細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥

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1、 2 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 是 指 通 過 實(shí) 驗(yàn) 方 法 ， 人 工 地 把 人 們 想要 研 究 的 動(dòng) 物 或 人 類 基 因 ， 或 者 是 有 經(jīng) 濟(jì) 價(jià) 值 的藥 物 蛋 白 質(zhì) 基 因 等 ， 通 常 稱 為 外 源 基 因 ， 導(dǎo) 入 動(dòng)物 的 受 精 卵 （ 或 早 期 胚 胎 細(xì) 胞 ） ， 使 之 與 動(dòng) 物 本身 的 基 因 組 整 合 在 一 起 ， 這 樣 外 源 基 因 能 隨 細(xì) 胞的 分 裂 而 增 殖 ， 并 能 穩(wěn) 定 地 遺 傳 給 下 一 代 的 一 類動(dòng) 物 。 外 源 目 的 基 因 的 制 備外 源 目 的 基 因 有 效 導(dǎo) 入 生 殖 細(xì) 胞

2、或 胚 胎 干 細(xì) 胞選 擇 獲 得 攜 有 目 的 基 因 的 細(xì) 胞選 擇 合 適 的 體 外 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 和 宿 主 動(dòng) 物轉(zhuǎn) 基 因 細(xì) 胞 胚 胎 發(fā) 育 及 鑒 定篩 選 所 得 的 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 品 系 以 綠 色 熒 光 蛋 白 轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠 為 例 ： Gene construct pEGFP- N1 載 體 是 一 種 把 異 源 性 的 蛋 白 質(zhì) 融 合 至 EGFP 的 N端 的 哺 乳 動(dòng) 物 表達(dá) 載 體 ， 含 有 人 類 巨 細(xì) 胞 病 毒 （ CMV） 啟 動(dòng) 子 ， SV40 Poly A 尾 ， pUC 復(fù)制 起 始 點(diǎn) （ 原 核 ）

3、和 SV40 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) （ 真 核 ） ， 20 個(gè) 多 克 隆 位 點(diǎn) ， 具 有篩 選 標(biāo) 志 卡 那 霉 素 （ 原 核 ） 和 新 霉 素 （ 真 核 ） 的 抗 性 基 因 。 異 源 性 蛋 白 與 E GFP 閱 讀 框 一 致 地 克 隆 入 pEGFP-N1， 形 成 的 表 達(dá) 重 組 體 在 CMV 啟 動(dòng) 子 啟動(dòng) 下 ， 表 達(dá) EGFP 和 目 標(biāo) 蛋 白 的 融 合 蛋 白 。 波 長 490 nm的 紫 外 線 激 發(fā) 后 ， 可在 熒 光 顯 微 鏡 下 ,觀 察 到 綠 色 熒 光 ， 在 多 種 異 源 生 物 中 表 達(dá) 且 無 細(xì) 胞 毒 性

4、 。 microinjection 受 精 卵 準(zhǔn) 備胚 胎 操 作 過 程 顯 微 注 射 假 孕 母 鼠 準(zhǔn) 備 (養(yǎng) 母 ) 胚 胎 移 植 BiopsyPCR analysisSouthern blot (9.5 dpc) GFP+, GFP- embryos GFP+ tail GFP-, GFP+ mice 第 一 階 段 ： 方 法 的 建 立 第 二 階 段 ： 轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠 模 型 及 快 速 生 長 家 畜 半 乳 糖 轉(zhuǎn) 移 酶第 三 階 段 ： 異 種 器 官 移 植 (pig)和 乳 腺 反 應(yīng) 器 2021-4-27 細(xì) 胞 工 程 13 2021-4-27

5、細(xì) 胞 工 程 14 1.可 靠 性 高 、 重 復(fù) 性 好2.對 于 小 鼠 來 說 ， 產(chǎn) 生 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 的 效 率 比 較 高3.導(dǎo) 入 DNA片 段 的 大 小 和 類 型 不 受 限 制4.轉(zhuǎn) 基 因 在 代 與 代 之 間 傳 遞 的 穩(wěn) 定 性 好5.整 合 位 點(diǎn) 的 隨 意 性 可 能 對 轉(zhuǎn) 基 因 表 達(dá) 造 成 影 響6.可 能 會(huì) 出 現(xiàn) 不 希 望 的 插 入 突 變7.開 發(fā) 裝 置 和 技 術(shù) 的 花 費(fèi) 大 時(shí) 間 長 2021-4-27 細(xì) 胞 工 程 15 顯 微 注 射 法 獲 得 轉(zhuǎn) 基 因 鼠 的 成 活 率 2021-4-27 細(xì) 胞 工

6、 程 16 利 用 脈 沖 電 場 提 高 細(xì)胞 膜 的 通 透 性 ， 從 而使 外 源 DNA轉(zhuǎn) 移 至 細(xì)胞 中 。 此 法 簡 單 、 效率 較 高 ， 廣 泛 應(yīng) 用 于培 養(yǎng) 細(xì) 胞 的 基 因 轉(zhuǎn) 移 。電 穿 孔 法 實(shí) 現(xiàn) 外 源 基 因 的 轉(zhuǎn) 移 轉(zhuǎn) 錄 啟 動(dòng) 子 2021-4-27 細(xì) 胞 工 程 18 缺 點(diǎn) ：1. 低 拷 貝 數(shù)2. 需 要 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒3. 插 入 DNA大 小 有 限4. 可 能 產(chǎn) 生 不 希 望 的 重 組5. 高 頻 的 鑲 嵌 現(xiàn) 象6. 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 的 序 列 可 能 干 擾 轉(zhuǎn) 基 因 表 達(dá) 2021-4-27 細(xì)

7、 胞 工 程 22 酵 母 人 工 染 色 體 ( )載 體 是 近 年 發(fā) 展 起 來 的 新型 載 體 , 它 能 克 隆 百 萬 對 堿 基 的 大 片 段 DNA。作 為 制 作 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 載 體 具 有 以 下 一 般 把 目 的 片 段 在 器 官 或 組 織 中 表 達(dá) 的 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物叫 動(dòng) 物 生 物 反 應(yīng) 器 （ bioreactor） ， 幾 乎 任 何 有 生 命的 器 官 、 組 織 或 其 中 一 部 分 都 可 經(jīng) 過 人 為 馴 化 為 生 物反 應(yīng) 器 ,從 生 產(chǎn) 的 角 度 考 慮 ， 生 物 反 應(yīng) 器 選 擇 的 組 織和 器 官 要

8、 方 便 產(chǎn) 物 的 獲 得 ， 例 如 ， 乳 腺 、 膀 胱 、 血 液等 ， 由 此 發(fā) 展 了 動(dòng) 物 乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器 ,動(dòng) 物 血 液 生 物反 應(yīng) 器 和 動(dòng) 物 膀 胱 生 物 反 應(yīng) 器 等 。 其 中 ， 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器 的 研 究 最 為 引 人 注 目 。 GenPharm公 司 用 轉(zhuǎn)基 因 牛 治 療 肺 氣 腫 病 ） 1999年 ， 只 有 三 種 產(chǎn) 品 進(jìn) 入 臨 床 實(shí) 驗(yàn) ； 到 2009年 ，已 經(jīng) 有 70多 種 進(jìn) 入 臨 床 實(shí) 驗(yàn) 或 即 將 進(jìn) 入 市 場 。 2021-4-27 細(xì) 胞 工 程 28

9、應(yīng) 用 重 組 DNA 技術(shù) 和 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) ,先將 外 源 基 因 置 于 乳 腺特 異 性 調(diào) 控 序 列 之 下 ,再 將 該 基 因 轉(zhuǎn) 移 到 尚處 于 原 核 階 段 或 1 2細(xì) 胞 的 受 精 卵 的 動(dòng) 物胚 胎 中 ,經(jīng) 胚 胎 移 植得 到 轉(zhuǎn) 基 因 乳 腺 表 達(dá)的 動(dòng) 物 個(gè) 體 ,通 過 回收 乳 汁 獲 得 表 達(dá) 產(chǎn) 物 。 動(dòng) 物 乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建 制 備 乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器 的 關(guān) 鍵 是 保 證 目 的 蛋 白特 異 性 在 乳 腺 中 的 高 效 表 達(dá) ， 傳統(tǒng) 表 達(dá) 載 體 都 是 選 用 某

10、 種 乳 蛋 白 基 因 的 調(diào) 控 序 列 作為 啟 動(dòng) 子 元 件 。 這 些 基 因 的 調(diào) 控 區(qū) 主 要 包 括 啟 動(dòng) 子區(qū) 、 增 強(qiáng) 子 序 列 和 其 他 眾 多 轉(zhuǎn) 錄 、 翻 譯 相 關(guān) 元 件 。 2021-4-27 細(xì) 胞 工 程 30 目 前 已 克 隆 并 用 作 構(gòu) 建 載 體 的 乳 蛋 白 基 因 有 ： -乳 球 蛋 白 (BLG)基 因 、 Sl-酪 蛋 白 基 因 、 -酪 蛋 白 基 因 、 乳 清 酸 蛋 白 (WAP)及 乳 清 白 蛋 白 基 因 。 牛 的 -乳 球 蛋 白 （ BLG） 基因 ， 該 基 因 非 常 穩(wěn) 定 ， 并 能 在

11、乳 腺 中 特 異 性 表 達(dá)乳 清 酸 蛋 白 2006年 6月 2日 上 市 。 治 療先 天 性 抗 凝 血 酶 缺 失 癥 病 ， 我 國 2008年 11月 首次 用 乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器 獲 得 抗 凝 血 酶 蛋 白 純 品 -乳 球 蛋 白（ 人 體 器 官 的 最 佳 替 補(bǔ) 無 論 體 積 大 小 ， 還是 外 觀 形 狀 ， 甚 至 結(jié) 構(gòu)功 能 ， 與 人 體 器 官 最 相似 的 應(yīng) 屬 豬 的 器 官 。 因此 ， 豬 被 視 為 異 體 器 官移 植 的 理 想 “ 替 補(bǔ) ” 。 移 植 難 題 豬 體 內(nèi) 存 在 兩 個(gè) -1， 3 半 乳 糖 轉(zhuǎn) 移

12、酶 (GT)基 因 )， “ GT” 基 因 控 制 半 乳 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 產(chǎn) 生 ，這 種 酶 使 豬 細(xì) 胞 表 面 形 成 一 種 標(biāo) 記 性 的 多 糖 。 當(dāng)豬 器 官 或 細(xì) 胞 被 移 植 給 人 體 時(shí) ， 人 類 免 疫 系 統(tǒng) 能識 別 這 種 糖 ， 從 而 產(chǎn) 生 強(qiáng) 烈 的 排 異 反 應(yīng) ， 把 移 植的 器 官 或 細(xì) 胞 視 作 外 來 異 物 進(jìn) 行 攻 擊 。 使 器 官 在數(shù) 小 時(shí) 之 內(nèi) 死 亡 。 解 決 方 案 目 前 ， 科 學(xué) 家 已 經(jīng) 敲 除 了 轉(zhuǎn) 基 因 克 隆 豬 體 內(nèi) 的 一個(gè) “ GT” 基 因 ， 另 一 個(gè) “ GT” 基 因 尚 有 待 攻 克 。 Lai et al 2002, Science. (GT out pig) 下 一 步 研 究 方 向 1. 將 培 養(yǎng) 出 的 小 豬 兩 兩 配 對 ， 由 此 進(jìn) 一 步 繁 殖出 體 內(nèi) 兩 個(gè) “ GT” 基 因 均 無 功 能 的 小 豬 。 2. 從 兩 個(gè) “ GT” 基 因 均 無 功 能 的 豬 身 上 取 下 各種 器 官 ， 移 植 到 人 類 以 外 的 靈 長 目 動(dòng) 物 身 上 。 3. 動(dòng) 物 試 驗(yàn) 若 能 成 功 ， 人 體 臨 床 實(shí) 驗(yàn) 將 有 望 啟動(dòng) 。