【基金標書】2010CB945200-基于誘導多能干細胞技術的若干重大疾病模型與機理研究

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項目名稱： 基于誘導多能干細胞技術的若干重大疾病模型與機理研究首席科學家： 金穎 上海交通大學起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 上海市科委一、研究內(nèi)容我們擬在本項目中開展一下研究內(nèi)容：1. 優(yōu)化和完善建立人 iPS 細胞的技術體系：本研究擬對現(xiàn)有的 iPS 細胞誘導技術進行改進，構建新的非整合性細胞重編程因子表達載體，同時構建將細胞重編程因子輸入體細胞的蛋白質(zhì)直接運輸系統(tǒng)及采用化合物及小分子進行輸送的非病毒系統(tǒng)，篩選能夠替代細胞重編程因子的小分子，建立并優(yōu)化出高效、安全的 iPS 細胞誘導技術。同時，我 們還將對用于誘導 iPS 細胞的體細胞種類進行研究，篩選出比成纖維細胞更有效、更快速地被誘導成為 iPS 細胞、并且易于收集的體細胞。此外，我們將對新方法建立的 iPS 細胞系進行安全性檢驗。2. 建立若干種重大疾病特異的 iPS 細胞系：為了有保證后續(xù)研究疾病發(fā)病機制和篩選新的疾病治療靶點，我們將首先建立嚴重危害人民健康的重大疾病的 iPS 細胞系，重點選擇我們項目組有一定研究基礎的疾病，并優(yōu)先考慮具有遺傳起因的家族病例，包括神經(jīng)系統(tǒng) （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等)重大疾病、若干其它已知單基因或多基因改變的遺傳性疾?。é? 地中海 貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失和肥厚性心肌?。┖湍壳吧胁恢阑蚋淖兊闹卮髠魅拘约膊。ò滩。?。當課題 1 建立新的方法后，我們將利用新的技術建立更多疾病患者特異的 iPS 細胞系。3. 利用疾病特異的 iPS 細胞系研究重大疾病的發(fā)生機制：重點選擇神經(jīng)系統(tǒng)疾病 （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等)和肥厚性心肌病患者特異的 iPS 細胞系，以正常人 iPS 細胞為對照，將疾病特異性 iPS 細胞向相應疾病中的功能細胞定向誘導，比較正常人和患者來源的細胞在分化過程中以及在受到環(huán)境危害（如氧化應激）或過度刺激（overexcitation）情況下的形態(tài)和功能，建立研究相關疾病的模型。采用 microarray 或深度測序技術研究 mRNA 表達譜，采用 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術研究表觀遺傳學譜，分析正常細胞和疾病細胞之間細胞編程的差異，結(jié)合蛋白組學和質(zhì)譜分析，有效地將全基因組表達改變與疾病的表型變化鏈接起來，為揭示疾病的發(fā)生機制和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點提供依據(jù)。4. 建立基于疾病細胞模型的藥物評價和篩選體系：利用以上研究建立的某些特定疾?。ǚ屎裥孕募〔『团两鹕。┑募毎Ｐ蛯τ诂F(xiàn)有藥物的療效和劑量做出個體化的評估并篩選能使細胞表型逆轉(zhuǎn)的新藥。同時結(jié)合疾病的發(fā)生機制研究結(jié)果獲得新的治療靶點，篩選出針對新靶點的激活劑或抑制劑，實現(xiàn)對若干重大疾病的有效控制。二、預期目標（一）總體目標：從解決重大疾病治療和改善我國人民健康水平的需求出發(fā)，針對當前國際iPS 細胞研究的關鍵問題，優(yōu)化建立人 iPS 細胞的技 術體系，實現(xiàn)安全有效地建立疾病特異的 iPS 細胞系；在此基礎上建立嚴重危害人民健康和我們項目組有一定研究基礎的若干重大疾病的 iPS 細胞系；掌握疾病特異性 iPS 細胞向相應疾病中的功能細胞定向誘導的技術方法，以此作為模型研究這些疾病的發(fā)病機制；利用以上疾病模型，對現(xiàn)有藥 物做出個體化的評估，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和篩選新的藥物， 為這些重大性疾病的基礎和臨床研究開辟新的研究方法和技術平臺。通過本項目的實施使我國在干細胞研究領域達到或領先國際水平。同時，以本項目為紐帶，促 進多學科、多院校的銜接和交流，尤其是基礎研究與臨床實踐的密切結(jié)合，培養(yǎng)出一批優(yōu)秀的干 細胞研究人才。（二）五年預期目標1. 優(yōu)化和完善建立人 iPS 細胞的技術體系：包括 1）通過非病毒或非基因組整合載體將重編程因子導入體細胞； 2）發(fā)現(xiàn)誘導多能干細胞產(chǎn)生的小分子化合物或新的細胞調(diào)控因子；3）篩選出可以被更有效、更快速地誘導成為 iPS 細胞、并且易于獲得的體細胞種類， 為建立患者特異的 iPS 細胞系提供平臺。2. 建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病 （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等) 、若干其它已知 單基因或多基因改變的遺傳性疾?。é?地中海貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失和 肥厚性心肌病）和目前尚不知道基因改變的重大傳染性疾?。ò滩。┑燃膊』颊咛禺惖?iPS 細胞系。3. 誘導正常人和患者特異的 iPS 細胞向有特定功能的細胞分化，應用分子生物學、細胞生物學、生物物理等多種手段 發(fā)現(xiàn)疾病細胞表型，建立可供研究的阿爾茨海默病、帕金森病、小兒脊髓性肌肉萎縮癥和肥厚性心肌病的疾病細胞模型。4. 利用以上研究中建立的疾病模型，重點選擇肥厚性心肌病和帕金森病，篩選能逆轉(zhuǎn)疾病表型的新藥。同時，基于疾病 發(fā)生機制研究中發(fā)現(xiàn)的可望獲得重大疾病治療的新靶點，篩選針對這些新靶點的化合物，為改善疾病的癥狀開辟新的途徑。5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國際重要學術刊物上發(fā)表高水平論文 30篇以上。其中，在影響因子大于 5 的刊物發(fā)表 15 篇以上。培養(yǎng)一批從事干 細胞研究的基礎研究與臨床應用結(jié)合的優(yōu)秀人才。三、研究方案1. 我們將在現(xiàn)有的建立 iPS 細胞的手段的基礎上，進一步優(yōu)化和完善該技術體系。具體包括嘗試 通過非基因組整合病毒載體、非病毒載體、蛋白直接導入、小分子化合物、新的 誘導因子等方法 誘導成纖維細胞產(chǎn)生 iPS 細胞系；同時，試驗其它細胞類型，尋找比成纖維細胞更容易收集和更加容易誘導的細胞類型來建立 iPS 細胞。通過這一研究實現(xiàn)更加安全有效地建立 iPS 細胞系的計劃。2. 利用已經(jīng)成熟建立 iPS 細胞系的技術，即逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒載體過表達四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）， 建立疾病特異的 iPS 細胞系。我們將優(yōu)先選擇嚴重影響我國人民健康、有遺傳起因、本 項目組有一定研究基礎的重大疾病建立 iPS 細胞系。3. 在此基礎上，通過生長因子誘導、與其它 細胞共培養(yǎng)或形成類胚體的途徑誘導正常人和患者 iPS 細胞向有特定功能的方向分化。比較正常和疾病 iPS 細胞在正?；蚋鞣N刺激條件下生長、分化、凋亡、附著、運動 及細胞特有功能的不同，建立研究重大疾病的細胞模型。4. 利用這些疾病細胞模型，運用各種組學技術 ，如采用 microarray 或深度測序技術研究 mRNA 表達譜，采用 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術 研究表觀遺傳 學譜，分析正常 細胞和疾病細胞之間細胞編程的差異， 結(jié)合蛋白組 學和質(zhì)譜分析、影像學和電生理的功能分析，有效地將全基因組表達改 變與疾病的表型變化鏈接起來。另外，根據(jù)每一種重大疾病中涉及到的基因產(chǎn)物不同，通過不同的生物化學、分子生物學、細胞生物學和物理學等手段進一步研究疾病發(fā)生分子機制。5. 以上分子機制的研究有可能發(fā)現(xiàn)對疾病治療的新的靶點，針對這些靶點可以設計新的藥物。另外，利用建立的疾病細胞模型可以直接檢驗新藥， 篩選對特異靶點或 細胞表型有影響的藥物或手段，從而實現(xiàn)對重大疾病的有效控制甚至個體化治療。四、年度計劃年度 研究內(nèi)容 預期目標第一年1. 構建表達 4 種重編程因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）的非基因組整合載體，及重編程因子在體細胞的表達。參考Yamanaka 最近發(fā)表的小鼠 iPS細胞誘導方法，建立質(zhì)粒介導的人 iPS 細胞誘導技術；2. 體外表達可穿透細胞膜的重編程因子重組蛋白載體的構建和融合蛋白的表達和純化;3. 經(jīng)患者所在醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會通過和患者知情同意之后，收集建立疾病患者特異的 iPS 細胞系的實驗材料；4. 建立患者樣本來源的體細胞系；5. 建立正常人 iPS 細胞定向誘導分化為膽堿能神經(jīng)元, 多巴胺神經(jīng)元，運動神經(jīng)元和心肌細胞的技術平臺。1. 完成編碼 4 種重編程因子的非基因組整合載體構建和在體細胞的表達；2. 完成 4 種重編程因子在體外的表達和純化；3. 建立獲取患者樣本的合符倫理的途徑；4. 建立患者體細胞細胞系；5. 實現(xiàn)將 iPS 細胞穩(wěn)定的分化為膽堿能神經(jīng)元，多巴胺神經(jīng)元，運動神經(jīng)元和心肌細胞的技術平臺。年度 研究內(nèi)容 預期目標第二年1. 應用現(xiàn)有的方法建立神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病和肥厚性心肌病患者特異的 iPS 細胞系；2. 比較不同來源體細胞重編程的效率；3. 應用第一年構建的載體誘導體細胞重編程，建立 iPS 細胞系；4. 探索體外表達的融合蛋白進入細胞的最佳條件；5. 對建立的 iPS 細胞系進行常規(guī)鑒定；6. 明確病人特異的 iPS 細胞向功能特異的神經(jīng)元分化能力與正常人 iPS 細胞的異同，并檢測體外培養(yǎng)細胞的存活能力及生理功能；1. 獲得部分疾病患者特異的 iPS 細胞系；2. 發(fā)現(xiàn)重編程效率高的體細胞；3. 建立非基因組整合的 iPS 細胞系；4. 建立體外表達的融合蛋白進入細胞的最佳條件；5. 為課題 3 提供 iPS 細胞系；6. 建立 iPS 細胞定向誘導分化為膽堿能神經(jīng)元, 多巴胺神經(jīng)元，運動神經(jīng)元的技術平臺，建立AD，PD，SMA 的發(fā)病模型；第三年1. 研究 iPS 細胞的小分子誘導技術。首先，篩選能夠誘導Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 等 4個內(nèi)源基因表達的小分子，然后用這些小分子分別替代 4 種因子誘導產(chǎn)生 iPS 細胞。2. 研究應用體外表達和純化的融合蛋白誘導 iPS 細胞；1. 發(fā)現(xiàn)新的能分別誘導 4 種重編程因子的小分子，檢驗發(fā)現(xiàn)的小分子在誘導 iPS 細胞中的作用；2. 鑒定體外表達的重編程因子在在誘導 iPS 細胞中的作用；3. 獲得 β-地中海貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失等 遺傳 性年度 研究內(nèi)容 預期目標3. 將已知單基因或多基因改變的遺傳性疾?。é?-地中海貧血、骨髓衰竭綜合征和 Y 染色體微缺失）及艾滋病的體細胞誘導為 iPS 細胞；4. 比較正常 iPS 細胞和肥厚性心肌病患者 iPS 細胞向心肌細胞分化的差異；5. 了解不同遺傳背景的肥厚性心肌病 iPs 來源心肌細胞功能和 電生理學相關離子通道障礙的致病位點，選擇相應臨床藥物進行疾病控制，并確認此種細胞模型獲得的藥物線索和臨床實踐的相關性。疾病及艾滋病患者特異的 iPS 細胞；4. 利用肥厚性心肌病患者來源 iPs細胞獲得心肌細胞實施臨床藥物篩選的研究；5. 利用 iPS 模型探索帕金森病的發(fā)病機制，借助組學技術篩選關鍵差異蛋白或信號通路變化。第四年1. 篩選對 iPS 細胞的誘導有加速/增強作用的小分子加速劑/增強劑；2. 繼續(xù)優(yōu)化誘導 iPS 細胞技術，包括非基因組整合載體和體外表達蛋白技術；1. 發(fā)現(xiàn)并應用對 PS 細胞的 誘導有加速/增強作用的小分子加速劑/增強劑；2. 實現(xiàn)高效安全地建立人的 iPS 細胞系；3. 鑒定區(qū)分正常人和患者的關鍵性表觀遺傳標志；年度 研究內(nèi)容 預期目標3. 采用采用單細胞表達譜及 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術研究正常人和患者的 iPS 細胞遺傳和表觀遺傳學譜；4. 在疾病特異 iPS 細胞分化過程中，收集不同時間點的細胞，分別進行 mRNA 表達譜和 microRNA表達譜研究；5. 發(fā)現(xiàn)并鑒定 1-2 種在疾病發(fā)生過程中變化非常明顯且與 AD 發(fā)病密切相關的關鍵基因和microRNA，同 時嘗試找到相應microRNA 的靶基因；4. 發(fā)現(xiàn)并鑒定在疾病患者 iPS 細胞分化過程中的 1-2 個關鍵基因和microRNA，并 對其功能做初步研究；5. 發(fā)表 3-5 篇 SCI 收錄的高水平論文；第五年1. 對新方法建立的 iPS 細胞系的安全性進行研究和鑒定；2. 應用課題 1 中建立的新的優(yōu)化方法建立重大疾病患者特異的 iPS細胞系；3. 利用 iPS 模型探索帕金森病合肥厚性心肌病的發(fā)病機制，借助組學技術篩選關鍵差異蛋白或信號通路變化；1. 為建立疾病患者特異的 iPS 細胞提供最佳的方案；2. 明確新方法建立的 iPS 細胞的安全性；3. 發(fā)現(xiàn)疾病治療的新靶點；4. 確認快速藥物篩選和臨床指導的新治療策略；5. 在國家高水平的學術雜志上發(fā)表高質(zhì)量的學術論文，申請專利。年度 研究內(nèi)容 預期目標4. 利用建立的模型進行藥物評價和篩選；5. 論文的撰寫和發(fā)表。