高中生物血紅蛋白的提取和分離 新人教選修

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1、會計學(xué)1高中生物高中生物 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離 新人教新人教選修選修課標領(lǐng)航課標領(lǐng)航1概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。的基本原理。2能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結(jié)評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結(jié)果。果。3嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本體驗從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本過程和方法。過程和方法。【重點】【重點】凝膠色譜法、電泳法基本原理。凝膠色譜法、電泳法基本原理?！倦y點

2、】【難點】實驗操作的過程及分析。實驗操作的過程及分析。第1頁/共35頁情境導(dǎo)引情境導(dǎo)引為年老多病的人注射丙種為年老多病的人注射丙種球蛋白，可以在一定程度上增強球蛋白，可以在一定程度上增強其身體的抵抗力。在動物體內(nèi)，其身體的抵抗力。在動物體內(nèi)，丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合在一起。要獲得純凈的丙種球蛋在一起。要獲得純凈的丙種球蛋白制品，就必須進行提取和分離。白制品，就必須進行提取和分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而

3、實現(xiàn)了樣品電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)了樣品中各種分子的分離。中各種分子的分離。第2頁/共35頁基礎(chǔ)自主梳理基礎(chǔ)自主梳理一、凝膠色譜法一、凝膠色譜法1概念：也稱作分配色譜法，是根據(jù)概念：也稱作分配色譜法，是根據(jù)_質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理原理(1)由微小的多孔球體構(gòu)成的凝膠，內(nèi)部有許多貫由微小的多孔球體構(gòu)成的凝膠，內(nèi)部有許多貫穿的通道。穿的通道。相對分子相對分子第3頁/共35頁(2)由相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對由相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道

4、，路程較長，移動速度較慢，而相對分子質(zhì)量較大的路程較長，移動速度較慢，而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動，路程較短，移動速度較快，從而使相對分子移動，路程較短，移動速度較快，從而使相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。二、緩沖溶液二、緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的作用：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的_對溶對溶液液pH的影響，維持的影響，維持pH基本不變?；静蛔?。較小較小凝膠外部凝膠外部酸和堿酸和堿第4頁/共35頁2配制：由配制：由12種緩沖劑溶解于水中配制而成，種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過調(diào)

5、節(jié)緩沖劑的通過調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以得到不同就可以得到不同pH范范圍內(nèi)使用的緩沖液。圍內(nèi)使用的緩沖液。三、電泳三、電泳1概念：指概念：指_在電場的作用下發(fā)生遷移的在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。過程。2原理：在一定的原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團會帶上正電或負電，在電場的分子的可解離基團會帶上正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷_的電極移動。的電極移動。使用比例使用比例帶電粒子帶電粒子相反相反第5頁/共35頁3作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性

6、質(zhì)的差異及分子本身的大小、性質(zhì)的差異及分子本身的大小、_的不同，使帶的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的電分子產(chǎn)生不同的_，從而實現(xiàn)樣品中，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。各種分子的分離。4方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。丙烯酰胺凝膠電泳。四、實驗操作四、實驗操作1樣品處理：通過樣品處理：通過_、_、分離血紅蛋白溶液等操作、分離血紅蛋白溶液等操作收集血紅蛋白溶液。收集血紅蛋白溶液。(1)紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。分離時采紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。分離時采取低速短時間離心，直至上清液中沒有黃色，表明取低速短時間離心，直至上清液中

7、沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。紅細胞已洗滌干凈。形狀形狀遷移速度遷移速度紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放第6頁/共35頁思考感悟思考感悟1洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水？鹽水？【提示】【提示】生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。第7頁/共35頁(2)血紅蛋白的

8、釋放：在蒸餾水和血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和_的作的作用下，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。用下，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。甲苯甲苯第8頁/共35頁思考感悟思考感悟2在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？的目的是什么？【提示】【提示】(1)加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。(2)細胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機細胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機溶劑，加入甲苯能加速紅細胞破裂并釋放出血紅溶劑，加入甲苯能加速紅細胞破裂并釋放出血紅蛋白。蛋白。第9頁/共35頁(3)分離血紅蛋白溶液：把攪拌好的混合液離心后分離血紅蛋白

9、溶液：把攪拌好的混合液離心后,將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體。明液體。2粗分離：即透析粗分離：即透析(1)方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋放入一定量適宜濃度的放入一定量適宜濃度的_中，透析中，透析12h.(2)目的：將樣品中分子較小的雜質(zhì)除去。目的：將樣品中分子較小的雜質(zhì)除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。磷 酸

10、 緩 沖磷 酸 緩 沖液液第10頁/共35頁3純化：通過凝膠色譜柱將相對分子質(zhì)量較大的純化：通過凝膠色譜柱將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。操作如下：雜質(zhì)蛋白除去。操作如下：(1)凝膠色譜柱的制作。凝膠色譜柱的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填材料：本實驗使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。材料：本實驗使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。方法：凝膠用方法：凝膠用_充分溶脹后，配成凝膠懸充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有_存存在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(3)樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫a.

11、準備：加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上準備：加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與的緩沖液緩慢下降到與_平齊，關(guān)閉出口。平齊，關(guān)閉出口。蒸餾水蒸餾水氣泡氣泡凝膠面凝膠面第11頁/共35頁b加樣：用吸管小心地將加樣：用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。c加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi).洗脫：加入洗脫：加入_，打開下端出口，進行，打開下端出口，進行洗脫。洗脫。4純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯

12、酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。五、操作提示五、操作提示1紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)、紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)、_與離心時與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白：間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白：離心速度過高和時間過長會使離心速度過高和時間過長會使_等一同沉淀等一同沉淀，達不到分離效果。，達不到分離效果。磷酸緩沖液磷酸緩沖液離心速度離心速度白細胞白細胞第12頁/共35頁2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用_加熱，加速膨脹。加熱，加速膨脹。3凝膠色譜柱的

13、裝填：在裝填凝膠柱時，不得凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。次序，降低分離效果。4蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶_地地移動，說明色譜柱制作成功。移動，說明色譜柱制作成功。沸水浴沸水浴均勻一致均勻一致第13頁/共35頁核心要點突破核心要點突破解讀實驗原理解讀實驗原理1蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運動情況分析蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運動情況分析相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量小相對分子質(zhì)量小直徑大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨贝笥谀z顆粒空隙直徑徑小于凝膠顆?？障吨毙∮谀z顆

14、?？障吨睆綇竭\動方式運動方式垂直向下運動垂直向下運動無規(guī)則的擴散運動無規(guī)則的擴散運動運動速度運動速度較快較快較慢較慢運動路程運動路程較短較短較長較長洗脫次序洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出先從凝膠柱中洗脫出來來后從凝柱中洗脫出來后從凝柱中洗脫出來第14頁/共35頁2.電泳方法電泳方法瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中荷，各種分子在電場中遷移速率決定于所帶電遷移速率決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀不同大小、形狀不同在凝膠中加入在凝膠中加入SDS，使，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與蛋白質(zhì)解聚成

15、單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)質(zhì)SDS復(fù)合物，使其復(fù)合物，使其遷移速率完全取決于分遷移速率完全取決于分子的大小子的大小第15頁/共35頁(2011年聊城高二檢測年聊城高二檢測)有關(guān)凝膠色譜法有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是和電泳法的說法正確的是()A它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B它們的原理相同它們的原理相同C使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要需要D以上說法都正確以上說法都正確【嘗試解答】【嘗試解答】_A_第16頁/共35頁【解析】【解析】凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大

16、小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。這兩種方度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度。法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度?！菊`區(qū)警示】【誤區(qū)警示】不同的蛋白質(zhì)在凝膠色譜中有三不同的蛋白質(zhì)在凝膠色譜中有三種運動情況：種運動情況：(1)分子很小，可進入凝膠全部內(nèi)孔隙；分子很小，可進入凝膠全部內(nèi)孔隙；(2)分子很大

17、，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；分子很大，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；(3)分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)部分。相應(yīng)部分。第17頁/共35頁跟蹤訓(xùn)練跟蹤訓(xùn)練下列各項中，一般不影響凝膠色譜法下列各項中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的分離度的是分離蛋白質(zhì)的分離度的是()A層析柱的高度層析柱的高度B層析柱的直徑層析柱的直徑C緩沖溶液緩沖溶液D樣品的分布樣品的分布解析：解析：選選B。分離度取決于柱高，為分離不同組。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱必須有適宜的高度，分離度與柱高的分，凝膠柱必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。樣品的

18、分布也影響分離度，緩沖溶平方根相關(guān)。樣品的分布也影響分離度，緩沖溶液的液的pH影響蛋白質(zhì)所帶的電荷，因此也影響分影響蛋白質(zhì)所帶的電荷，因此也影響分離度。只有層析柱的直徑一般不會影響分離度。離度。只有層析柱的直徑一般不會影響分離度。第18頁/共35頁血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離一般分四步：樣品處理蛋白質(zhì)的提取和分離一般分四步：樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定。純度鑒定。1樣品處理樣品處理第19頁/共35頁(1)紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌采集血樣采集血樣低速短時間離心低速短時間離心吸取血漿吸取血漿鹽水洗滌鹽水洗滌低速離心低速離心重復(fù)重復(fù)步驟三步驟三次。次。特別提醒特

19、別提醒(1)洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的進行。步驟的進行。(2)離心時轉(zhuǎn)速要低，時間要短，一般為離心時轉(zhuǎn)速要低，時間要短，一般為500r/min，離心，離心2min。(3)洗滌三次后，如上清液仍有黃色，可增加洗滌洗滌三次后，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)。次數(shù)。第20頁/共35頁第21頁/共35頁特別提醒特別提醒(1)將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層。層。(2)將濾液于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的將濾液于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的血紅蛋白水溶液層。血紅蛋白水溶液層。第22頁/

20、共35頁(4)透析透析取取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中的磷酸緩沖液中(pH為為7.0)，透析，透析12h。目的是除。目的是除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。第23頁/共35頁2凝膠色譜操作凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作取長取長40cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管，兩端需用砂的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。紙磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆

21、蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。目尼龍紗包好。頂塞的制作：打孔頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第24頁/共35頁特別提醒特別提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。第25頁/共35頁(2)凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填(本實驗使用的凝膠是交聯(lián)本實驗使用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠)固定：

22、將色譜柱垂直固定在支架上固定：將色譜柱垂直固定在支架上裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi)裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi)洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h第26頁/共35頁(3)樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用量為滴加透析樣品：用量為1mL樣品滲入凝膠床：樣品完全滲進凝膠層樣品滲入凝膠床：樣品完全滲進凝膠層洗脫：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫洗脫：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每試管

23、收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集收集一管，連續(xù)收集第27頁/共35頁特別提醒特別提醒(1)滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。同時注意不要破壞凝膠面。(2)在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功。，說明色譜柱制作成功。第28頁/共35頁下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入的加入(圖圖)和洗脫和洗脫(圖圖)示意圖，請據(jù)圖回答示意圖

24、，請據(jù)圖回答下列問題。下列問題。第29頁/共35頁( 1 ) 在 加 樣 示 意 圖 中 ， 正 確 的 加 樣 順 序 是在 加 樣 示 意 圖 中 ， 正 確 的 加 樣 順 序 是_。(2)用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 、 貼 著 管 壁 加 樣 、貼 著 管 壁 加 樣 、_。(3)等樣品等樣品_時，才加入緩沖液，待時，才加入緩沖液，待_接近色譜柱底端時，用試接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每管收集流出液，每_mL收集一管，連收集一管，連續(xù)收集。續(xù)收集。第30頁/共35頁【嘗試解答】

25、【嘗試解答】(1)(2)不要破壞凝膠面使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動不要破壞凝膠面使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(3)完全進入凝膠層紅色的蛋白質(zhì)完全進入凝膠層紅色的蛋白質(zhì)5【解析】【解析】加樣品時應(yīng)嚴格按要求進行操作，吸加樣品時應(yīng)嚴格按要求進行操作，吸管應(yīng)貼著管壁，管口沿著管壁環(huán)繞移動，還應(yīng)注管應(yīng)貼著管壁，管口沿著管壁環(huán)繞移動，還應(yīng)注意不要破壞凝膠面。等樣品完全進入到凝膠層時意不要破壞凝膠面。等樣品完全進入到凝膠層時，才加入緩沖液進行洗脫。，才加入緩沖液進行洗脫。第31頁/共35頁【探規(guī)尋律】【探規(guī)尋律】對分離效果的判斷對分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻

26、、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。說明分離效果不好，裝填不成功。第32頁/共35頁【互動探究】【互動探究】(1)凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項？事項？(2)血紅蛋白溶液是如何分離的？血紅蛋白溶液是如何分離的？【提示】【提示】(1)裝填前為了加速膨脹，可以加入裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約時間，除去凝膠中可能帶

27、有的微生物，排除膠粒時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。內(nèi)的空氣。裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。象。第33頁/共35頁(2)蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)離心原理進行的。當含有細蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)離心原理進行的。當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場的強度及液體的黏度有關(guān)。像紅細胞大又與重力場的強度及液體的黏度有關(guān)。像紅細胞大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。下觀察到它們的沉降過程。第34頁/共35頁