食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 毒物動力學(xué)試驗

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中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布 布 施 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 毒物動力學(xué)試驗 （征求意見稿） 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 代謝試驗 》 。 本標(biāo)準(zhǔn)與 要修改如下： —— 修改了標(biāo)準(zhǔn)的名稱 ，將“代謝試驗 ” 改為“毒物動力學(xué)試驗”； —— 修改了范圍的相關(guān)內(nèi)容，將范圍改為“本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價食品生產(chǎn)、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的因素在受試動物體內(nèi)的毒物動力學(xué)過程，檢驗對象包括食品及其原料、食品添加劑、新資源食品、輻照食品、食品相關(guān)產(chǎn)品（用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑、消毒劑和用于食品生產(chǎn) 經(jīng)營的工具、設(shè)備）以及食品污染物”； —— 增加了“術(shù)語和定義”一項， 并在該項中列出了： 受試物、毒物動力學(xué)、吸收、分布、代謝、排泄、生物利用度、速率過程、濃度 觀分布容積、機(jī)體總清除率、消除半衰期、峰濃度、峰時間 的定義 ； —— 修改了原理的相關(guān)內(nèi)容，將原理改為“對一組或幾組試驗動物分別通過適當(dāng)?shù)耐緩揭淮位蛟谝?guī)定的時間內(nèi)多次給予受試物。然后按要求測定體液、臟器、組織、排泄物中受試物和 /或其代謝產(chǎn)物的量或濃度的經(jīng)時變化。進(jìn)而求出有關(guān)的毒物動力學(xué)參數(shù)，探討其毒理學(xué)意義”； —— 修改了儀器和試劑的部分內(nèi) 容，增加了“薄層層析儀、液質(zhì)聯(lián)用儀”，刪除“液體閃爍計數(shù)儀及閃爍液”； —— 增加 了“ 試驗方法 ” ,分為 “ 受試物的基本信息、實驗動物、劑量、試驗步驟和觀察指標(biāo) ” 4個部分 ，并對 4 個部分進(jìn)行 描述 ；其中“實驗動物” 分為 “ 動物種、系的選擇、性別和數(shù)量、動物飼養(yǎng) ”3 項內(nèi)容進(jìn)行描述 ；“ 試驗步驟和觀察指標(biāo) ” 分為 “ 受試物的準(zhǔn)備、受試物給予途徑、生物樣品分析方法的建立和確證、觀察指標(biāo) ” 4 個部分進(jìn)行描述 ；“觀察指標(biāo)”分為“ 血受試物濃度 吸收、分布、代謝、排泄” 5 個部分進(jìn)行描述 ； —— 刪除 “ 生物轉(zhuǎn)化 ”的 內(nèi)容 ； —— 刪除 “ 同 位素實驗中的注意事項 ” 的 內(nèi)容 ； —— 刪除 “ 對生物樣品中受試物分析方法的要求 ” 的 內(nèi)容 ； —— 增加了“數(shù)據(jù)處理和報告”一項，分為“數(shù)據(jù)處理、報告內(nèi)容” 2 部分進(jìn)行描述； —— 將“結(jié)果判定”改為“結(jié)果解釋”， 并 修改 了 相應(yīng)內(nèi)容。 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 毒物動力學(xué)試驗 1 范圍 本 標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定了 毒物動力學(xué) 試驗的 基本試驗方法和 技術(shù)要求。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價 食品生產(chǎn)、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的 因素 在受試動物 體內(nèi) 的毒物動力學(xué)過程，檢驗對象包括食品及其原料、食品添加劑、新資源食品、輻照食品、食品相關(guān)產(chǎn)品（ 用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑、消毒劑和用于食品生產(chǎn)經(jīng)營的工具、設(shè)備）以及食品污染物。 2 術(shù)語和定義 試物 用于測試的物品，專指符合毒物動力學(xué)試驗要求的供試品。 毒物 動力學(xué) 受試物 在體內(nèi)吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化和排泄等過程隨時間變化的動態(tài) 特性 。 吸收 受試物 從接觸部位，通常是機(jī)體的外表面或內(nèi)表面的生物膜轉(zhuǎn)運至血循環(huán)的過程。 分布 受試物 通過吸收進(jìn)入血液和體液后在體內(nèi)循環(huán)和分配的過程。 代謝 受試物 在體內(nèi)經(jīng)酶促或非酶促反應(yīng)，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。 排泄 受試物 和 /或其代謝物從身體被移出過程。 生物利用度 受試物 被機(jī)體吸收利用的程度。 速 率 過程 指經(jīng)毒物動力學(xué)過程 受試物 的量在單位時間內(nèi)的變化率，一般用單位時間過程進(jìn)行的變化量表示過程的速率。毒物動力學(xué)的速率過程包括零級、一級和非線性 3種類型。 濃度 曲線 以 給予受試物后 時間為橫坐標(biāo)，以受試物的 血液濃度 為縱坐標(biāo)所作的算術(shù)坐標(biāo)圖，反映 受試物 在體內(nèi)的 處置 狀態(tài)、 受試物含 量的經(jīng)時變化和速 率 ，該曲線下的面積反映了進(jìn)入體循環(huán)的 受試物含 量。 觀分布容積 當(dāng)體內(nèi) 受 試物 分布達(dá)動態(tài)平衡后，假設(shè)體內(nèi)流體中的 受試物 濃度均一地與血漿中的 受試物 濃度一樣，這樣溶解體內(nèi) 受試物 量所需的流體容積就是表觀分布容積。 它以體內(nèi) 受試物 量與血漿 受試物 濃度的比值表示。 體總清除率 是指 受試物 通過代謝和／或排泄的方式從體內(nèi)移去的速度；即單位時間內(nèi) 受試物 從體內(nèi)移去的表觀分布容積的分?jǐn)?shù)。 除半減期 體內(nèi)血 受試物 濃度下降一半所需要的時間，它是表示 受試物 消除速 率 的參數(shù)。 濃度 受試物 給予 后 血中 能夠達(dá)到的最大濃度。 時間 受試物給予后達(dá)到最大血濃度的時間 。 3 原 理 對一組或幾組試驗動物分別 通過適當(dāng)?shù)耐緩?一次 或在規(guī)定的時間內(nèi)多次 給予 受試物 。然后按要求測定體液、臟器、組織、排泄物中受試物和 /或其代謝產(chǎn)物的量或濃度的經(jīng)時變化。 進(jìn)而求出有關(guān)的毒物動力學(xué)參數(shù)，探討其毒理學(xué)意義。 4 儀器和試劑 根據(jù) 實驗需要 ，配備 紫外分光光度計、熒光分光光度計、薄層層析儀、氣相色譜儀、高效液相色譜儀、氣質(zhì) 或液質(zhì) 聯(lián)用儀等 設(shè)備。 放射性測量儀器 。 實驗室常用儀器與試劑。 5 試驗方法 受試物 的基本信息 應(yīng)提供受試物 的名稱、 、 批號、來源、 純度、 性 狀、 理化性質(zhì)、 儲存 條件及配制方法 等有關(guān)資料。 驗動物 物 種 、系的選擇 實驗動物的選擇應(yīng)符合 國家標(biāo)準(zhǔn)和 有關(guān)規(guī)定。 盡可能選用與其他毒理學(xué)試驗相同的 種 、系，并能出現(xiàn)受試物 的 典型毒作用的動物。 一般首選大 鼠， 周齡一般為 6 周 ～ 12 周 ， 但根據(jù)試驗研究的需要也可選用 非嚙齒類 動物 （首選 犬 ） 。一般應(yīng)選用年輕 、健康 的成年動物。選用嚙齒類動物時， 試驗開始時動物體重的差異不應(yīng)超過平均體重的± 20%。 對大動物 最好能在同一動物取得完整的 濃度 — 時 間 曲線。 別和數(shù)量 對 實驗 動物的 性別不作 特殊 規(guī)定，如毒理學(xué)研究表明毒性有明顯的性別差異時，應(yīng)設(shè)不同的性別組。一般情況下，雌性動物應(yīng)選用未產(chǎn)過仔和非妊娠的； 每一試驗組不應(yīng)少于 5 只動物，在非嚙齒類動物 （如犬） 的試驗中，動物數(shù)量可酌情減少。 物 飼養(yǎng) 試驗前動物在實驗動物房至少應(yīng)進(jìn)行 3d～ 5d 環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。實驗動物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定。 劑量 試驗中至少需要選用兩個劑量水平，每個劑量水平應(yīng)使其受試物或受試物的代謝產(chǎn)物足以在排泄物中測出。劑量設(shè)置時應(yīng)充分考慮現(xiàn)有的毒理學(xué)資料所提供的信息 。如果缺乏相應(yīng)的毒理學(xué)資料，那么高劑量水平應(yīng)低于 口和經(jīng)皮途徑）或者 入途徑），或低于急性毒性劑量范圍的較低值。低劑量水平應(yīng)該是高劑量水平的一部分。 如果試驗中僅設(shè)置一個劑量水平，該劑量理論上應(yīng)使其受試物或受試物的代謝產(chǎn)物足以在排泄物中測出，并不產(chǎn)生明顯的毒性，同時應(yīng)提供合理的理由說明不設(shè)置兩個劑量水平的原因。 試驗步驟和觀察指標(biāo) 受試物 的準(zhǔn)備 受試物的純度不應(yīng) 低于 98%。 試驗可采用“未標(biāo)記的”或“標(biāo)記”受試物。 如果 使 用放射性同位素標(biāo)記的受試物，其 放射化學(xué)純度 不應(yīng) 低于 95%，且應(yīng)將放射性同位素標(biāo)記在受試物分子的骨架上或具有重要功能的基團(tuán)上。 受試物 給予 途徑 當(dāng)選用溶媒或其他介質(zhì)時，受試物應(yīng)充分溶解或均勻懸浮其中，所選溶酶或介質(zhì)對受試物毒物動力學(xué)不產(chǎn)生任何影響。一般采用灌胃的途徑，某些情況下還可以采用吞服膠囊、摻入飼料的方式給予受試物。 采用靜脈注射給予受試物，應(yīng)選擇合適的注射部位和注射量給予受試物，所選溶酶或介質(zhì)應(yīng)不影響血液的完整性或血流量。股動脈給予受試物時，應(yīng)對動物進(jìn)行麻醉，同時應(yīng)考慮麻醉類型對毒物動力學(xué)是否產(chǎn)生影響。 某些受試物可能適用于 其它的給予途徑，如經(jīng)皮和吸入途徑，在選擇受試物給予途徑時，應(yīng)考慮受試物的理化性質(zhì)以及人類預(yù)期使用情況和暴露情況。 生物樣品分析方法的建立和確證 由于生物樣品一般來自全血、血清、血漿、 尿液 、器官或組織 等，具有取樣量少、受試物濃度低、干擾物質(zhì)多以及個體差異大等特點，因此必須根據(jù) 受試 物的結(jié)構(gòu)、生物介質(zhì)和預(yù)期的濃度范圍，建立靈敏、 特異 、精確、可靠的生物樣品定量分析方法，并對方法進(jìn)行確證。 生物樣品分析方法有： a） 色譜法：氣相色譜法（ 高效液相色譜法（ 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（ 生物樣品分析一般首選色譜法； b）免疫學(xué)方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等； c）微生物學(xué)方法 ； d) 同位素示蹤法 。 對方法進(jìn)行確證 一般應(yīng)進(jìn)行以下幾方面的考察： a） 特異性 ：必須證明 待測物 是預(yù)期的分析物， 內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測定。對于色譜法至少要 分析 6 個不同個體空白生物樣品色譜 圖、空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖及用 受試物 后的生物樣品色譜圖。 b） 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍：根據(jù) 待測物 的濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，用回歸分析方法（如用加權(quán)最小二乘法）獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度。 c） 精密度與準(zhǔn)確度 ： 要求選擇 3 個 不同 濃度的質(zhì)控樣品同時進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在定量下 限附近， 其濃度在定量下限的 3 倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；中間選一個濃度。 d） 定量下限：定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，要求至少能滿足測定 3～ 5 個 消除 半減期 時樣品中的 受試 物濃度，或 峰 濃度 的 1/10～ 1/20 時的 受試 物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的 80%～120%范圍內(nèi)， 批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差 應(yīng)小于 20%。 e） 樣品穩(wěn)定性：根據(jù)具體情況，對含受試物的生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應(yīng)注意儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性。 f）提取回收率：應(yīng)考察高、中、低 3 個濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)。 察指標(biāo) 受試物濃度 試動物數(shù) 動物 給予受試物 后 選擇 9 個～ 11 個 不同 的 時間點 采血，每個 時間 點 的動物數(shù) 不 應(yīng) 少于 5 只 。 最好從同一動物個體多次取樣。如由多只動物的數(shù)據(jù)共同構(gòu)成一條血受試物濃度 相應(yīng)增加動物數(shù)，以反映個體差異對試驗結(jié)果的影響。 采樣點 給 予 受試物前需要采血作為空白樣品。為獲得給 予 受 試物后的一個完整的血受試物濃度 樣時間點的設(shè)計應(yīng)兼顧受試物的吸收相、 分布 相（ 峰濃度 附近）和消除相。整個采樣時間至少應(yīng)持續(xù)到 3 個 ~5 個 消除半減期 ，或持續(xù)到血 受試物 濃度為 峰濃度 的 1/10~1/20。 物動力學(xué)參數(shù) 根據(jù)試 驗中測得的各受試動物的血受試物濃度 得受試物的主要毒物動力學(xué)參數(shù)。靜脈注射給予受試物，應(yīng)提供 消除半減期 、 表觀分布容積 、 曲線下面積 、 機(jī)體總 清除率 等參數(shù)值；血管外給予受試物，除提供上述參數(shù)外，尚應(yīng)提供 峰濃度 和 峰 時間 等參數(shù)，以反映受試物吸收的規(guī)律。 次給予受試物 單次給予不同劑量的受試物（或其放射性同位素標(biāo)記物）后，于不同時間測定血漿或全血中受試物濃度（或總放射活性強(qiáng)度）， 提供 各個受試動物的血受試物濃度 曲線 及 其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及 其 曲線；各個受試動物的主要毒 物 動力 學(xué)參數(shù)及平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。 復(fù) 多次給予受試物 重復(fù) 多次給予受試物， 應(yīng)結(jié)合單次試驗進(jìn)行，一般選取一個劑量多次給予受試物， 至少提供 3 次穩(wěn)態(tài)的受試物的 谷濃度， 達(dá)穩(wěn)態(tài)后進(jìn)行末次給予受試物試驗。 于不同時間測定血漿或全血中受試物濃度 或 總放射活性強(qiáng)度 ，與單次給予受試物相比，確定 重復(fù) 多次給予受試物時的毒物動力學(xué)特征。 吸收 受試物吸收的 程度 和速率取決于受試物 的 給予途徑和所獲得資料的種類。 一般認(rèn)為靜脈注射 給予受試物 時母體化學(xué)物的瞬時吸收率計為 100%， 經(jīng)口給予受試物時應(yīng)確定達(dá)峰濃度、達(dá)峰 時間和 曲線下面積 。分析母體化學(xué)物濃度與時間變化曲線可以確定經(jīng)口給予受試物的吸收常數(shù)。 生物利用度為經(jīng)口給予受試物的 曲線下面積 與靜脈注射 曲線下面積 的比值。 分布 選擇 合適的 受試物 劑量給予 實驗動物 后， 根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和毒性特點測定其 在 血液、 心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、生殖腺、腦、體脂、骨骼肌等組織的濃度，以了解受試物在體內(nèi)的主要分布 器官 組織。特別 關(guān) 注受試物濃度高、蓄積時間長的組織和器官，以及在毒性靶器官的分布。參考血受試物濃度 擇至少 3 個時間點分別代表吸收相、 分布 相和 消除相的 受試物 分布。若某組織的受試物濃度較高，應(yīng)增加觀測點，進(jìn)一步研究該組織中受試物消除的情況。每個時間點，至少應(yīng)有 5 個動物的數(shù)據(jù)。 進(jìn)行組織分布試驗，必須注意取樣的代表性和一致性。 同位素標(biāo)記物的組織分布試驗，應(yīng)提供標(biāo)記受試物的 放射化學(xué)純度 、標(biāo)記率（比活性）、標(biāo)記位置、給予受試物劑量等參數(shù)；提供放射性測定所采用的詳細(xì)方法；提供采用放射性示蹤生物學(xué)試驗的詳細(xì)過程，以及在生物樣品測定時對放射性衰變所進(jìn)行的校正方程等。 在實驗條件允許的情況下， 盡可能提供給予受試物后不同時相的整體放射自顯影圖像。 代謝 應(yīng)采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)分析生物樣本，以確定受試物的代謝程度和 途徑 。應(yīng)闡明代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu) 。 體外試驗也有助于獲取受試物代謝途徑方面的信息。 排泄 在排泄試驗中 ，選定 合適的劑量 給 予受試物 后，按一定的時間間隔分段收集尿 樣、 糞 便、呼出氣 ，測定 受試 物濃度 ， 計算 受試物 經(jīng)此途徑排泄的速率及排泄量 。必要時還應(yīng)收集膽汁檢測經(jīng)此途徑排泄的速率及排泄量。 在 給 予 受試物劑量至少 90%已被消除、或 在上述 收集到的樣品 中已檢測 不到 受試物 、或檢測時間長達(dá) 7d，可停止排泄物的收集 。 若 呼出氣中受試物 和 /或代謝產(chǎn)物濃度≤ 1%，可停止對動物呼出氣體的收集。 記錄受試物自糞、尿、 呼出氣 等 排 泄 的速 率 及總排 泄 量，提供 受試物在動物體內(nèi)的 物質(zhì)平衡的數(shù)據(jù)。 6 數(shù)據(jù)處理 和報告 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)具體的試驗類型，將數(shù)據(jù)匯總。 選擇科學(xué)合理的數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計 學(xué) 方法。如用計算機(jī)處理數(shù)據(jù)，應(yīng) 說 明所用程序的名稱、版本和來源。 報告 內(nèi)容 試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號 。 試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期 。 試驗開始和結(jié)束日期、試驗項目負(fù)責(zé)人、試驗單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期 。 試驗摘要 。 受試物名稱、劑型、生產(chǎn)日期（批號）、性狀、配制所用溶劑和方法 。 實驗動物種屬、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實驗動物質(zhì)量合格證號、 實驗動物生產(chǎn)許可證號）、動物檢疫、適應(yīng)情況，實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境包括溫度、相對濕度、飼料實驗動物設(shè)施使用許可證號 。 劑量和組別，包括選擇劑量的原則或依據(jù)、劑量和組別、動物分組方式和每組動物數(shù) 。 試驗條件和方法，包括受試物 的 給予方式和期限、試驗周期、觀察指標(biāo)等 。 試驗結(jié)果： a) 用表格形式匯集試驗數(shù)據(jù)，內(nèi)容應(yīng)包括不同劑量組每只動物的編號、性別、染毒劑量、體重、給予受試物 前后 生物材料中受試物及其代謝產(chǎn)物的測定值（或放射活性強(qiáng)度）等原始數(shù)據(jù)； b) 計算各劑量組上述測定值的均值及標(biāo)準(zhǔn)差； c) 繪制 不同劑量 條件下的 受試物濃度 曲線； d) 計算不同劑量 條件下與吸收、分布、 代謝、 排泄有關(guān)的各項毒物動力學(xué)參數(shù) ； e) 對進(jìn)行 代謝 研究的，給出代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 并提出代謝途徑 ； f） 對試驗數(shù)據(jù)、 曲線擬合的計算結(jié)果用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法處理。 7 結(jié)果解釋 根據(jù)試驗結(jié)果，對受試物進(jìn) 入機(jī)體的途徑、吸收速 率 和程度，受試物及其代謝產(chǎn)物在臟器、組織 和體液中的分布特征，生物轉(zhuǎn)化的速 率 和程度，主要代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化通路，排泄的途徑、速 率 和能力，受試物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積的可能性、程度和持續(xù)時間 做 出評價 。 結(jié)合相關(guān)學(xué)科的知識對各種毒物動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行毒理學(xué)意義的評價。