反相高效液相色譜法測(cè)定食用植物油中維生素E的含量

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1、 反相高效液相色譜法測(cè)定食用植物油中維生素 E 的含量 摘要 : ，高效液相色譜法、δ - 生育酚、γ - 生育酚、α - 生育酚 關(guān)鍵詞 : 維生素 E 第一章 緒論 1 選題的目的和意義 維生素 E 是具有 α- 生育酚生物活性的生育酚和三烯生育酚及其衍生物的總稱。它們都是苯并二氫吡喃的衍生物。 2 高效液相色譜法簡(jiǎn)介 3 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 4 主要研究?jī)?nèi)容 第二章 高效液相色譜法色譜條件的優(yōu)化 引 言 由于維生素 E 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異構(gòu)體種類多，分析測(cè)定相對(duì)困難，現(xiàn)已知的分析方

2、法有氣相色譜法、紫外分光光度計(jì)法、電化學(xué)分析法、比色法、熒光法、 。前面幾種方法大都需要較復(fù)雜的樣品前處理過程，增加了試高效液相色譜法 等 驗(yàn)難度，而且測(cè)定的結(jié)果受到多種因素的影響。高效液相色譜法是近年來(lái)發(fā)展 起來(lái)的一種分析技術(shù)，用來(lái)分析維生素 E 能簡(jiǎn)化樣品處理的步驟，相較其他方法具有色譜柱溫度條件相對(duì)溫和，物質(zhì)組分分離速度快，靈敏度高，重復(fù)性好，干擾小 等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于其他幾種檢測(cè)方法，成為實(shí)際檢驗(yàn)工作中測(cè)定 VE最普遍的方法。 高效液相色譜法又分為正相色譜法及反相色譜法。正相色譜法的流動(dòng)相大多為有毒有害的且易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，

3、故一般采用反相色譜柱進(jìn)行分析。反相鍵合相色譜是在 ODS(C)柱上，采用甲醇 - 水或者乙腈 - 水作流動(dòng)相，分離非 18 極性或中等極性的化合物如同系物，稠環(huán)芳烴、藥物、急速、天然產(chǎn)物及農(nóng)藥 殘 [1] 留量等。色譜柱的穩(wěn)定性比較高，保留時(shí)間短，重現(xiàn)性好，容易平衡等優(yōu)點(diǎn)，而且一般以水和甲醇作為流動(dòng)相，減少了有毒有害溶劑的使用。在高效液相色譜中，影響分離效果的好壞的其中一個(gè)重要指標(biāo)是色譜填料的選擇，反相色譜用的填料通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)性極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖溶液與甲醇、乙腈等的混合物。

4、樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更 強(qiáng)的保留。常用的反相填料由 :C (ODS),C(MOS),C(Butyl) 、CH188465(Phenyl) 等。 本試驗(yàn)選用的是 C 色譜柱。紫外吸收檢測(cè)器是一種選擇性的濃 18 度型檢測(cè)器，是 HPLC中應(yīng)用最早、最廣泛的檢測(cè)器之一，原理是通過測(cè)定物質(zhì)在流動(dòng)池中吸收紫外光的大小確定其含量，優(yōu)點(diǎn)是不僅靈敏度高和選擇性高，而且對(duì)環(huán)境溫度、流動(dòng)相的流速波動(dòng)和組成變化不敏感。試驗(yàn)時(shí)選用的紫外檢測(cè)器。 目前有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)介紹了 VE的測(cè)定方法，但是色譜條件各不一樣本試驗(yàn)根據(jù)以下相關(guān)

5、標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的色譜條件選取合適的水平進(jìn)行試驗(yàn)分析，對(duì)波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例、柱溫、流速做單因素實(shí)驗(yàn)從而選取每個(gè)因素的三個(gè)最佳水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分離度為色譜柱的總分離效能指標(biāo)，既反映柱效率又能反映選擇性，其定義為 相鄰兩組分的色譜峰保留值之差與峰底寬總和一半的比值。本試驗(yàn)測(cè)定維生素 E 的三種單體，觀察色譜圖可知，三種單體的色譜峰都能完全分離，峰 形尖細(xì)，故以色譜峰的保留時(shí)間來(lái)定性峰面積來(lái)定量，選用第一個(gè)色譜峰出峰 時(shí)間及 VE三種單體色譜峰的峰面積作為評(píng)定值，以確定測(cè)定維生素 E 的最佳色譜 條件即第一個(gè)單體保留時(shí)間最短，峰面積響應(yīng)值最大。初始色譜條件為 : 紫外檢

6、測(cè)波長(zhǎng) 300nm，流動(dòng)相為甲醇 +水 =98+2，流速 1.0ml/min ，柱溫 30?，進(jìn)樣量 10ul 。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn) VE測(cè)定色譜條件比較如表 1 所示。 表 1 色譜條件比較 標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn) 紫外檢測(cè)器波長(zhǎng) 流動(dòng)相比例 柱溫 流速 NY/T 1598-2008 300nm 甲醇 +水=98+2 30? 未規(guī)定 GB/T 5009.82-2003 300nm 甲醇 +水=98+2 未規(guī)定 1.7ml/min GB/T 17812-2008 280nm  甲醇 +水=95+5  室溫  1.0ml/

7、min GB/T 9695.30-2008 292nm  甲醇  30? 1.0ml/min GB/T 5413.9-2010 294nm  甲醇  35??1? 1.0ml/min [2] 文獻(xiàn) 2 熒光檢測(cè)器 甲醇 +水=98+2 35? 1.0ml/min [3] 文獻(xiàn) 3 292nm 甲醇 +水=98+2 40? 1.0ml/min [4] 文獻(xiàn) 4 298nm 甲醇 +水=99+1 25? 1.7ml/min [5] 文獻(xiàn) 5 熒光檢測(cè)器 甲醇 +水=98+2 室溫 0.8ml/min 1 材料與方

8、法 1.1 材料與儀器 1.1.1 化學(xué)試劑 甲醇 高效液相色譜淋洗劑 HPLC國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 乙醇 ( 無(wú)水乙醇 ) 優(yōu)級(jí)純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 無(wú)水乙醚 分析純 衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司 硝酸銀 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司碘化鉀 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 氫氧化鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 硫代硫酸鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 氨水 分析純 衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司 gamma-Tocopherol 25mg – Neat SUPELCO Ana

9、lytical delta-Tocopherol 100mg  –Neat SUPELCO Analytical DL- alpha Tocopherol 100mg  – Neat SUPELCO Analytical 1.1.2  試劑的處理 無(wú)水乙醚  : 檢查是否含有過氧化物，檢查方法  : 吸取  5ml  乙醚加入  1ml10%的碘化 鉀溶液 (100g/L) ，震搖 1min，水層呈現(xiàn)黃色，則該乙醚需處理后使用。去除過氧 化物的方法 : 乙醚加入一定量的硫代硫酸鈉

10、 (50g/L) 于梨形分液漏斗中震搖，靜置， 分取乙醚層，然后再用蒸餾水洗滌乙醚層 2 次，于水浴上蒸餾，棄去首尾蒸出的部 分，收集餾出液，然后再次檢查，直至不含過氧化物。 無(wú)水乙醇 : 檢查是否含有醛類物質(zhì)，方法 : 加一定量的氨水于硝酸銀溶液 (50g/L) 中，直至生成的沉淀重新溶解，再加入幾滴氫氧化鈉溶液 (100g/L) ，如再產(chǎn)生沉 淀，則再加入氨水直至沉淀消失，此溶液則為銀氨溶液。吸取  2ml 銀氨溶液于干凈 試管中，加入  0.5ml  乙醇，搖勻，再加入幾滴氫氧化

11、鈉溶液  (100g/L)  ，于沸水浴上 加熱，放置冷卻后，試管壁出現(xiàn)少量片狀銀鏡，則乙醇需經(jīng)過處理后使用。脫醛方 法 : 稱取 4g 硝酸銀溶解于少量水中，稱取 8g 氫氧化鈉溶于溫?zé)岬囊掖贾?，然后將兩者倒?1L 的乙醇中，充分震搖后，放置暗處 2d( 期間不時(shí)搖動(dòng) ) ，過濾后，于水浴中蒸餾，棄去初濾液，收集濾液，然后再檢 查。 1.1.3 儀器與設(shè)備 Waters 高效液相色譜儀 e2695 配 2489 紫外檢測(cè)器 美國(guó)沃特斯有限公司 色譜 柱 C 柱(150mm4.6mm， 5um) 18 1.2 試驗(yàn)方

12、法 1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 天然維生素 E 同系物通常為透明、淡黃色粘稠油狀物，無(wú)臭無(wú)味，比重為 0.950(25?) ，不溶于水，可溶于油、丙酮、乙醇、三氯甲烷和乙醚等脂溶 [8] 性溶 劑。因?yàn)橐掖家M(jìn)行脫醛處理，故選擇甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。將 100mgδ - 生育酚、 100mgα - 生育酚、 25mgγ - 生育酚用甲醇分別定容至 100ml、 100ml、50ml 棕色容量 瓶中，將其作為 1mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml 的儲(chǔ)備液，放置冰箱保存 ; 移取一定體積的三種生育酚儲(chǔ)備液，配制成 1mg/ml、

13、 10mg/ml， 40ug/ml ， 60mg/ml，100mg/ml， 140mg/ml 的濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1.2.2 單因素試驗(yàn) 1.2.2(1 波長(zhǎng)的確定試驗(yàn) 以色譜條件為流動(dòng)相 : 甲醇 +水(V+V)=98+2, 柱溫 :30? ，流速 :1.0ml/min ， ，在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 280nm、290nm、 292nm、294nm、 300nm條件下進(jìn)樣量 10uL 做單因素試驗(yàn)。 1.2.2.2 流動(dòng)相比例的確定試驗(yàn) 以色譜條件為紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 300nm,柱溫 :30?

14、 ，流速 :1.0ml/min ，進(jìn)樣 ， 在流動(dòng)相甲醇和水的比例為 95:5 、97:3 、98:2 、99:1 、100:0 條件下量 10uL 做單因素實(shí)驗(yàn) 1.2.2.3 流速的確定試驗(yàn) 因?yàn)橹巧V柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可以得到不同的 柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑 4.6mm的色譜柱，流速一般選擇 1ml/min ，對(duì)于內(nèi)徑為 4.0mm柱，流速 0.8ml/min 為佳。故綜合文獻(xiàn)及流速對(duì)柱效的影響，選擇以下 5 個(gè)水平做單因素試驗(yàn)。以色譜

15、條件為流動(dòng)相 : 甲醇 +水(V+V)=98+2, 柱溫 :30? ，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 300nm，進(jìn)樣量 10uL，在流速為 0.8 、0.9 、1.0 、 1.5 、1.7ml/min 條件下做單因素試驗(yàn)。 1.2.2.4 柱溫的確定試驗(yàn) 因?yàn)?C 柱推薦使用柱溫為 40?，最高使用溫度為 50?，故以色譜條件為 18 流動(dòng)相 : 甲醇 +水 (V+V)=98+2, 紫外檢測(cè)波長(zhǎng) :300nm，流速 :1.0ml/min ，進(jìn)樣量10uL，在柱溫為 25?、30?、35?、 40?、45?條件下做單因素試驗(yàn)。 1.2.3 色譜條件優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)面法可以很

16、好的反應(yīng)各因素的與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及各因素之間的交互 作用，借用其他統(tǒng)計(jì)軟件還可以精確的預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)及其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，但根 據(jù)單因素結(jié)果可以看出，因素水平與評(píng)定值之間的關(guān)系大多為一定的遞增或者遞減 趨勢(shì)而不是有起落的峰形圖，所做出的響應(yīng)面液不是屋脊面，故本試驗(yàn)采用正交試 驗(yàn)方法。正交試驗(yàn)的結(jié)果分析有直觀分析和方差分析 2 種，雖然直觀分析法簡(jiǎn)便易 懂，但是不能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中必然存在的誤差大小予以無(wú)偏估計(jì)，不能確定其精確 度，因而給試驗(yàn)的分析帶來(lái)困難。方差分析法要求用正交表設(shè)計(jì) [6] 試驗(yàn)時(shí)，必須 留有不排入

17、因素或互作的空列以作為誤差的估計(jì)值，故選取流動(dòng) 4 相比例、流速、 柱溫三個(gè)因素的三個(gè)最佳水平做 L(3) 正交試驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為 9 2 次，確定最佳色譜條件。 2 結(jié)果與分析 2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 2.1(1 波長(zhǎng)單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖 1 所示。 14600000 13.9500000 delta 色譜峰保留時(shí) 13.8400000 間( 分鐘 ) 13.7300000(delta+gamma+alpha) 色譜峰峰面積 ( 微 13.6200000 伏 * 秒 ) 13.5100000

18、 13.40 波長(zhǎng) 280nm 波長(zhǎng) 290nm 波長(zhǎng) 292nm 波長(zhǎng) 294nm 波長(zhǎng) 300nm 圖 1 不同波長(zhǎng)的比較 分析 : 根據(jù)文獻(xiàn)知維生素 E 的最大吸收波長(zhǎng)基本均在 280nm-300nm，由表中數(shù)據(jù) 可見在不同波長(zhǎng)條件下保留時(shí)間基本不變，只有色譜峰峰面積在變化，波長(zhǎng) 294nm 時(shí)峰面積最大 ; 由圖知

19、不同生育酚單體有不同的最大吸收波長(zhǎng)，α - 生育酚色譜峰的 峰面積變化最明顯，波長(zhǎng)為 290nm，292nm， 294nm時(shí) α- 生育酚的峰面積相差不 大，最終選取 294nm做為紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)。 2.1.2 流動(dòng)相比例單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖 2 所示。 30600000 25500000delta 色譜峰保留時(shí) 20400000 間( 分鐘 ) 15300000(delta+gamma+alph10200000a)色譜峰峰面積 ( 微伏 * 秒)5100000 00 流動(dòng)相甲醇 流動(dòng)

20、相甲醇比水 99 比 1 流動(dòng)相甲醇比水 98 比 2 流動(dòng)相甲醇比水 97 比 3 圖 2 不同流動(dòng)相比例的比較 流動(dòng)相甲醇比水 95 比 5 分析 : 由圖知甲醇含量越高，保留時(shí)間越短，峰面積越大，即有機(jī)相比例越 高，洗脫強(qiáng)度越大，目標(biāo)物出峰時(shí)間越快。故選取流動(dòng)相比例為 : 甲醇 +水=98+2， 甲醇 +水=99+1，甲醇 +水=100+0做為正交試驗(yàn)流動(dòng)相比例的三個(gè)水平。 2.1.3 流 速單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示 18700000 1660000014delta 色譜峰保留時(shí)間 50000012(

21、分鐘 )40000010 8(delta+ga300000mma+alpha) 色譜峰峰 6200000 面積 ( 微伏 * 秒 )41000002 00 流速 0.8ml/min 流速 0.9ml/min 圖 3 不同流速比較 流速 1.0ml/min 流速 1.5ml/min 分析 : 由圖知流速越大，保留時(shí)間越短，但峰面積反而越小。流速加快，目標(biāo) 物流速 1.7ml/min 在色譜柱上交換不充分，從而體現(xiàn)出峰面積減少。故綜合平衡選取流速為 0.8ml/min ， 0.9ml/min ，

22、1.0ml/min 做為正交試驗(yàn)流速的三個(gè)水平。 2.1.4 柱溫 單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖 4 所示 16700000 14600000 12500000delta 色譜峰保留時(shí)間 ( 分鐘 )104000008(delta+gamma+alph3000006a) 色譜峰峰面積 ( 微 200000 伏* 秒)4 1000002 00 柱溫 25 攝氏度 柱溫 30 攝氏度 圖 4 不同柱溫比較 柱溫 35 攝氏度柱溫 40 攝氏度 由圖知，色譜柱溫度越高，保留時(shí)間越短，峰面積越

23、大，故選取柱溫為35?、 柱溫 45 攝氏度 40?、 45?做為正交試驗(yàn)柱溫的三個(gè)水平。 2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 2.2.1 因素水平表如表 2 所示 表 2 色譜條件優(yōu)化因素水平表因 素 水平 A 流動(dòng)相比例 ( 甲醇體積 )% B 流速 ml/min C 柱溫 ? 1 98 0.8 35 2 99 0.9 40 3 100 1.0 45 2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 2.2.1.1 以峰面積為評(píng)定值的結(jié)果分析過程 色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表 3 所示: 4 表 3 色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 L

24、(3) 9 A B C 指標(biāo) 試驗(yàn)號(hào) 空列 流動(dòng)相比例 流速 ( δ+γ+α) 色譜峰 ( 甲醇體積 )% ml/min 柱溫 ? 峰面積 ( 微伏 * 秒) 691979 1 1(98) 1(0.8) 1(35) 1 684278 688128 649938 2 1 2(0.9) 2(40) 2 630134 640036 572059 3 1 3(1.0) 3(45) 3 582370 577214 696147 4 2(99) 1 3 3 692631 694389 634021 5 2 2 1 1

25、 630755 632388 527099 6 2 3 2 2 535073 531086 722053 7 3(100) 1 2 2 718200 720126 600423 8 3 2 3 3 614102 607262 553758 9 3 3 1 1 555289 554524 均值 1 635126.000 700881.000 608825.333 625013.333 均值 2 619287.667 626562.000 629649.667 630416.000 均值 3 627304.000 554274.

26、667 643242.667 626288.333 極差 15838.333 146606.333 34417.334 5402.667 分析 : 根據(jù)極差的大小，對(duì) 因素的主次進(jìn)行排隊(duì)。極差越大，表示該因素的水平變化對(duì)試驗(yàn)的影響越大，這個(gè)因素就越重要，反之，極差越小，這個(gè)因素就越不 、 B、 C三個(gè)因素中極差的大小，可以看出 B 因素即流動(dòng)相重要。比較本試驗(yàn)中 A 比例為最重要因素，其次為 C 因素即流速，而 A 因素即柱溫為不重要因素。直觀分析已大概分析出因素的主次，但還要通過方差分析進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，方差分析表如表 4 所示。 表 4 (

27、 δ+γ+α) 色譜峰峰面積方差分析表 變異來(lái)源 SS df F F αA流動(dòng)相比例 ( 甲醇體積 )% 376298086.889 2 7.864 B 流速 ml/min 32242189294.889 2 673.789 F(2,2)=19.00 0.05C 柱溫 ? 180275341.556 2 37.678 誤差 47852064.222 2 總變異 34469314787.560 8 分析 : 由表中數(shù)據(jù)可知， B因素存在極顯著差異， C 因素存在顯著差異， A 因素不存在顯著差異，即 B 因素、 C 因素為重要

28、因素， A 因素為次要因素。對(duì) B,C 兩因素進(jìn)行多重比較表 5 至表 7，用 LSR法。 表 5 峰面積多重比較用 SSR及 LSR值秩次距 K23 SSR 0.05 6.09 6.09 0.01 14.0 14.0 LSR 0.05 17198.557 17198.56 0.01 39536.912 39536.91 表 6 B 因素各水平均值多重比較 B因素 BBB123 均值 700881.000 626562.000 554274.667 顯著性 (1%) A B C 表 7 C 因素各水平均

29、值多重比較 C因素 CCC321 均值 643242.667 629649.667 608825.333 顯著性 (5%) a a b 分析 : 由圖知多重比較結(jié)果 B 因素以 B1 最好， C因素 C2和 C3無(wú)顯著差異則均 可以，但考慮到長(zhǎng)期用比較高的柱溫可能會(huì)影響色譜柱的使用壽命，故就峰面積這 一評(píng)定值來(lái)講，最優(yōu)組合為 B1 C2，A 因素不論。 2.2.1.2 以保留時(shí)間為評(píng)定值的結(jié)果分析過程 色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表 8 所示 4 表 8 色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 L(3) 9

30、 A B C 指標(biāo) 試驗(yàn)號(hào) 空列 流動(dòng)相比例 流速 δ 色譜峰 ( 甲醇體積 )% ml/min 柱溫 ? 保留時(shí)間 ( 分鐘 ) 15.795 1 1(98) 1(0.8) 1(35) 1 15.797 15.796 13.122 2 1 2(0.9) 2(40) 2 13.144 13.133 11.025 3 1 3(1.0) 3(45) 3 11.024 11.024 12.630 4 2(99) 1 3 3 12.603 12.617 10.529 5 2 2 1 1

31、10.507 10.518 10.796 6 2 3 2 2 10.808 10.802 10.313 7 3(100) 1 2 2 10.307 10.310 10.310 8 3 2 3 3 10.311 10.310 8.770 9 3 3 1 1 8.771 8.770 均值 1 13.318 12.908 12.303 11.695 均值 2 11.312 11.320 11.507 11.415 均值 3 9.797 10.199 10.617 11.317 極差 3.521 2.7

32、09 1.686 0.378 分析 : 比較本試驗(yàn)中 A、 B、C 三個(gè)因素中極差的大小，可以看 出 A 因素即流動(dòng)相比例為最重要因素，其次為  B 因素即流速，而  C 因素即柱溫為不 重要因素。通過方差分析進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，方差分析表如表  9 所示。 表 9( δ+γ+α) 色譜峰保留時(shí)間方差分析表變異來(lái)源 SS df F F α A 流動(dòng)相比例 ( 甲醇體積 )% 18.716 2 81.374 B 流速 ml/min 11.116 2 48.33 F(2

33、,2)=19.00 0.05C 柱溫 ? 4.265 2 18.543 誤差 0.230 2 總變異 34.330 8 分析 : 由表中數(shù)據(jù)可知， A 因素存在極顯著差異， B 因素存在顯著差異， C因素 不存在顯著差異，即 A 因素、 B 因素為重要因素， C 因素為次要因素。對(duì) A,B 兩因素進(jìn)行多重比較表 10 至表 12，用 LSR法。 表 10 保留時(shí)間多重比較用 SSR及 LSR值秩次距 K23 SSR 0.05 6.09 6.09 0.01 14.0 14.0 LSR 0.05 1.192 1.192 0.01

34、 2.741 2.741 表 11 A 因素各水平均值多重比較 A因素 AAA123 均值 13.318 11.312 9.797 顯著性 (5%) a ab b 表 12 B 因素各水平均值多重比較 B因素 BBB123 均值 12.908 11.320 10.199 顯著性 (5%) a b b 分析 : 因?yàn)榇朔讲罘治霰硪员Ａ魰r(shí)間為評(píng)定值，故保留時(shí)間越短越好。由圖知 多重比較結(jié)果 A 因素以 A3 最好，而 B 因素 B 和 B3 無(wú)顯著差異均可以，最后綜合 2 2

35、.2.1.1 和 2.2.1.2 的結(jié)果，最優(yōu)組合為 A3B2C2即流動(dòng)相為甲醇，流速為 0.9ml/min ，柱溫為 40?。 3 本章小結(jié) 本章通過對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例、流速、柱溫做單因素試驗(yàn)，然后選取合適 的水平做正交試驗(yàn)以研究出最佳色譜條件，結(jié)果表明 : 檢測(cè)波長(zhǎng)為 294nm，流動(dòng)相為甲醇，流速為 0.9ml/min ，柱溫為 40?為最佳色譜條件。 第三章 標(biāo)準(zhǔn)溶液的繪制 引 言 外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法，是所有定量分析中最通用的一種方法。因?yàn)? 相對(duì)比較簡(jiǎn)單，是實(shí)際工作中應(yīng)用最多的一種定量分析方法。測(cè)定方法為 : 把

36、待測(cè) 組分的純物質(zhì)配制成不同濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)系列，在一定操作條件下向色譜柱中注入 相同體積的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)得各峰的峰面積或者峰高，繪制 A-C 或 H-C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 然后在完全相同的條件下注入相同體積的待測(cè)樣品，根據(jù)所得的峰面積或者峰高從曲線上查的含量。本試驗(yàn)是選取峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量時(shí)，應(yīng)注意待測(cè)樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度范圍之內(nèi)，這樣才能獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)中測(cè)得的各種食用植物油的維 生素 E 含量，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為 1.0mg/ml,140mg/ml 。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)含有幾種成分時(shí)，而標(biāo)準(zhǔn)溶液為幾種成

37、分的混合溶液，應(yīng)先確定每種成分的保留時(shí)間，確定每種成分的出峰順序進(jìn)而確定是哪種成分。即先注入一定濃度的單一成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再注入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1 材料與方法 1.1 儀器與設(shè)備 紫外可見分光光度計(jì) UV-5200 上海元析儀器有限公司 Waters 高效液相色譜儀 e2695 帶 2489 紫外檢測(cè)器 美國(guó)沃特斯有限公司 1.2 方法 1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定 取維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)溶液三種組分的 1mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液各 100ul ，用無(wú)水乙醇分別稀釋定容至 5ml。按

38、《 NY/T 1598-2008 食用植物油中維生 素 E 組分和含量的測(cè)定 高效液相色譜法》給定的波長(zhǎng)和比吸光系數(shù)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各種形態(tài)維生素 E 的吸光度值。 1.1.2 儀器色譜條件 紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 294nm，流動(dòng)相為甲醇，流速 0.9ml/min ，柱溫 40?，進(jìn)樣量 10ul 。 1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 40ug/ml δ - 生育酚，α - 生育酚，γ - 生育酚單一成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，確定單一成分的保留時(shí)間。然后進(jìn)樣 1mg/ml、10mg/ml，40ug/ml ，60mg/ml， 100mg/ml，1

39、40mg/ml 的濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到各成分的回歸方程。 1.1.4 精密度試驗(yàn) 取 40ug/ml 維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣 6 次，并計(jì)算出濃度。 2 結(jié)果與分析 2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度 計(jì)算得 δ- 生育酚、α - 生育酚、γ - 生育酚的準(zhǔn)確濃度分別為 :0.9814mg/ml ， 1.0282mg/ml ，0.51185mg/ml 。 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 2.2.1 單一成分的色譜圖如圖 5。

40、 δ - 生育酚 γ- 生育酚 α - 生育酚圖 5 三種成分的圖譜 2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖 6 所示 圖 6 40ug/ml 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖 分析 : 由圖知 γ- 生育酚的響應(yīng)值最大，其次是 δ - 生育酚，且 γ- 生育酚和 δ - 生育酚響應(yīng)值差別很小，最小的是

41、 α - 生育酚 ; δ - 生育酚色譜峰的保留時(shí)間最 短 生育酚，最后是 α- 生育酚。 即最先出峰，其次是 γ- 2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系 三種成分的回歸方程如表 13 所示。 表 13 維生素 E 中各種生育酚標(biāo)樣的回歸方程維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)曲線 R 33δ - 生育酚 Y=5.2610X+2.6310 0.9985 33γ - 生育酚 Y=5.8110X+6.9210 0.9984 33α - 生育酚 Y=3.8510X+5.5310 0.9992 分析 : 根據(jù)表中數(shù)據(jù)可知維生素 E 的三

42、種單體的回歸方程線性相關(guān)系數(shù)均接近 ，故證明所配制標(biāo)液的線性關(guān)系良好。 于 1 2.3 精密度試驗(yàn) 取 40ug/ml 維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣 6 次，結(jié)果見表 14。表 14 精密度試驗(yàn)結(jié)果 樣品名稱 測(cè)定次數(shù) 實(shí)測(cè)范圍 RSD(%) δ - 生育酚 6 38.081,39.254 0.781 γ - 生育酚 6 40.258,41.054 0.809 α - 生育酚 6 41.127,42.043 1.19 分析 : 根據(jù)數(shù)據(jù)知相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差值都比較小，由此可以看出 Waters 高效液相色 譜儀

43、e2695 的重現(xiàn)性很好。 3 本章小結(jié) 本章進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果表明維生素 E 三種單體的色譜峰完全分離，回歸方程的線性很好， Waters 高效液相色譜儀 e2695 的重現(xiàn)性很好。 第四章 不同處理方法對(duì)維生素 E 含量測(cè)定的影響 引言 維生素 E 對(duì)人體生理功能有著很重要的作用 :? 抗氧化作用 : 有利于保 護(hù)生物膜，防止氧化劑對(duì)細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸、富含巰基德蛋白成分 ( 保護(hù)某些含巰基酶的活性 ) 以及細(xì)胞骨架和核酸的損傷 ;? 抗衰老以及防化學(xué)污染 ;? 可能與生殖功能有關(guān) ;? 維護(hù)機(jī)體正常免疫功能—對(duì) T 淋巴細(xì)胞

44、的功能十分重要。它廣泛存在于各種植物油中，因此分析其中的維生素 E 的含量很必要。 維生素 E 的高效液相色譜法原理是樣品經(jīng)堿溶液皂化提取處理后，使試樣 用有機(jī)溶劑提取不皂化物中的維生素 E，濃縮，高效中的天然生育酚釋放出來(lái)， 液相色譜 C18反相柱分離維生素 E，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，用外標(biāo)法定量。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)介紹皂化方法有加入堿液震蕩皂化和沸水浴回流皂化兩種方式，皂化劑濃度、皂化溫度和時(shí)間對(duì)于維生素 E 的解離有很重要的影響，所以震蕩皂化用低濃度 的氫氧化鉀皂化，而回流皂化則加入濃度較大的氫氧化鉀。游離的維生素 E 易被氧化，所以在皂化中加入一定量的抗壞血酸保護(hù)維生

45、素 E 不被氧化。皂化后用有機(jī)試劑提取，提取劑由石油醚和乙醚，石油醚主要用作溶劑級(jí)作為優(yōu)質(zhì)的抽提用，但是皂化法相對(duì)繁瑣，試劑用量較大。 也有文獻(xiàn)介紹超聲提取法測(cè)定維生素 E 含量，提取試劑有乙醇和正己烷，正己烷是食用植物油的提取劑。維生素 E 的化學(xué)性質(zhì)為在無(wú)氧條件下對(duì)熱穩(wěn)定，即使加熱至 200?也不易被破壞，但是它對(duì)氧十分敏感，易被氧化破壞，此外對(duì)堿和紫外線液較敏感。故本試驗(yàn)采用這些不同的處理方法并結(jié)合其化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行 快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的提取方法，以縮短分維生素 E 含量的測(cè)定，從而找出析時(shí)間。 1 材料與方法 1.1 材料 冷榨法油茶籽油由

46、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)糧油加工實(shí)驗(yàn)室提供。 1.2 化學(xué)試 劑 石油醚 分析純 天津市化學(xué)試劑研究所 正己烷 分析純 天津市化學(xué)試劑研究所 抗壞血酸 分析純 汕頭市西隴化工廠有限公司 氫氧化鉀 分析純 天津市博迪化工有限公司 無(wú)水硫酸鈉 分析純 衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司 1.3 儀器與設(shè)備電子分析天平 AR2140 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易 ( 上海 ) 有限公司氮?dú)獯祾邇x MD200-1 杭州奧盛儀器有限公司 微型旋渦混合儀 WH-2 上海瀘西分析儀器廠有限公司超聲波清洗器 DS2060 天津市東康科技有限公司電熱恒溫水浴鍋 武漢琴臺(tái)醫(yī)療器械廠 電動(dòng)離心機(jī) 80

47、-2 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠 多用調(diào)速震蕩器 HY-4 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠 超純水器 B110-B 長(zhǎng)沙源科儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司 真空干燥箱 DZF-6021AT 上海一恒科技有限公司 蛇形冷凝管 250ml 梨形分液漏斗 SAMDUK 孔徑 0.45un 有機(jī)過濾器 津隆 一次性使用無(wú)菌注射器 圣光醫(yī)用制品有限公司 1.4 方法 1.4.1 樣品前處理方法 1.4.1.1 震搖皂化法 稱取 5g 試樣于皂化瓶中，加入 30ml 無(wú)水乙醇，混合均勻。加入 5ml 抗壞

48、血酸 (100g/L) ，20ml 氫氧化鉀 (1g/L) ，混勻后蓋上塞子于振蕩器上震蕩皂化 1h。將皂 化后的試樣移入 250ml 梨形分液漏斗中，用一定量的水洗皂化瓶，水并入分液漏斗 中，然后用乙醚再次洗皂化瓶，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕震搖分液漏斗，注意 震搖幅度不能太大，因?yàn)槿菀壮霈F(xiàn)乳化現(xiàn)象而無(wú)法使試液分層，若出現(xiàn)少量乳化現(xiàn) 象，可加入幾滴乙醇，進(jìn)行破乳，用水洗滌乙醚層幾次，直至用 ) ，濾至 pH 試紙檢測(cè)洗滌后的水不顯堿性。將乙醚提取液過無(wú)水硫酸鈉 ( 約為 5g100ml 棕色容量瓶中，用一定量的乙醚沖洗分液漏斗，并入容量瓶中

49、，然后用乙 醚定容，搖勻后吸取 10ml 乙醚提取液于 50?氮?dú)獯祾邇x上吹至近干，立即加入 5ml 乙醇，于渦旋混合儀上混合均勻后轉(zhuǎn)入離心管中， 4000r/min 離心 10min，上清液 過 0.45um 有機(jī)相微孔濾器后上機(jī)測(cè)定。 1.4.1.2 回流皂化法 稱取  5g 試樣于皂化瓶中，加入  30ml 無(wú)水乙醇，混合均勻。加入  5ml  抗壞血酸 (100g/L)  ，10ml 氫氧化鉀 (500g/L)  ，混勻后于沸水浴上回流  30min，皂化完畢后立

50、 即用流水冷卻，皂化液馬上轉(zhuǎn)入分液漏斗中，因?yàn)榉胖脮r(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致提取時(shí)出 現(xiàn)乳化現(xiàn)象。其余步驟同 1.4.1.1 。 1.4.1.3 皂化處理法的不同處理方法 因?yàn)闊o(wú)水乙醇要經(jīng)過脫醛處理比較繁瑣，且在皂化過程中用量比較多，維生素 E 是一種良好的天然脂溶性維生素，所以試驗(yàn)有的處理采用甲醇取代乙醇 ; 提取劑 由石油醚和乙醚，但乙醚相對(duì)來(lái)說有毒，而且極易揮發(fā)，需進(jìn)行去除過氧化物的處 理，所以試驗(yàn)中采用兩種提取劑。綜合而言共有 8 中處理方式。 1.4.1.4 超聲提 取 有文獻(xiàn)介紹用乙醇和正己烷的樣品處理

51、方法，本試驗(yàn)方法為稱取 5g 樣品于 25ml 比色管中，加入 10ml 的提取劑，提取劑選用乙醇和正己烷。超聲提取 30min，然后定容至 50ml 棕色容量瓶中，搖勻后過 0.45um 有機(jī)相微孔濾器后上機(jī) 測(cè)定。 1h 取  1.4.1.5 10 種不同處理的從左至右依次為處理 1-10 ，結(jié)構(gòu)圖如圖 7 所示 : 樣 品 無(wú)水乙醇 甲 醇 無(wú)水乙醇 正己烷 震蕩皂化 1h 沸水浴回流 30min 震搖皂化 沸水浴

52、回流 30min 石油石油石油乙醚乙醚乙醚石油乙醚醚提醚提提取 醚提提取 醚提提取 提取 取 取 取 圖 7 10 種樣品處理方式 2 結(jié)果與分析 2.1 不同處理方法對(duì)維生素 E 含量測(cè)定的影響見表 15 表 15 不同處理方法對(duì) VE的測(cè)定結(jié)果影響 處理 δ- 生育酚 γ- 生育酚 α- 生育酚 相對(duì) VE 總含量 (mg/kg) 方法 (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) 誤差 0 0 27.317 272.679 1 0 0 30.029 299.673 286.17

53、6 9.43% 0.599 0 27.159 275.645 2 0.628 0 28.794 289.012 282.328 4.73% 0 0 24.467 244.445 3 0 0 24.508 240.771 242.61 1.52% 1.239 0 16.455 164.951 4 1.092 0 15.776 167.017 165.984 1.24% 0 0 28.404 282.122 5 0 0 31.935 308.318 295.22 8.87%

54、 0.643 0 28.331 284.79 6 0.688 0 26.443 269.141 276.966 5.65% 0 0 22.876 227.808 7 0 0 24.171 238.302 233.055 4.50% 1.926 0 25.681 272.823 8 1.737 0 24.685 252.099 262.461 7.90% 0 0 31.063 308.189 9 0 0 32.172 317.654 312.921 3.02% 0 0 32.573 323.961

55、 10 0 0 32.957 324.572 324.2625 0.19% 分析 : 由圖可知，第 10 種處理方式 即正己烷超聲提取測(cè)定出來(lái)的含量最高，相對(duì)誤差最小，反映出這種處理方式對(duì)維 生素 E 的影響不大。而皂化法因涉及蒸發(fā)、溶解、提取等步驟，易造成待測(cè)成分的 破壞及損失，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果相對(duì)偏低。所選用的茶油中維生素 E 主要成分為 α- 生 育酚，δ - 生育酚含量很少，且提取劑乙醚對(duì) δ- 生育酚可能提取效果不充分或者 有破壞作用，因?yàn)榧恿艘颐训奶幚砘旧衔礄z出 δ- 生育酚。 4 本章小結(jié) 本章通過不同的處理方式進(jìn)行

56、了植物油中的維生素 E 的測(cè)定，結(jié)果表明用正己 烷超聲提取的方法較好，維生素 E 損失較少，且方法簡(jiǎn)單快速。 第五章 各種食用植物油中維生素 E 含量的測(cè)定 引言 維生素 E 廣泛分布于動(dòng) 植物性食品之中，人體所需維生素 E 大多來(lái)自谷類和食用油脂，植物油是維生素 E 的主要來(lái)源，但各種植物油所含的生育酚的種類和數(shù)量也不一樣 : 如 β - 生育酚主 要存在于棉籽油中，α - 生育酚、γ - 生育 [7] 酚、δ - 生育酚在各種植物油中都不同 程度的存在。本試驗(yàn)測(cè)定不同植物油中維生素 E 的含量，為人們膳食提供參考。 1 材

57、料與方法 1.1 材料 冷榨法油茶籽油，水酶法油茶籽油，菜籽毛油，菜籽油由湖南農(nóng)業(yè) 大學(xué)糧油加工實(shí)驗(yàn)室提供。 初榨橄欖油 澳博蘭 1.2 化學(xué)試劑 正己烷 分析純 天津市化學(xué)試劑研究所 1.3 儀器設(shè)備 Waters 高效液相色譜儀 e2695 配 2489 紫外檢測(cè)器 美國(guó)沃特斯有限公司 超聲 波清洗器 DS2060 天津市東康科技有限公司 1.4 方法 樣品處理方法為 : 2 結(jié)果與分析 各種植物油中的維生素 E 的含量如表 16 所示。 3 本章小結(jié) 第六章 討論及展望參考文獻(xiàn) 致謝 作者簡(jiǎn)介