàn)方法： 脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)[6]：無(wú)菌條件下取犬一側(cè)腹股溝脂肪組織，將脂肪組織先后置于氯霉素與PBS中反復(fù)沖洗，剪刀剪碎并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃震蕩消化1 h，200目濾網(wǎng)濾除組織碎片，收集濾液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 流式分析：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代脂肪干細(xì)胞作流式細(xì)胞檢測(cè)，酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1109 L-1，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞相關(guān)抗原CD90，CD44，CD105以及CD34，CD45，分析干細(xì)胞相關(guān)抗原的表達(dá)率，排除造血細(xì)胞的污染。 脂肪干細(xì)胞與材料復(fù)合物的復(fù)合：收集第1代脂肪干細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)為2107，離心棄去上清，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，均勻接種于卷在硅膠管上的2 cm1 cm1 mm未編織聚羥基乙酸上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，每15 min旋轉(zhuǎn)聚羥基乙酸材料90，4 h后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，每天更換培養(yǎng)液，1周后光鏡、掃描電鏡下觀察細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。 生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)：生物反應(yīng)器包括反應(yīng)槽、集液瓶、蠕動(dòng)泵，醫(yī)用硅膠管，經(jīng)連接組裝后置于培養(yǎng)箱內(nèi)，使用前高壓蒸汽消毒，整個(gè)回路提供細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)的場(chǎng)所以及實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行力學(xué)刺激。體外培養(yǎng)1周后的細(xì)胞材料復(fù)合物植入生物反應(yīng)器的反應(yīng)槽中進(jìn)行動(dòng)靜態(tài)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組將卷在硅膠管上的細(xì)胞材料復(fù)合物接于反應(yīng)槽動(dòng)態(tài)培養(yǎng)接口，對(duì)照組將其接于反應(yīng)槽靜態(tài)培養(yǎng)接口，參數(shù)設(shè)定：搏動(dòng)頻率為75次/min[7]，從0開始每日漸增，先使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3周，之后采用含10 μmol/L 5-氮雜胞苷、體積分?jǐn)?shù)5%馬血清和體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，每7 d換1次液，培養(yǎng)4周后取材，行大體及組織學(xué)檢測(cè)。 主要觀察指標(biāo)：組織工程化尿路肌性管腔的檢測(cè)：將培養(yǎng)8周的組織工程化尿路肌性管腔取出，大體觀察其管腔、色澤與彈性等指標(biāo)，蘇木精-伊紅染色與Masson染色分別顯示誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞及膠原分布，石蠟切片免疫組化法檢測(cè)成肌細(xì)胞特異性抗原結(jié)蛋白與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。 2 結(jié)果 Results 2.1 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞24 h后見少量細(xì)胞貼壁，呈小多角形、大小不一，培養(yǎng)四至五天可達(dá)80%融合，細(xì)胞形態(tài)較為一致、呈集落樣生長(zhǎng)，將原代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞行干細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)CD90，CD44和CD105流式鑒定，行CD34和CD45流式鑒定排除造血細(xì)胞污染。 結(jié)果顯示，CD90，CD44和CD105表達(dá)率為99.42%，98.12%和93.27%；CD34和CD45表達(dá)率為4.92%和0.38%，符合脂肪干細(xì)胞的表型標(biāo)記。 2.2 細(xì)胞-材料復(fù)合物形態(tài)學(xué)觀察 脂肪干細(xì)胞種植于聚羥基乙酸材料，24 h后細(xì)胞與聚羥基乙酸材料黏附牢固，相差顯微鏡下觀察，脂肪干細(xì)胞向聚羥基乙酸纖維兩級(jí)伸展，接種1周后可見細(xì)胞分泌的基質(zhì)將聚羥基乙酸纖維之間的空隙充滿，形成膜狀物，掃描電鏡示聚羥基乙酸材料包裹于細(xì)胞分泌的基質(zhì)中(圖1)。 2.3 細(xì)胞-材料復(fù)合物大體觀察 細(xì)胞-材料復(fù)合物培養(yǎng) 8周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均可見圍繞硅膠管有類似尿道的肌性管腔結(jié)構(gòu)形成，其直徑6 mm，長(zhǎng)10 mm，厚1 mm。實(shí)驗(yàn)組抽去硅膠管后，新生組織維持管腔結(jié)構(gòu)，色澤光亮。對(duì)照組抽去硅膠管后，新生組織管腔結(jié)構(gòu)輕度塌陷，色澤暗淡(圖1)。 2.4 細(xì)胞-材料復(fù)合物組織學(xué)觀察 對(duì)照組可見構(gòu)建組織中脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞排列不均勻，其間有還未完全降解的聚羥基乙酸材料，膠原成分較少，并且誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中不均勻表達(dá)結(jié)蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(圖2)。 D C B A 圖1 脂肪干細(xì)胞-聚羥基乙酸材料復(fù)合物的形態(tài)學(xué)及大體觀察結(jié)果 Figure 1 Morphological and gross observation of adipose-derived stem cell-polyglycolic acid complex 圖注： (1) 圖中A為倒置相差顯微鏡示，脂肪干細(xì)胞向聚羥基乙酸纖維兩級(jí)伸展，接種1周后可見細(xì)胞分泌的基質(zhì)將聚羥基乙酸纖維之間的空隙充滿，形成膜狀物(40)。 (2) 圖中B為掃描電鏡示聚羥基乙酸材料包裹于細(xì)胞分泌的基質(zhì)中(300)。 (3) 圖中C為靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)照組管腔結(jié)構(gòu)輕度塌陷，色澤暗淡。 (4) 圖中D為動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)組新生組織維持管腔結(jié)構(gòu)，色澤光亮。 A D B C 圖2 靜態(tài)培養(yǎng)的組織工程化尿路肌性管腔組織學(xué)染色觀察結(jié)果(200) Figure 2 Histological staining of tissue-engineered muscular conduit of urinary tract cultured in static state (200) 圖注： (1) 圖中A為蘇木精-伊紅染色，聚羥基乙酸材料大部分降解。 (2) 圖中B為Masson染色，較少的膠原纖維分布。 (3) 圖中C為結(jié)蛋白免疫組化染色，成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中不均勻表達(dá)結(jié)蛋白。 (4) 圖中D為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色，成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中不均勻表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。 D A B C 圖3 動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)的組織工程化尿路肌性管腔組織學(xué)染色觀察結(jié)果(200) Figure 3 Histological staining of tissue-engineered muscular conduit of urinary tract cultured in dynamic state (200) 圖注： (1) 圖中A為蘇木精-伊紅染色，聚羥基乙酸材料完全降解。 (2) 圖中B為Masson染色，較多的膠原纖維分布。 (3) 圖中C為結(jié)蛋白免疫組化染色，成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中均勻表達(dá)結(jié)蛋白。 (4) 圖中D為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色，成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中均勻表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。 實(shí)驗(yàn)組可見構(gòu)建組織中脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞排列較均勻，聚羥基乙酸材料降解完全，膠原成分較多而密，免疫組化證實(shí)實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中均勻表達(dá)結(jié)蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(圖3)。 3 討論 Discussion 尿道下裂和不同原因引起的尿道狹窄是泌尿外科常見的疾病，采用自體組織重建尿道是目前臨床上主要的治療方法，但可供移植的同源性皮瓣或黏膜組織來(lái)源有限，限制了其大面積的取材應(yīng)用，組織工程技術(shù)的發(fā)展為尿道重建提供了新的有效的選擇，美國(guó)學(xué)者Atala等[8]采用膀胱黏膜下層修復(fù)4例傳統(tǒng)手術(shù)治療失敗的尿道下裂，新建尿道長(zhǎng)度為5-15 cm，術(shù)后1年尿道造影顯示尿道連續(xù)無(wú)狹窄，組織學(xué)證實(shí)重建尿道表現(xiàn)為典型的尿路上皮，該研究為應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)尿道缺損的臨床應(yīng)用開辟了新的篇章。 盡管采用單純生物材料以補(bǔ)片的方式進(jìn)行尿道修復(fù)重建已取得較好的效果[9-10]，但如果尿道損傷較大甚至閉鎖，單純的全管狀材料修復(fù)，療效不佳[11]。采用體外種子細(xì)胞復(fù)合生物材料進(jìn)行尿道修復(fù)可明顯改善術(shù)后的療效[12]。 脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞，稱之為脂肪干細(xì)胞，已經(jīng)證明脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有類似的多向分化潛能和自我更新能力[13-15]，與其他成體干細(xì)胞相比，脂肪干細(xì)胞來(lái)源豐富，取材簡(jiǎn)單，從而可能作為組織工程新型的種子細(xì)胞用于組織的修復(fù)重建。 符偉軍等[16]采用間接共培養(yǎng)的方法將脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞誘導(dǎo)，培養(yǎng)7 d后，脂肪干細(xì)胞呈現(xiàn)尿路上皮細(xì)胞樣形態(tài)，2周后免疫熒光檢測(cè)證實(shí)，40%-50%的脂肪干細(xì)胞表達(dá)尿路上皮細(xì)胞標(biāo)記物，該研究表明脂肪干細(xì)胞通過(guò)間接共培養(yǎng)的方法可誘導(dǎo)為尿路上皮細(xì)胞，為泌尿系組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源提供了可能。盡管脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)為平滑肌細(xì)胞的研究目前并未廣泛開展，但國(guó)外研究學(xué)者已經(jīng)嘗試在培養(yǎng)液中加入某些化學(xué)因子來(lái)誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物，Rodriguez等[17]采用平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞，6周后應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)顯示脂肪干細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物陽(yáng)性，免疫組化和熒光檢測(cè)證實(shí)誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性的α-肌動(dòng)蛋白、鈣結(jié)合蛋白、肌球蛋白重鏈增加，并且脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的平滑肌樣細(xì)胞在藥物試劑的作用下表現(xiàn)為收縮和舒張的能力。以上研究表明，脂肪干細(xì)胞可作為種子細(xì)胞的來(lái)源應(yīng)用于泌尿系組織工程的修復(fù)重建。 研究證實(shí)脂肪干細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下可以向中胚層來(lái)源的不同組織類型細(xì)胞分化，如軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞[18-22]，本實(shí)驗(yàn)旨在研究犬脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及如何將其誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞，以期為構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔提供簡(jiǎn)單、有效的成肌細(xì)胞來(lái)源。脂肪干細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的特性是其能否作為尿道組織工程種子細(xì)胞的重要依據(jù)，通過(guò)對(duì)脂肪干細(xì)胞相關(guān)CD分子的檢測(cè)來(lái)證明其干細(xì)胞特性。結(jié)果顯示原代脂肪干細(xì)胞 CD90，CD44和CD105表達(dá)率為99.42%，98.12%和93.27%，復(fù)合干細(xì)胞的特點(diǎn)[23-25]，CD34和CD45表達(dá)率為4.92%和0.38%，可排除造血細(xì)胞來(lái)源的可能[26-27]，檢測(cè)結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性可滿足向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的需要。 理想的尿道組織工程支架材料，應(yīng)具有良好的生物相容性，聚羥基乙酸材料在生物安全性和可靠性方面都能滿足基本要求，使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，聚羥基乙酸材料是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的線性脂肪族聚酯[28]，脂肪族結(jié)構(gòu)單元通過(guò)易水解的酯鍵連接形成聚酯的主鏈，而生物體內(nèi)酸、堿或酶能夠促進(jìn)生物可降解聚酯的水解，最終形成二氧化碳和水。 Bazeed等[29]應(yīng)用人工合成生物材料聚羥基乙酸修復(fù)長(zhǎng)3.0-4.0 cm的犬尿道缺損，術(shù)后2周犬自主排尿，組織學(xué)檢查，術(shù)后2個(gè)月支架材料表面覆蓋完整尿路上皮，修復(fù)段尿道周圍未見炎性反應(yīng)，植入體內(nèi)的人工合成聚羥基乙酸材料在術(shù)后3個(gè)月溶解，修復(fù)段尿道管腔未見明顯狹窄征象。Olsen等[30]采用聚羥基乙酸和聚β-羥基丁酸的復(fù)合材料修復(fù)重建長(zhǎng)約4 cm的犬尿道缺損，術(shù)后8-12個(gè)月，修復(fù)段尿道吻合口未見狹窄，組織學(xué)觀察顯示修復(fù)段尿路上皮再生情況良好，周圍未見明顯的炎性反應(yīng)。研究表明聚羥基乙酸材料支持尿路細(xì)胞黏附、增殖，是構(gòu)建組織工程尿道較為理想的生物合成材料[31]。 理想的組織工程尿道替代物應(yīng)具有良好的力學(xué)特性，足以承受長(zhǎng)時(shí)間的尿液排泄沖擊，而靜態(tài)培養(yǎng)的尿路肌性管腔強(qiáng)度不佳，已有研究表明，力學(xué)刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[32]，使構(gòu)建組織保持一定的彈性張力[33]，考慮到力學(xué)因素對(duì)改善構(gòu)建組織力學(xué)特性的重要性，本文應(yīng)用生物反應(yīng)器體外動(dòng)態(tài)構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔，生物反應(yīng)器是一種應(yīng)用生物力學(xué)因素，模擬尿液蠕動(dòng)作用，用于體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔的裝置，循環(huán)培養(yǎng)液通過(guò)硅膠管的膨脹變化對(duì)卷在其外周的細(xì)胞-材料復(fù)合物予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，克服了構(gòu)建組織由于液體直接沖刷作用而產(chǎn)生變形的缺陷。 該裝置有利于促進(jìn)細(xì)胞定向分布及組織的形成[34]，國(guó)外Niklason等[35]證實(shí)搏動(dòng)的張力可增加細(xì)胞-材料復(fù)合物中膠原含量，從而改善構(gòu)建組織工程化血管的力學(xué)強(qiáng)度，Engbers-Buijtenhuijs等[36]研究顯示，較靜態(tài)培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器內(nèi)搏動(dòng)性刺激下，支架材料上的平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞在支架材料上有更均勻的分布，有更多基質(zhì)膠原的表達(dá)。經(jīng)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程化尿路肌性管腔色澤光亮，管腔圓潤(rùn)，組織學(xué)證實(shí)構(gòu)建的組織聚羥基乙酸支架材料降解完全，有效的避免殘留生物材料植入體內(nèi)后可能引起的機(jī)體炎性反應(yīng)[37-38]，同時(shí)動(dòng)態(tài)構(gòu)建的尿路肌性管腔細(xì)胞分布均勻，膠原致密，間接反映了其較好的力學(xué)特性。 作者這次實(shí)驗(yàn)選用脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔，細(xì)胞來(lái)源豐富，取材培養(yǎng)簡(jiǎn)便，分裂增殖能力旺盛，且具有多向分化潛能，將其與聚羥基乙酸支架材料復(fù)合在靜態(tài)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，免疫組化證實(shí)所構(gòu)建的組織工程化尿路肌性管腔中脂肪干細(xì)胞成功誘導(dǎo)為成肌細(xì)胞，但誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞在構(gòu)建組織中分布不均勻，而采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)態(tài)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞-材料復(fù)合物，所誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞在構(gòu)建的組織工程化尿路肌性管腔結(jié)構(gòu)中分布均勻，誘導(dǎo)效果顯著，所構(gòu)建的組織工程化尿路肌性管腔更加成熟。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)力學(xué)因素在組織工程化尿路肌性管腔構(gòu)建過(guò)程中的重要作用，但構(gòu)建的組織工程化肌性管腔面缺乏尿路上皮細(xì)胞的復(fù)合，與真正意義上的尿道組織仍有差距，因此構(gòu)建出完整組織結(jié)構(gòu)的組織工程化尿道修復(fù)尿道缺損，觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)歸情況及尿道修復(fù)效果將是進(jìn)一步探討的重點(diǎn)。 作者貢獻(xiàn)：第一作者負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施，第二作者負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第三作者負(fù)責(zé)試劑訂購(gòu)，由第一作者撰寫成文，通訊作者審校。 利益沖突：文章及內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。 倫理要求：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。 學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)：生物反應(yīng)器-是一種應(yīng)用生物力學(xué)因素模擬尿液蠕動(dòng)作用，用于體外構(gòu)建組織工程化尿路肌性管腔的裝置，循環(huán)培養(yǎng)液通過(guò)硅膠管的膨脹變化對(duì)卷在其外周的細(xì)胞-材料復(fù)合物予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，克服了構(gòu)建組織由于液體直接沖刷作用而產(chǎn)生變形的缺陷，生物反應(yīng)器裝置有利于促進(jìn)細(xì)胞定向分布及組織的形成。 作者聲明：文章為原創(chuàng)作品，無(wú)抄襲剽竊，無(wú)泄密及署名和專利爭(zhēng)議，內(nèi)容及數(shù)據(jù)真實(shí)，文責(zé)自負(fù)。 4 參考文獻(xiàn) References [1] Rehder P, Glodny B, Pichler R, et al. Dorsal urethroplasty with labia minora skin graft for female urethral strictures. BJU Int. 2010;106(8):1211-1214. [2] Mathur RK, Himanshu A, Sudarshan O. Technique of anterior urethra urethroplasty using tunica albuginea of corpora cavernosa. Int J Urol. 2007;14(3):209-213. [3] Marzorati G, Ghinolfi G, Pachera F, et al. Bladder and buccal mucosa graft in urethral stricture reconstruction. Urologia. 2008; 75(3):177-179. [4] Haque ME, Rahman MA, Islam MF, et al. Ventral free oral mucous membrane graft for bulbar urethral stricture. Mymensingh Med J. 2012;21(4):696-701. [5] Andrich DE, Mundy AR. Substitution urethroplasty with buccal mucosal-free grafts. J Urol. 2001;165(4):1131-1134. [6] 劉杰，傅強(qiáng). Beagle犬上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)鑒定及脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成肌的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2011,5(10): 2864-2871. [7] Xu ZC, Zhang WJ, Li H, et al. Engineering of an elastic large muscular vessel wall with pulsatile stimulation in bioreactor. Biomaterials. 2008;29(10):1464-1472. [8] Atala A, Guzman L, Retik AB. A novel inert collagen matrix for hypospadias repair. J Urol.1999;162(3 Pt 2):1148-1151. [9] Farahat YA, Elbahnasy AM, El-Gamal OM, et al. Endoscopic urethroplasty using small intestinal submucosal patch in cases of recurrent urethral stricture: a preliminary study. J Endourol. 2009;23(12):2001-2005. [10] Fiala R, Vidlar A, Vrtal R, et al. Porcine small intestinal submucosa graft for repair of anterior urethral strictures. Eur Urol. 2007;51(6):1702-1708, 1708. [11] Dorin RP, Pohl HG, De Filippo RE, et al. Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration? World J Urol. 2008; 26(4):323-326. [12] Raya-Rivera A, Esquiliano DR, Yoo JJ, et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 2011;377 (9772): 1175-1182. [13] Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochem Funct. 2008;26(6): 664-675. [14] De Ugarte DA, Morizono K, Elbarbary A, et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 2003;174(3):101-109. [15] De Ugarte DA, Alfonso Z, Zuk PA, et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett. 2003;89(2-3):267-270. [16] 符偉軍,史建國(guó),王曉雄,等. 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化尿路上皮細(xì)胞的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012,29(5): 927-929. [17] Rodriguez LV, Alfonso Z, Zhang R, et al. Clonogenic multipotent stem cells in human adipose tissue differentiate into functional smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(32):12167-12172. [18] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12): 4279-4295. [19] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-228. [20] Williams KJ, Picou AA, Kish SL, et al. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. Cells Tissues Organs. 2008;188(3):251-258. [21] Cherubino M, Marra KG. Adipose-derived stem cells for soft tissue reconstruction. Regen Med. 2009;4(1):109-117. [22] Zaminy A, Ragerdi KI, Barbarestani M, et al. Osteogenic differentiation of rat mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells: melatonin as a differentiation factor. Iran Biomed J. 2008;12(3):133-141. [23] Wood JA, Chung DJ, Park SA, et al. Periocular and intra-articular injection of canine adipose-derived mesenchymal stem cells: an in vivo imaging and migration study. J Ocul Pharmacol Ther. 2012;28(3):307-317. [24] Kang JW, Kang KS, Koo HC, et al. Soluble factors-mediated immunomodulatory effects of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2008;17(4): 681-693. [25] Ryu HH, Lim JH, Byeon YE, et al. Functional recovery and neural differentiation after transplantation of allogenic adipose-derived stem cells in a canine model of acute spinal cord injury. J Vet Sci. 2009;10(4):273-284. [26] Martinello T, Bronzini I, Maccatrozzo L, et al. Canine adipose-derived-mesenchymal stem cells do not lose stem features after a long-term cryopreservation. Res Vet Sci. 2011;91(1):18-24. [27] Lim JH, Boozer L, Mariani CL, et al. Generation and characterization of neurospheres from canine adipose tissue-derived stromal cells. Cell Reprogram. 2010;12(4): 417-425. [28] 陳莉,杜錫光,趙保中,等. 聚羥基乙酸及其共聚物[J]. 高分子通報(bào),2003,16(1):18-24, 52. [29] Bazeed MA, Thuroff JW, Schmidt RA, et al. New treatment for urethral strictures. Urology. 1983;21(1):53-57. [30] Olsen L, Bowald S, Busch C, et al. Urethral reconstruction with a new synthetic absorbable device. An experimental study. Scand J Urol Nephrol. 1992;26(4):323-326. [31] Atala A, Freeman MR, Vacanti JP, et al. Implantation in vivo and retrieval of artificial structures consisting of rabbit and human urothelium and human bladder muscle. J Urol. 1993; 150(2 Pt 2):608-612. [32] Lee RT, Schoen FJ, Loree HM, et al. Circumferential stress and matrix metalloproteinase 1 in human coronary atherosclerosis. Implications for plaque rupture. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1996;16(8):1070-1073. [33] Jockenhoevel S, Zund G, Hoerstrup SP, et al. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO J. 2002; 48(1):8-11. [34] Lee AA, Graham DA, Dela CS, et al. Fluid shear stress-induced alignment of cultured vascular smooth muscle cells. J Biomech Eng. 2002;124(1):37-43. [35] Niklason LE, Gao J, Abbott WM, et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 1999;284(5413):489-493. [36] Engbers-Buijtenhuijs P, Buttafoco L, Poot AA, et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 2006;27(11):2390-2397. [37] Gui L, Zhao L, Spencer RW, et al. Development of novel biodegradable polymer scaffolds for vascular tissue engineering. Tissue Eng Part A. 2011;17(9-10):1191-1200. [38] 郭清奎, 呂志前. 可完全生物降解材料聚乳酸-聚羥基乙酸復(fù)合殼聚糖在人工心血管支架制備中的應(yīng)用[J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程, 2011,30(6): 652-655.