動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器

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1、上節(jié)課我們學(xué)了什么？ 問題 生物反應(yīng)器 生物反應(yīng)器的一些概念 生物反應(yīng)器的基本類型 第二章 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用 生物反應(yīng)器 學(xué)時(shí)： 2節(jié)課 主要內(nèi)容： 常用培養(yǎng)方法 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物放大器 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 開始于 上世紀(jì)初 1962年 , 其 規(guī)模逐漸擴(kuò)大 , 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī) 學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法 (生產(chǎn) 酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗 等 )。 相關(guān)知識(shí)介紹 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的 生物制品 已占 世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的 50% 。 發(fā)展： 在過去幾十年來，從使用轉(zhuǎn)瓶 (roller bottle) 、 CellCube

2、等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生 物反應(yīng)器（ Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。 一是在工藝生產(chǎn)時(shí)不能大規(guī)模制備產(chǎn)品； 二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性 三是難以對(duì)同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。 第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！ 隨著生物技術(shù)的發(fā)展， 迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞 培養(yǎng) ，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。 采用 玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng) 方法， 已不能 滿足 所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。 自 70年代以來，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 有 空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無(wú)泡 攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器 等。 80年代以來，人們逐漸開始 以生物反應(yīng)器培養(yǎng) 代替鼠腹水 的方法

3、獲得單克隆抗體。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) ： （ large-scale culture technology） 定義： 指在人工條件下（設(shè)定 pH、溫度、 溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大 量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù) 。 通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類 動(dòng)物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法 雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì) 胞 人二倍體細(xì)胞 cho（中華倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞 BHK-21(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 ) Vero細(xì)胞 (非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依 賴的成纖維細(xì)胞 )等。 可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞 個(gè)性化培養(yǎng)基是胞細(xì)培養(yǎng)基的發(fā)展方向 圖 8.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 圖 8.3 細(xì)胞工廠 Sp

4、inner培養(yǎng)系統(tǒng) 口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、 脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒 疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、 及 干擾素、血纖維 蛋白溶酶原激活劑、凝血因子 和 、促紅細(xì)胞 素、松弛素、生長(zhǎng)激素、蛋白 C、免疫球蛋白、 尿激酶、激肽釋放酶及 200種單克隆抗體等。 目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品： 6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖 50代即退化死亡 第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法 動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性： 1.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素 2.細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差 3.需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌 4.群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性） 5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成

5、本高 非貼壁依賴型細(xì)胞： 無(wú)需附著于固相表面 即可生長(zhǎng)，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許 多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 依據(jù)在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)依賴性差異， 動(dòng)物細(xì)胞可分為兩類： 貼壁依賴型細(xì)胞： 需要附著于帶適量電荷 的固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，大多數(shù)動(dòng)物 細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì) 胞均屬于這一類。 “貼壁單核”細(xì)胞培養(yǎng) 貼壁的單核細(xì)胞 貼壁細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)的人參愈傷組織 知識(shí)回顧 一般步驟： 無(wú)菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈 以鋒利無(wú)菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊 將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細(xì)胞。 低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)步驟

6、植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)流程 懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 提取純化 產(chǎn)物 脫分化： 離體植物器官、組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時(shí)間 后，會(huì)通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織（細(xì)胞排列疏松而無(wú) 規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）。 收集細(xì)胞 藥物制劑 通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長(zhǎng)春堿、洋地黃、 紫草素、人參皂甙等 大 規(guī) 模 動(dòng) 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 工 藝 流 程 圖 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 提取 細(xì)胞 誘生劑 細(xì)胞 產(chǎn)品（腫瘤抗原） 純化 產(chǎn)品（干擾素） 純化 提取 產(chǎn)品（單克隆抗體） 濃縮純化 7 9 8 6 5 4 3 2 1 10 大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法： 貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) 固定化培養(yǎng) 一、貼壁培養(yǎng)（

7、attachment culture） 細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 1、 生長(zhǎng)特性 ：貼壁依賴型細(xì)胞在 培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上， 細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始 有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成 致密的細(xì)胞單層。 貼壁培養(yǎng)細(xì) 胞轉(zhuǎn)瓶機(jī) 2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 容易更換培養(yǎng)液： 細(xì)胞緊密黏附于固相表面， 可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。 容易采用 灌注培養(yǎng) ，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的 目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。 當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)， 很多細(xì)胞將更有效 的表達(dá)一種產(chǎn)品 。 同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液 /細(xì)胞的比例 。 適

8、用于所有類型細(xì)胞 。 灌注培養(yǎng) 3、貼壁培養(yǎng)的 缺點(diǎn)： 與懸浮培養(yǎng)法相比， 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大； 不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)； 4、 細(xì)胞貼壁的表面： 要求具有 凈陽(yáng)電荷和高度表面活性 。 對(duì)微載體而言還要求具一定電荷密 度；若為有機(jī)物表面，必須具有親 水性，并帶陽(yáng)電荷。 5、 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)： 主要有 轉(zhuǎn)瓶 、 中空纖維 （后面專題介紹）、 玻璃珠 、 微載體系統(tǒng) （后面介紹）等。 貼壁培養(yǎng)細(xì) 胞轉(zhuǎn)瓶機(jī) 細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)： 為 最初采用 系統(tǒng)，一般用 于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的 過 渡階段 ，或作為生物反應(yīng)器接 種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞 接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器 轉(zhuǎn)

9、瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不 斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng) 液和空氣，從而提供較好的傳 質(zhì)和傳熱條件。 轉(zhuǎn)瓶機(jī) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點(diǎn) 勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單 位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積 小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí) 監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制。 優(yōu)點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù) 成熟，重復(fù)性好，放大只 需簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。 缺點(diǎn)： 二、 懸浮培養(yǎng) （ suspension culture） 指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過 程。主要用于 非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng) ， 如雜交瘤細(xì)胞等，是在微生物發(fā)酵的基 礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 小規(guī)模懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)瓶 用 已知人源或動(dòng)物來源的蛋白或激素代 替動(dòng)物血清 的一種

10、細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能 減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正 逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。 無(wú)血清懸浮培養(yǎng) 三、固定化培養(yǎng) （ immobilization culture） ： 將 動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來 ， 再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具 有 細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，抗剪切力和抗污染能 力強(qiáng) 等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開，有利于 產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括 吸附 法、共價(jià)貼附法、離子 /共價(jià)交聯(lián)法、包 埋法、微囊法 等。 1、吸附法 : 用 固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使 細(xì)胞固定化 的方法稱為吸附法（ adhesion）。 操作簡(jiǎn)便、條件溫和、是動(dòng)物細(xì)胞固定化中 最早研究使用

11、的方法。 缺點(diǎn)： 載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落 。 微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表， 稍后專門介紹。 2、共價(jià)貼附法 : 利用 共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合 的固定化方法 稱為共價(jià)貼附法 （ attachment by covalent bonding）。 此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須 引入化學(xué)試 劑，對(duì)細(xì)胞活性有影響 ，且因貼附而導(dǎo)致 擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。 3、離子 /共價(jià)交聯(lián)法 : 雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會(huì)在細(xì) 胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用 ，此固定 化細(xì)胞方法稱為離子 /共價(jià)交聯(lián)法 （ cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會(huì)使

12、一些細(xì)胞死亡， 也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散限制。 4、包埋法 : 將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞 的 方法稱為包埋法（ entrapment）。 優(yōu)點(diǎn) ：步驟簡(jiǎn)便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞 泄漏少，抗機(jī)械剪切。 缺點(diǎn) ：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基 質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi) 部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常 用載體為多孔凝膠，如 瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝 膠和血纖維蛋白 。 石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋法 甲基丙烯酸甲酯包埋標(biāo)本 微囊型包埋法 5、微囊法（ microencapsulation） : 用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀 的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物

13、質(zhì)及 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜 ；囊內(nèi)是種微小 培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少 受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。微囊直徑 控制在 200-400m 為宜。 第二節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式 深層培養(yǎng)可分為 : 分批式 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式 連續(xù)式 灌注式 一、分批式培養(yǎng)（ batch culture） 較早期 的方式，采用 機(jī)械攪拌式生物 反應(yīng)器 ，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后， 一次性轉(zhuǎn)入 生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) 一次性收獲 細(xì) 胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。 特點(diǎn) : 操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小 直觀反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程。 可直接放大。 細(xì)胞的生長(zhǎng)分：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減 速期、平穩(wěn)

14、期和衰退期 五個(gè)階段 。 分批培養(yǎng)的 周期多在 3-5天 ， 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力 學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（ 48-72h） 細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗 竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰 退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。 收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng) 死亡后進(jìn)行 。 二、流加式培養(yǎng) （ feeding culture） 細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為 終體積的 1/2 1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù) 細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流 加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基， 通常在細(xì)胞 進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整 個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃 縮、純化目標(biāo)蛋白 。 1、流加培

15、養(yǎng)物的方式 流加的時(shí)間通常在 指數(shù)生長(zhǎng)后期 ，細(xì)胞進(jìn)入衰退 期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 可以添加一次， 也可添加多次，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn) 行添加 。 流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn) 定的培養(yǎng)環(huán)境 ， 營(yíng)養(yǎng)成分既不過剩 而產(chǎn)生大量的 代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降而成為無(wú)效的 利用； 也不缺乏 導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。 2、流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分（三大類）： 葡萄糖 ： 供能物質(zhì)、碳源物質(zhì) ， 濃度較高則產(chǎn) 生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，以 足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的 濃度為佳。 谷氨酰胺 ： 供能物質(zhì)、氮源物質(zhì) ， 需要控制濃度。 大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡

16、， 谷氨酰胺的耗竭是最常 見的凋亡原因 。 氨基酸、維生素及其他： 必需氨基酸、非必需氨 基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨 酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽 堿、生長(zhǎng)刺激因子。 三、 半連續(xù)式培養(yǎng) （ semi-continuous culture） 1、又稱重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。 采用機(jī) 械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。 在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中， 每間隔一 段時(shí)間， 從中取出部分培養(yǎng)物 ， 再用新的 培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積 ，使反應(yīng)器內(nèi)的總 體積不變 。 2、半連續(xù)式特點(diǎn)： 培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進(jìn)行多次收獲； 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在 一

17、較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生 產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一 直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生 產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。 四、連續(xù)式培養(yǎng) （ continuous culture） 1、 常見的懸浮培養(yǎng)模式： 采用機(jī)械攪拌式 生物反應(yīng)器系統(tǒng) 。 在細(xì)胞達(dá)最大密度之前， 以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培 養(yǎng)基 （ 防止衰退期出現(xiàn) ）；同時(shí)， 含有細(xì) 胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流 出，以保持培養(yǎng)體積的恒定 。理論上講， 該過程可無(wú)限延續(xù)下去。 2、連續(xù)式培養(yǎng)的 特點(diǎn) ： 細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)； 產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)；

18、 可控制衰退期與下降期。 連續(xù)式培養(yǎng) 3、 優(yōu)點(diǎn)： 培養(yǎng)狀態(tài)恒定 ，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。 穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng) 分批培養(yǎng)中的 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 。 在穩(wěn)定狀態(tài)下 細(xì)胞所處的環(huán)境條件可維持不變 （ 如 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以 及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率） 。 細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響 ，特 別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰 胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用 效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。 4、 不足 ： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)， 容易 造成污染 ； 在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及 分泌產(chǎn)物 容易變異 ； 對(duì)設(shè)備、儀器的

19、控制技術(shù) 要求較 高 。 五、灌流式培養(yǎng) （ perfusion culture） 1、把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞 增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中， 不斷地將 部分條件培 養(yǎng)基取出 ， 同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基 。 它與半連續(xù)式操作的不同之處在于 取出部分條件培 養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi) ，而半連 續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。 一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞， 這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞 截留系統(tǒng)開始多采用 微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜 系統(tǒng) ，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng) 或透析系統(tǒng)。 如：中空纖維生物反應(yīng)器 灌流式培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要有兩種形式： 中

20、空纖維半透膜 可透過小分子量的產(chǎn)物和底物 ， 截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物 ，在連續(xù)灌流過程 中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年中空纖 維生物反應(yīng)器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的 生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。 中空纖維反應(yīng)器示意圖 細(xì)胞 培養(yǎng)基出口 空氣與 CO2出口 空氣與 CO2入口 培養(yǎng)基入口 固定床 是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐， 中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著 在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維 之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使 培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成 分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度 較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)。 流 化床生物反應(yīng)器 是通過流體的上升運(yùn) 動(dòng)

21、使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反 應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。 另一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器 軸向絕熱式 徑向絕熱式 列管式 固定床反應(yīng)器 ： 氣體流經(jīng)固定不動(dòng)的催 化劑床層進(jìn)行催化反應(yīng) 的裝置 流化床反應(yīng)器： 固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左 右劇烈運(yùn)動(dòng)和翻動(dòng)，好象是液體沸騰一樣，故 流化床反應(yīng)器又稱沸騰床反應(yīng)器。 1 旋風(fēng)分離器 2 筒體擴(kuò)大段 3 催化劑入口 4 筒體 5 冷卻介質(zhì)出口 6 換熱器 7 冷卻介質(zhì)進(jìn)口 8 氣體分布板 9 催化劑出口 10 反應(yīng)氣入口 2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞截流系統(tǒng)可使 細(xì)胞或酶 保留在反應(yīng)器 內(nèi)， 維持較高的細(xì)胞密度 ， 一般可達(dá) 10

22、7- 109/ml，從而較大的 提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量 ； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的 營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中， 有害代謝廢物濃度積累較低 ； 反應(yīng)速率容易控制 ， 培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提 高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低 溫下保存， 有利于保持產(chǎn)品的活性。 六、細(xì)胞工廠培養(yǎng) 聚苯乙烯材料，無(wú)菌， 長(zhǎng)度 335mm，寬度 205mm 這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培 養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯制成， 使用后可隨意處理。其最大缺點(diǎn)是：經(jīng)胰 酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大 規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān) 鍵

23、在于能否設(shè)計(jì)出合適的 生物反應(yīng)器。首先 必須滿 足在低剪切力及良好的混 合狀態(tài)下，能夠提供充足 的氧以供細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞 進(jìn)行產(chǎn)物的合成 。 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 罐 一、生物反應(yīng)器分類 1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器 ：如攪拌反應(yīng)器、中 空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、 氣升式反應(yīng)器； 2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器 ：如攪拌反應(yīng)器（微 載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反 應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器； 3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器 ：如流化床反應(yīng)器、 固化床反應(yīng)器。 按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，可分 三類 ： 二、 攪拌罐生長(zhǎng)反應(yīng)器 最經(jīng)典、最早被采用。針 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)， 采用了不同的攪拌器及通 氣方式。通

24、過攪拌器的作 用 使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液 中均勻分布，使養(yǎng)分充分 被細(xì)胞利用，并增大氣液 接觸面，有利于氧的傳遞 。 三、氣升式生物反應(yīng)器 1979年首次成功應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行了動(dòng) 物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)： 罐內(nèi)液體流動(dòng)溫和均勻，產(chǎn)生 剪切力小 ，對(duì)細(xì) 胞損傷較??； 可直接噴射空氣供氧，因而 氧傳遞率較高 ； 液體循環(huán)量大， 細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布 于培 養(yǎng)液中； 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，利于密封并 降低了造價(jià) 。 四、鼓泡式生物反應(yīng)器 與氣升式反應(yīng)器相類似， 是 利用氣體鼓泡來進(jìn)行 供氧及混合 ，其設(shè)計(jì)原 理與氣升式生物反應(yīng)器 也相同。 五、中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮

25、細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于 貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)： 占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密 度可達(dá) 109數(shù)量級(jí)； 生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞 培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用 于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。 板框式中空纖維反應(yīng)器 液營(yíng)養(yǎng) 中空纖維板 注意幾個(gè)問題： (一 )細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 (1)氨離子 ：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是 提高細(xì)胞密度的主要限制因素。 (2)乳酸 ：高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長(zhǎng) (3)二氧化碳 ：二氧化碳積聚，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性 作用或者改變細(xì)胞代謝水平。 (4)甲基乙二醛 (Mc)： 對(duì)細(xì)胞有潛在的損傷作用 (5)滲透壓 ：恒定、適宜 (6)載體 ：可考慮 采用多孔徑載體 替代容易使細(xì) 胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷

26、的常規(guī)載體。 (二 )細(xì)胞死亡與凋亡 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是 個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì) 胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少 是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是 細(xì)胞凋亡。 用基因工程方法將 bcl 2基因這種細(xì)胞凋 亡抑制基因?qū)爰?xì)胞， bcl 2基因的過量表達(dá) 能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn) 量。 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過“細(xì)胞靜止 ”過程來降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。 (三 ) 培養(yǎng)基與細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長(zhǎng)、增殖的重要 因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后， 無(wú)血清培養(yǎng) 基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題 。 無(wú)血

27、清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免血清的批次、質(zhì)量 、成分等對(duì)細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品 純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制 品的應(yīng)用領(lǐng)域中， 優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基的成分 可使 不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目的產(chǎn)物 的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。 (四 )過程監(jiān)控 測(cè)量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長(zhǎng)期生產(chǎn)病毒 到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間 ； 用在線葡萄糖分析儀的測(cè)定調(diào)整灌流速度； 測(cè)定氧消耗估計(jì)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷； 測(cè)定氧吸收速率估測(cè) ATP的形成； 測(cè)量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等 均得以應(yīng)用。 測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中 二氧化碳呼出率

28、計(jì)算呼吸商。一般來說，呼吸商 應(yīng)接近 1.0，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消 耗和二氧化碳排出。 用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋 白質(zhì)含量測(cè)定。另外，用在線蛋白分解與反相色 譜監(jiān)測(cè)重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。 計(jì)數(shù)法 (細(xì)胞運(yùn)輸 ) 當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，也在國(guó) 際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。 一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，較麻煩 ，且不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，是 當(dāng)前多采用的方法。 具體方法： 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液 充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞 ，保留微量空氣?？諝饬袅窟^

29、多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動(dòng) 對(duì)細(xì)胞有干擾作用。 一般經(jīng) 4 5天運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞活力無(wú)大影響。時(shí)間過長(zhǎng) ,細(xì) 胞活力下降。到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生 長(zhǎng)所需的液體量。置 37攝氏度培養(yǎng)，次日傳代。 十一 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上代表 了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。 1952年，蓋爾 (Gey)首先成功地建立世界 上第一個(gè)細(xì)胞系 子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系， 并且使惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的 細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要體現(xiàn)在以 下幾個(gè)方面： (1)在培養(yǎng)的腫瘤 細(xì)胞類型 上，從間充質(zhì)源性的細(xì)胞 轉(zhuǎn)向上皮源

30、性細(xì)胞，再由神經(jīng)外胚層源性到造血 細(xì)胞源性的發(fā)展歷程。 (2)在 方法 上，從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細(xì)胞系 的建立的發(fā)展過程。 (3)培養(yǎng)液成分 上，由純血清培養(yǎng)基到含血清、再到 無(wú)血清培養(yǎng)基三個(gè)階段。 (4) 生物學(xué)特性 上，經(jīng)歷了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水 平，再到酶和分子水平的發(fā)展。 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后，能在體外繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞即為細(xì)胞系。然而，這并 不意味著細(xì)胞能永久生長(zhǎng)。可能過了若干代 后，由于微生物污染、細(xì)胞分化成熟、細(xì)胞 不適應(yīng)外界環(huán)境等因素影響而喪失分裂能力 。根據(jù)細(xì)胞分裂能力，可分為有限細(xì)胞系與 無(wú)限細(xì)胞系兩類。一般認(rèn)為，如果細(xì)胞能在 體外培養(yǎng)超過 50代，培養(yǎng)時(shí)間超過一年

31、，而 且細(xì)胞的倍增時(shí)間保持穩(wěn)定時(shí)，就可以認(rèn)為 建系成功 。 人上皮型鼻咽癌 CNE-2細(xì)胞系為例 建系過程： (1)取材 (2)原代培養(yǎng) (3)建 系過程 組織塊在接種 1周后，上皮細(xì)胞從組織塊周圍向外迅速遷 移和生長(zhǎng)。 2周后，可見成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。 8周后，上皮細(xì) 胞生長(zhǎng)開始明顯加快 . 細(xì)胞在傳代三次后 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮 狀。 2周后細(xì)胞形成群落。第 4代后細(xì)胞開始呈單層生長(zhǎng) , 命名為 CNE-2。 經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細(xì)胞系建立成功 . 六、生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大設(shè)計(jì)的總體考慮 結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，能耐受蒸汽滅菌，采用對(duì)生物催化劑無(wú)害 和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無(wú)死角，內(nèi)部附件盡量減少， 以 維持純種培養(yǎng)需要 ； 有良好的氣 -液接觸和液 -固混和性能和熱量交換性能， 使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進(jìn)行 ； 保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下， 盡量節(jié)省能源消耗 ； 減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以 提高裝料系數(shù) ，并 有必要可靠的 參數(shù)檢測(cè)和控制儀表 并能與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)。 一種新的生物技術(shù)產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生 產(chǎn)的開發(fā)過程中，會(huì)遇到生物反應(yīng)器的逐 級(jí)放大問題，每一級(jí)約放大 10 100倍。生 物反應(yīng)器的放大，表面看來僅是一個(gè)體積 或尺度放大問題，實(shí)際上并不是那么簡(jiǎn)單。 半理論半經(jīng)驗(yàn) 氧傳遞問題 傳熱