Western-blot原理和技術--課件

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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,醫(yī)學課件,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,醫(yī)學課件,*,讓我們把蛋白質看作具有獨特而奇妙性質的實體,Western blotting,醫(yī)學課件,1,讓我們把蛋白質看作具有獨特而奇妙性,為什么要作蛋白質印跡實驗？,研究一些體外的蛋白質分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當中,蛋白質的表達情況，上調或下調表達，在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達差異性。,醫(yī)學課件,2,為什么要作蛋白質印跡實驗？醫(yī)學課件2,定義：,印跡法（,blotting,）是指將樣品轉移

2、到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。,1975,年，,Southern,建立了將,DNA,轉移到硝酸纖維素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,雜交檢測特定的,DNA,片段的方法，稱為,Southern,印跡法。,而后人們用類似的方法，對,RNA,和蛋白質進行印跡分析，對,RNA,的印跡分析稱為,Northern,印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為,Western,印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為,Eastern,印跡法,Towbin,H.,et al.,(1979).Electrophoretic transfer of proteins

3、from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,4350-4354.,醫(yī)學課件,3,定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，,Western Blot,基本原理,在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。,醫(yī)學課件,4,Western Blot基本原理 在電場的作用下將電泳分,Western Blotting,方法一,:,直接法,優(yōu)點：,1.,快速（一種抗體）

4、,2.,沒有二抗交叉反應引起的非特異性條帶,缺點：,1.,免疫反應性降低,2.,無信號二級放大,3.,抗體標記費時昂貴,使用不方便,醫(yī)學課件,5,Western Blotting 方法一:直接法優(yōu)點：醫(yī),Western Blotting,方法二,:,間接法,優(yōu)點：,1.,免疫特異性不受標記影響,2.,信號放大靈敏度高（多個二抗結合位點）,3.,多種標記的二抗可供選擇,4.,可選擇不同的,Marker,缺點：,1.,交叉反應引起的非特異性條帶,2.,額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化,醫(yī)學課件,6,Western Blotting 方法二:間接法醫(yī)學課件,間接,Western Blotting,操作流程

5、,:,醫(yī)學課件,7,間接Western Blotting操作流程:醫(yī)學課件7,Western Blot,一般流程,蛋白樣品的制備,SDS,聚丙烯酰胺,凝膠電泳,轉膜,封閉,一抗雜交,二抗雜交,底物顯色,醫(yī)學課件,8,Western Blot一般流程蛋白樣品的制備轉膜醫(yī)學課件8,Western Blotting,設計選擇,分子量標準,內參,膜,轉膜和封閉,抗體,顯色,醫(yī)學課件,9,Western Blotting 設計選擇分子量標準醫(yī)學課件,不可小看“蛋白標準”,-,分子量標準的選擇,預混分子量標準,高分子量標準,低分子量標準,寬分子量標準,預染分子量標準,單色預染,多色預染,修飾分子量標準,醫(yī)

6、學課件,10,不可小看“蛋白標準”-分子量標準的選擇預混分子量標準醫(yī)學課,預混分子量標準,高分子量標準,低分子量標準,寬分子量標準,醫(yī)學課件,11,預混分子量標準高分子量標準醫(yī)學課件11,預染分子量標準,單色預染,多色預染,醫(yī)學課件,12,預染分子量標準單色預染醫(yī)學課件12,修飾分子量標準,糖基化,磷酸化,熒光標記,醫(yī)學課件,13,修飾分子量標準糖基化醫(yī)學課件13,不可不加,-,內參的選擇,原因：校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差,種類：,GAPDH,、,beta-actin,、,beta-tubulin,用法：,二抗孵育時加入,HRP,標記內參抗體,分子量相差不大,分子量大小相差比較明

7、顯,醫(yī)學課件,14,不可不加-內參的選擇原因：校正蛋白質定量、上樣過程中存在的,原料是基礎,-,膜,選擇種類,NC,PVDF,尼龍膜,選擇標準,a.,膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?b.,不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；,c.,后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜,醫(yī)學課件,15,原料是基礎-膜選擇種類醫(yī)學課件15,膜的特點,醫(yī)學課件,16,膜的特點 醫(yī)學課件16,抗體的選擇,作為,western,來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種

8、類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于,western,的抗體和用于,ELISA,的抗體，一般來說用于,western,的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于,ELISA,的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。,做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。,醫(yī)學課件,17,抗體的選擇作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要,八仙過海，各“顯”神通,-,顯色方法,化學顯色法,:,方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費抗體、反應慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測,化學發(fā)光法,:,靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應快、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測,同位素法,:,靈敏度高、不安全、環(huán)境污染、不方便和半衰期短,熒光底物法：,Krypton,熒光底物,醫(yī)學課件,18,八仙過海，各“顯”神通-顯色方法化學顯色法:方便、便宜,兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較,醫(yī)學課件,19,兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較醫(yī)學課件19,掌握,Western blotting,的原理和主要步驟。,謝謝,醫(yī)學課件,20,掌握Western blotting的原理和主要步驟。謝謝醫(yī),