碩士畢業(yè)論文——數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用

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1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用專 業(yè)： 生物學(xué)碩 士 生： 導(dǎo) 師： 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 年 月摘 要轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)管理是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要內(nèi)容，不同的國家和地區(qū)都規(guī)定了不同的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值，這就對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測技術(shù)提出了較高的要求。目前，熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測中廣泛應(yīng)用，但是該方法需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是一種相對(duì)定量技術(shù)，并且定量極限較低，不適用于轉(zhuǎn)基因成分含量低的樣品。近年來興起的數(shù)字PCR能夠通過極度稀釋、泊松分布和終點(diǎn)法PCR實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，并且具有較高的檢測極限

2、和定量極限，在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測中具有巨大的應(yīng)用潛力。本文圍繞兩種數(shù)字PCR，分析了其在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用。1. 數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值：（1）微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）在基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值中，能夠排除影響反應(yīng)效率的抑制因子，定值的偏差比熒光定量PCR（qPCR）小；（2）ddPCR的動(dòng)態(tài)范圍可以達(dá)到100000拷貝，高于微流體芯片數(shù)字PCR（cdPCR）；（3）微滴式數(shù)字PCR由于分液數(shù)多，在定值的重復(fù)性上由于cdPCR；（4）ddPCR具有非常低的檢測極限(0.25拷貝/反應(yīng))，能夠用于單拷貝分子的檢測，而兩種數(shù)字PCR都比qPCR具有更低的定量極限

3、；（5）酶切后的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)更加適合在數(shù)字PCR平臺(tái)上進(jìn)行定值。2. 數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的精確定量分析：（1）ddPCR和cdPCR能夠不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行精確的絕對(duì)定量，同時(shí)還可以判斷轉(zhuǎn)基因生物的基因型；（2）ddPCR比qPCR更加適合用于雙重定量分析，單重和雙重的結(jié)果更為接近。3. 數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因生物外源基因的拷貝數(shù)分析。對(duì)于不同的基因，數(shù)字PCR和定量PCR測定的結(jié)果有所差異，并且基因組的酶切對(duì)數(shù)字PCR也產(chǎn)生了一定影響。這說明數(shù)字PCR和qPCR的反應(yīng)原理、統(tǒng)計(jì)原理有所不同，可以作為轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析的新方法。 關(guān)鍵詞: 轉(zhuǎn)基因生物，檢測，定量

4、，熒光定量PCR，數(shù)字PCR93上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 AbstractTHE APPLICATIONS OF DIGITAL PCR IN DETECTION FOR GMOS AND THEIR DERIVED PRODUCTSAbstractLabeling management is an important part of regulation on genetically modified organisms (GMOs). Thresholds are set by different countries, which need excellent quantification

5、 technologies. Currently, real-time quantitative PCR (qPCR) is widely used in quantification of GMOs. However, this method relies on the standard curve and reference material, which lead it to a relative quantification method. Moreover, the limit of quantification of real-time PCR is high. Samples w

6、ith low GMO content cannot quantified by qPCR. Digital PCR (dPCR) can realize absolute quantification through limit dilution, Poisson distribution and endpoint PCR. It shows potential in GMOs detection. In this research, two kind of digital PCR platforms were applied in GMO detection.1. Digital PCR

7、can apply in determing the certified value of GMO reference material. (1)Droplet digital PCR (ddPCR) can exclude matrix effect of qPCR and obtain the certified value with a smaller bias than qPCR. (2) ddPCR had a higher dynamic range (within 100,000 copies) than chamber digital PCR (cdPCR). (3) ddPC

8、R presented a good repeatability on certified value than cdPCR, attribute to the more partitions. (4) ddPCR had a low limit of detection (0.25 copies/reaction). Both ddPCR and cdPCR had a lower limit of quantification than qPCR. (5) Digtal PCR can work better on degisted plasmid reference material.2

9、. Digital PCR can apply in accurate quantification of GMO products. (1) Both ddPCR and cdPCR can realize absolute quatification of GMOs products wihout standard curve and reference materials. Moreover, digital PCR can decide the genotype of GMOs. (2) ddPCR performed better than qPCR in duplex quanti

10、fication. The results of simplex and duplex on ddPCR were closer than qPCR.3. Digital PCR can apply in estimating copy number of transgenes in GMOs. Digital PCR and qPCR tested different copy number on some genes. The degistion of genome had an effect on digtal PCR instead of qPCR. Thus, digital PCR

11、 was different form qPCR on principle and data statistics. Digital PCR can act as a new method in estimating copy number of transgenes in GMOs.Keywords: GMOs, detection, quantificaiton, real-time PCR，digital PCR上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章目 錄摘 要IABSTRACTIII目 錄5第一章 轉(zhuǎn)基因生物及其定量方法研究進(jìn)展71.1轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀81.1.1全球轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀81

12、.1.2中國轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀91.2轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)管理101.2.1強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)101.2.2自愿性標(biāo)識(shí)111.2.3低水平混雜的管理121.3轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品定量檢測方法概述121.3.1轉(zhuǎn)基因成分含量表述方式121.3.2熒光定量PCR131.3.3數(shù)字PCR151.3.4數(shù)字PCR及其應(yīng)用201.3.5展望21第二章 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值中的應(yīng)用22第一節(jié) 通過數(shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因生物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值232.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器232.1.1實(shí)驗(yàn)材料232.1.2實(shí)驗(yàn)儀器232.1.3實(shí)驗(yàn)試劑242.2實(shí)驗(yàn)方法242.2.1三種方法提取植物基因組DNA242.2

13、.2 DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)方法252.2.3引物和探針的設(shè)計(jì)272.2.4熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件272.2.5ddPCR反應(yīng)體系和條件282.2.6cdPCR反應(yīng)體系和條件292.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論292.3.1三種抽提方法所得DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)292.3.2熒光定量PCR定值結(jié)果312.3.3 ddPCR定值結(jié)果332.3.4cdPCR定值結(jié)果342.3.5三種平臺(tái)定值結(jié)果的分析比較352.3.6數(shù)字PCR平臺(tái)性能的分析362.4小結(jié)42第二節(jié) 通過數(shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因生物質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值432.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器432.1.1實(shí)驗(yàn)材料432.1.2實(shí)驗(yàn)儀器432.1.3實(shí)驗(yàn)試劑432.2實(shí)驗(yàn)

14、方法432.2.1提取質(zhì)粒分子DNA432.2.2 DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)方法442.2.3質(zhì)粒分子的酶切及回收442.2.4引物和探針的設(shè)計(jì)442.2.5熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件452.2.6ddPCR反應(yīng)體系和條件452.2.7cdPCR反應(yīng)體系和條件452.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論452.3.1酶切結(jié)果及DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)452.3.2熒光定量PCR定值結(jié)果462.3.3ddPCR定值結(jié)果462.3.4cdPCR定值結(jié)果472.3.5三種平臺(tái)定值結(jié)果的分析比較482.4小結(jié)49第三章 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品精確定量中的應(yīng)用50第一節(jié) 數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因生物基因型的分析513.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

15、513.1.1實(shí)驗(yàn)材料513.1.2實(shí)驗(yàn)儀器513.1.3實(shí)驗(yàn)試劑513.2實(shí)驗(yàn)方法513.2.1提取植物基因組DNA513.2.2 DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)方法513.2.3引物和探針的設(shè)計(jì)523.2.4熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件523.2.5ddPCR反應(yīng)體系和條件523.2.6cdPCR反應(yīng)體系和條件523.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論523.3.1DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)523.3.2熒光定量PCR定量結(jié)果533.3.3ddPCR定量結(jié)果533.3.4cdPCR定量結(jié)果543.3.5三種平臺(tái)定量結(jié)果的分析比較553.4小結(jié)55第二節(jié) 微滴式數(shù)字PCR可用于雙重絕對(duì)定量檢測563.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器563.1.

16、1實(shí)驗(yàn)材料563.1.2實(shí)驗(yàn)儀器563.1.3實(shí)驗(yàn)試劑563.2實(shí)驗(yàn)方法563.2.1提取植物基因組DNA563.2.2DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)方法563.2.3引物和探針的設(shè)計(jì)563.2.4單重和雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系和條件573.2.5單重和雙重ddPCR反應(yīng)體系和條件583.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論583.3.1DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)583.3.2單重和雙重?zé)晒舛縋CR定量結(jié)果593.3.3單重和雙重ddPCR定值結(jié)果603.3.4兩種平臺(tái)定量結(jié)果的分析比較603.4小結(jié)61第四章 通過數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)644.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器644.1.1實(shí)驗(yàn)材料644.1.2實(shí)驗(yàn)儀器644.

17、1.3實(shí)驗(yàn)試劑644.2 實(shí)驗(yàn)方法654.2.1提取動(dòng)物和植物基因組DNA654.2.2DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)方法664.2.3引物和探針的設(shè)計(jì)664.2.4質(zhì)粒分子的構(gòu)建684.2.5基因組限制性內(nèi)切酶消化694.2.6熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件704.2.7ddPCR反應(yīng)體系和條件704.2.8cdPCR反應(yīng)體系和條件704.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論704.3.1DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)704.3.2酶切效果評(píng)價(jià)704.3.3酶切前后定量PCR拷貝數(shù)分析結(jié)果714.3.4酶切前后ddPCR拷貝數(shù)分析結(jié)果724.3.5酶切前后cdPCR拷貝數(shù)分析結(jié)果724.3.6三種平臺(tái)定值結(jié)果的分析比較724.4小結(jié)77參考文

18、獻(xiàn)78附錄83致 謝85攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文86第一章 轉(zhuǎn)基因生物及其定量方法研究進(jìn)展1.1轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因生物，是通過基因工程的手段，從其他生物體內(nèi)獲取目的基因，并將其轉(zhuǎn)入另一生物體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因重組，獲得具有新性狀的生物體1。自1994年第一例轉(zhuǎn)基因番茄被批準(zhǔn)商業(yè)化以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保等領(lǐng)域都有著極為廣泛的應(yīng)用。1.1.1全球轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，自1998年來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積持續(xù)以每年兩位數(shù)的速度增長。截止2012年底，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已經(jīng)超過1.7億公頃2，

19、與2011年相比增長了6%，和1996年相比則增長了100倍之多（圖1-1）。全球有28個(gè)國家種植了轉(zhuǎn)基因作物，且種植面積位于前九名的國家都種植了超過200萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物。其中，美國、巴西和阿根廷分別排名前三，種植面積分別達(dá)69.5、36.6和23.9百萬公頃，占全球種植面積的40.8%、21.5%和14.0%；其次是加拿大和巴西，為11.6和10.8百萬公頃，分別占6.8%和6.3%；我國位于第六名，種植面積為4百萬公頃，占2.3%。在這28個(gè)國家中，發(fā)展中國家有20個(gè)，種植轉(zhuǎn)基因作物的總面積達(dá)到全球面積的52%，而發(fā)達(dá)國家則只有8個(gè)，種植面積占總面積的48%，這是發(fā)展中國家的總種植面積

20、第一次超過了發(fā)達(dá)國家。圖1-1 1996年-2012年世界轉(zhuǎn)基因作物種植情況2Figure 1-1 Global Area of Biotech Crops during 1996-2012.2012年全球范圍內(nèi)最為廣泛種植的四種轉(zhuǎn)基因作物仍為大豆、油菜、棉花和玉米2。其中，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最多，高達(dá)80.7百萬公頃，占大豆總種植面積的81% (圖1-2)。在轉(zhuǎn)基因性狀方面，2012年全球批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因品系中，最多的轉(zhuǎn)基因性狀為抗除草劑、抗蟲以及二者的疊加抗性。其中，抗除草劑大豆、玉米、棉花和油菜的總種植面積占所有轉(zhuǎn)基因作物的比例高達(dá)58%以上，疊加抗性的作物則占25%，抗蟲作物約占

21、16%。圖1-2 2012年四種主要轉(zhuǎn)基因作物種植比例2Figure 1-2 Planting proportion for 4 kind principal GM crops在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的17年間，除28個(gè)國家種植商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物外，另有31個(gè)國家，即共計(jì)59個(gè)國家和地區(qū)批準(zhǔn)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化用途，包括用于食物、飼料和釋放至環(huán)境中。總共涉及25種轉(zhuǎn)基因作物和319個(gè)轉(zhuǎn)基因事件2。這表明轉(zhuǎn)基因技術(shù)正在飛速發(fā)展，并將更廣泛的在人類經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境等領(lǐng)域產(chǎn)生影響。1.1.2中國轉(zhuǎn)基因生物發(fā)展現(xiàn)狀作為全世界最早研發(fā)和應(yīng)用轉(zhuǎn)基因作物的國家之一，我國已自主研發(fā)轉(zhuǎn)基因植物40余種，其中包括棉

22、花、油菜、玉米、小麥和水稻等，涉及不同種類的目的基因100多種3，表達(dá)的性狀多以抗逆、抗病、抗蟲和品質(zhì)改良為主。棉花是我國商業(yè)化種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物，早在1997年，中國就首次批準(zhǔn)了種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，截止2012年底，我國的轉(zhuǎn)基因棉花種植面積已達(dá)400萬公頃，占全部棉花種植面積的80%4。近年來，我國在轉(zhuǎn)基因糧食的研發(fā)和種植上也取得了重大進(jìn)展，2009年8月17日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的兩種轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號(hào)”、“Bt汕優(yōu)63”獲得了農(nóng)業(yè)部頒布的安全證書5；同日獲得安全證書的還有中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院范云六院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米“BVLA430101”，且研發(fā)單位此前已將專

23、利轉(zhuǎn)讓至奧瑞金公司4。此外，農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因品種轉(zhuǎn)基因安全管理辦公室已經(jīng)為12種轉(zhuǎn)基因玉米頒發(fā)了進(jìn)口許可證。中國在轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)口、研發(fā)和種植上的舉措，在我國乃至全球范圍內(nèi)都具有著里程碑式的意義，這表明中國的轉(zhuǎn)基因水稻和玉米即將邁入產(chǎn)業(yè)化種植和生產(chǎn)的階段，對(duì)我國的農(nóng)業(yè)發(fā)展將起到至關(guān)重要的作用。1.2轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)管理轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)管理是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要內(nèi)容之一。在全球范圍內(nèi)，超過50個(gè)國家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)管理，包括兩種模式：自愿性標(biāo)識(shí)和強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)6（表1-1）。不同的國家會(huì)設(shè)定不同的標(biāo)識(shí)閾值，該閾值指的是某一個(gè)產(chǎn)品含轉(zhuǎn)基因成分所占的比例。例如，對(duì)于加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)

24、品玉米粉，轉(zhuǎn)基因玉米含量指的是轉(zhuǎn)基因玉米成分在該玉米粉的玉米成分中所占的比例。通常情況下，標(biāo)識(shí)閾值有以下兩種表述方式：一種是以質(zhì)量百分比進(jìn)行表述，即轉(zhuǎn)基因玉米的質(zhì)量/玉米的總質(zhì)量；另一種是以外源基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)之比進(jìn)行表述，即轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因拷貝數(shù)/玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)。由于基因拷貝數(shù)和質(zhì)量之間并不存在標(biāo)準(zhǔn)的線性關(guān)系，所以通過這兩種不同的表述方式經(jīng)常得到不同的轉(zhuǎn)基因含量。目前，除歐盟采用拷貝數(shù)之比表述標(biāo)識(shí)閾值外，其他實(shí)施強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)制度的國家均以質(zhì)量百分比進(jìn)行計(jì)算7。1.2.1強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)包括歐盟在內(nèi)，韓國、日本、澳大利亞、新西蘭和泰國等國都實(shí)施強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)，明確規(guī)定特定的標(biāo)識(shí)閾值，即若

25、某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分含量大于規(guī)定的閾值時(shí)必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)8。歐盟于2003年頒布兩條法規(guī)EC No. 1829/2003及No. 1830/2003，規(guī)定標(biāo)識(shí)閾值為0.9%，即若食品、飼料或其他轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分含量大于0.9%，就必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)，還必須提供可追蹤的制度9。對(duì)于標(biāo)識(shí)閾值，歐盟早先于2000年頒布EC No. 49/2000法令，規(guī)定標(biāo)識(shí)閾值為1%。2003年又頒布了新的法規(guī)，將強(qiáng)制標(biāo)識(shí)的閾值更新為0.9%，并明確以拷貝數(shù)之計(jì)算轉(zhuǎn)基因成分含量10。我國實(shí)行零閾值的強(qiáng)制性標(biāo)簽制度，規(guī)定當(dāng)產(chǎn)品中包含農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法中規(guī)定的轉(zhuǎn)基因成分時(shí)必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)

26、識(shí)管理辦法中明確規(guī)定了5大類（大豆、棉花、油菜、玉米和番茄）17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（五種轉(zhuǎn)基因作物對(duì)應(yīng)的種子、果實(shí)和主要加工產(chǎn)品）11。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不同檢測方法在檢測極限上存在較大差異，所以檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于零閾值標(biāo)識(shí)管理至關(guān)重要。我國也相應(yīng)頒布了一系列轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。近年來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類越來越多，因此農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法也需要陸續(xù)完善，使其更好的服務(wù)于我國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理。亞洲國家中，日本和韓國等國家也相繼于2000年和2001年開始實(shí)施強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度。日本將強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)閾值規(guī)定為5%，并且實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品年標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)。韓國政府則規(guī)定，凡是某種食品或飼料中的轉(zhuǎn)基因大豆、豆芽、油

27、菜、玉米和馬鈴薯的成分含量超過3%就必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)12。1.2.2自愿性標(biāo)識(shí)以美國為代表，加拿大、阿根廷等國均對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行自愿標(biāo)識(shí)管理政策。在美國，農(nóng)業(yè)部、環(huán)保署和食品藥品監(jiān)管局依據(jù)各自的職能和分工，對(duì)美國轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實(shí)施安全管理。美國農(nóng)業(yè)部的管理目的是確保轉(zhuǎn)基因生物的安全種植，美國環(huán)保署則依據(jù)聯(lián)邦殺蟲劑、殺菌劑、殺鼠劑法和聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放進(jìn)行管理；食品藥品監(jiān)管局則根據(jù)聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法，負(fù)責(zé)評(píng)估食品和食品添加劑的安全管理，其中規(guī)定，只有當(dāng)轉(zhuǎn)基因食品和相應(yīng)的傳統(tǒng)食品差異明顯、具有特殊效果、存在過敏原或用于特殊用途時(shí)，才需要進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理13。表1-1全

28、球主要國家和地區(qū)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理情況 Table1-1 Labeling management of GMO products in major countries 標(biāo)識(shí)類型閾值閾值表述方式國家和地區(qū)強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)未規(guī)定 中國、印度0.9%DNA拷貝數(shù)之比歐盟、俄羅斯、愛爾蘭1%質(zhì)量百分比澳大利亞、巴西、克羅地亞、新西蘭、沙特阿拉伯、以色列2%質(zhì)量百分比挪威、智利3%質(zhì)量百分比馬來西亞、韓國5%質(zhì)量百分比日本、泰國、中國臺(tái)灣、印度尼西亞自愿性標(biāo)識(shí)未規(guī)定 美國、南非、阿根廷、5% 加拿大、中國香港、菲律賓1.2.3低水平混雜的管理伴隨著轉(zhuǎn)基因作物廣泛的種植和商業(yè)化應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜(Lo

29、w Level Presence, LLP)現(xiàn)象也引起了國際上的密切關(guān)注。國際食品法典委員會(huì)于2008年在Codex植物準(zhǔn)則附件3中對(duì)轉(zhuǎn)基因生物低水平混雜做出了正式界定：對(duì)于某種特定的轉(zhuǎn)基因生物，其在一個(gè)或多個(gè)國家已經(jīng)得到批準(zhǔn)，在某個(gè)進(jìn)口國進(jìn)口的農(nóng)產(chǎn)品中出現(xiàn)了這種轉(zhuǎn)基因生物的微量混雜，但該進(jìn)口國并沒有批準(zhǔn)這種轉(zhuǎn)基因生物，這一現(xiàn)象稱為LLP14。國際貿(mào)易中已經(jīng)發(fā)生多起LLP事件。例如2000年的美國Starlink轉(zhuǎn)基因玉米事件，該事件導(dǎo)致美國出口玉米價(jià)格下跌了6.8%，并且持續(xù)了近一年時(shí)間15。因此，LLP會(huì)對(duì)國際貿(mào)易帶來諸多影響，容易引起國際貿(mào)易摩擦，其管理尤為重要。歐盟在立法EU 619/

30、2011中對(duì)LLP進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定，明確其閾值為0.1%。1.3轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品定量檢測方法概述在保證標(biāo)識(shí)過程中，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測成為必不可少的環(huán)節(jié)。由于不同國家和地區(qū)都規(guī)定了不同的標(biāo)識(shí)閾值，因此如何準(zhǔn)確測定某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的含量就顯得尤為重要，這直接關(guān)系到標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施。然而，不同的定量檢測方法具有不同的特異性、靈敏度等特點(diǎn)，因此選擇適合的定量方法也是極為關(guān)鍵的。目前常規(guī)的轉(zhuǎn)基因檢測過程中，最常用的定量檢測方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR。近年來，隨著核酸檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因定量檢測中也表現(xiàn)出了巨大的潛力和優(yōu)勢。1.3.1轉(zhuǎn)基因成分含量表述方式與第一章1.2中

31、類似，轉(zhuǎn)基因成分含量是指某一個(gè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含有轉(zhuǎn)基因成分所占的比例。也通常使用質(zhì)量百分比或基因拷貝數(shù)之比兩種方式進(jìn)行計(jì)算和表述。對(duì)于已知成分和含量的樣品，可以通過直接計(jì)算質(zhì)量百分比表示轉(zhuǎn)基因成分含量，但在實(shí)際樣品的檢測中，如果樣品中轉(zhuǎn)基因成分和含量未知，則兩種表述方式都需要通過對(duì)內(nèi)、外源基因的分別擴(kuò)增來來計(jì)算其含量。因此，內(nèi)、外源基因的選擇也非常重要。內(nèi)源基因也稱作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，能夠用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因必須具有種間特異性，種內(nèi)非特異性和低拷貝數(shù)（一般是單拷貝）等特征16。而在外源基因的選擇上，一般來說，特異性最高的品系特異性序列往往用作某一轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的最佳選擇17-19。1.

32、3.2熒光定量PCR 熒光定量PCR是目前在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中最為常用的一種定量檢測方法，通過建立標(biāo)曲線，對(duì)樣品中的未知模板進(jìn)行定量檢測和分析。因?yàn)樵跈z測的過程中需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此被認(rèn)為是一種相對(duì)定量技術(shù)。1.3.2.1 熒光定量PCR原理熒光定量PCR也稱作實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是一種建立在熒光能量傳遞技術(shù)基礎(chǔ)之上的檢測方法。該方法的基本原理是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程的熒光信號(hào)累積狀況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測20。在熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展過程中，誕生了各種各樣的熒光染料和熒光探針，以滿足不同的熒光監(jiān)測需求。其中，常用的熒光染料包括SYBR Green I21和Eva

33、 Green 22等；常用的熒光探針有TaqMan探針23、TaqMan-MGB探針24以及AUDP探針25等(圖1-3)。圖1-3 TaqMan和TaqMan MGB探針的結(jié)構(gòu)和工作原理Figure 1-3. The structure and principle of TaqMan and TaqMan MGB probe在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測中，熒光定量PCR則需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立實(shí)現(xiàn)定量檢測，具體原理如下26：在熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行過程中，熒光信號(hào)隨著模板擴(kuò)增不斷積累，最終可以將整個(gè)反應(yīng)的熒光信號(hào)繪制成一條曲線，PCR擴(kuò)增期間生成的產(chǎn)物量可用如下公式表達(dá)： X=X0 (1+Ex

34、) n式中， n為循環(huán)數(shù)，X為第n個(gè)循環(huán)后的產(chǎn)物量，X0為初始模板量，Ex為反應(yīng)效率。若在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值（M）時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct，則此時(shí)的產(chǎn)物量XCt為：XCt=X0 (1+Ex) Ct =M上式可轉(zhuǎn)化為： log X0 = - log(1+Ex) *Ct+ log M從式中不難看出，log X0和Ct呈線性相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立是利用一系列已知起始濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)每個(gè)梯度所得Ct值與初始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系繪制而來的。有了標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將待測樣品在同一閾值下得到的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，就能計(jì)算得出目標(biāo)序列的初始拷貝數(shù)（圖1-4）。通過分別建立內(nèi)源基因和外源基

35、因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出待測樣品的內(nèi)源基因初始拷貝數(shù)和外源基因的初始拷貝數(shù)，就可得到該樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。圖1-4熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立原理Figure 1-4 Principle of standard curve for real-time PCR1.3.2.2 熒光定量PCR的應(yīng)用熒光定量PCR在生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，如環(huán)境27、微生物28和臨床診斷29等。在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測中，熒光定量PCR更是得到了充分的利用，其中，基于TaqMan探針的熒光定量PCR由于其簡單及高度的特異性得到了最多的應(yīng)用，研究人員幾乎為每一種轉(zhuǎn)基因作物都建立了相應(yīng)的定量檢測方法

36、30。例如，Guo等建立了轉(zhuǎn)基因番木瓜華農(nóng)一號(hào)的品系特異性定量檢測方法31，Yang等對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因棉花Mon1445和 Mon531均建立了相應(yīng)的品系特異性熒光定量PCR檢測方法等32。此外，多重的熒光定量檢測方法因?yàn)槟軌蛲瑫r(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)，降低了反應(yīng)試劑、模板的消耗和反應(yīng)的個(gè)數(shù)，幾年來也被較多的采用。如Bahrdt等33就建立了一種復(fù)合熒光定量PCR法，能夠同時(shí)檢測6個(gè)靶標(biāo)，并且具有很高的靈敏度（10拷貝）。熒光定量PCR技術(shù)因?yàn)榫哂休^高的特異性，并且沒有反應(yīng)后續(xù)的凝膠電泳等分析過程，能夠較轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量分析，然而好的避免污染，縮短反應(yīng)時(shí)間，是轉(zhuǎn)基因檢測中常用的定量方式。但是，隨著核算研究技

37、術(shù)的不斷進(jìn)步，通過這種技術(shù)進(jìn)行定量分析的缺點(diǎn)也逐漸暴露出來：首先，熒光定量PCR的定量計(jì)算過程需要完全依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行，只能稱作一種相對(duì)定量技術(shù)，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提出了很高的要求，并不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量技術(shù)34；其次，熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求非常嚴(yán)格，反應(yīng)效率在90%以上，R2值大于0.95的標(biāo)準(zhǔn)曲線才可用于在擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增反應(yīng)往往會(huì)受到DNA純度和反應(yīng)體系的抑制因子等因素的影響，從而導(dǎo)致內(nèi)源基因或外源擴(kuò)增序列拷貝數(shù)的不準(zhǔn)確估計(jì)35；此外，熒光定量PCR的靈敏度有限，根據(jù)大多數(shù)文章報(bào)道，該方法的檢測極限約為每反應(yīng)30-100拷貝36-38，若檢測的樣品中轉(zhuǎn)基因含量極低，則

38、熒光定量PCR無法檢測出，會(huì)造成假陰性的檢測結(jié)果。特別是對(duì)于我國實(shí)行零閾值標(biāo)識(shí)方式，檢測極限就更加重要。綜上所述，熒光定量PCR已經(jīng)逐漸不能滿足于當(dāng)今社會(huì)對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物的定量檢測需求了。在這樣的情況下，數(shù)字PCR應(yīng)運(yùn)而生。1.3.3數(shù)字PCR 數(shù)字PCR技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的方法，早在1992年，就已經(jīng)有科學(xué)家提出了數(shù)字PCR(digital PCR)的構(gòu)想，期望通過樣品極度稀釋、泊松分本和終點(diǎn)法PCR，來實(shí)現(xiàn)核酸的定量39。在這之后二十年的探索中，數(shù)字PCR最終逐步發(fā)展成為一種較為成熟的絕對(duì)定量技術(shù)，并被各個(gè)研究領(lǐng)域的學(xué)者廣泛使用。1.3.3.1數(shù)字PCR

39、原理數(shù)字PCR技術(shù)，是通過將微量樣品進(jìn)行大倍數(shù)（極度）稀釋，并將其細(xì)分到多個(gè)微反應(yīng)室中，這樣的稀釋會(huì)產(chǎn)生兩種結(jié)果：一種是微反應(yīng)室中只含有一個(gè)DNA分子，另一種是微反應(yīng)室中不含DNA分子，此時(shí)，再將所有的微反應(yīng)室在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，這樣也會(huì)導(dǎo)致兩種反應(yīng)結(jié)果：含有DNA分子的微反應(yīng)室能夠發(fā)生PCR反應(yīng)，產(chǎn)生陽性信號(hào)，系統(tǒng)會(huì)將其判讀為“1”；而不含DNA的微反應(yīng)室則猶豫缺少模板而無法發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生陰性信號(hào)，系統(tǒng)將其判讀為“0”。此時(shí)，系統(tǒng)再通過泊松分布，對(duì)產(chǎn)生陽性信號(hào)的微反應(yīng)室進(jìn)行逐個(gè)計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出樣品中初始的DNA模板量40。因?yàn)檫@樣的計(jì)算方法和計(jì)算機(jī)中的二進(jìn)制語言非常類似，是通過數(shù)

40、字信號(hào)來分析數(shù)據(jù)的，所以科學(xué)家將其稱為數(shù)字PCR。其基本原理如圖1-5所示。圖1-5 數(shù)字PCR原理Figure 1-5 Principle of digital PCR然而，在數(shù)字PCR運(yùn)行時(shí)，微反應(yīng)室中僅僅含有一個(gè)DNA分子的隨機(jī)分布是無法保證的，很有可能反應(yīng)室中會(huì)進(jìn)入兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的DNA分子。那么，怎么保證數(shù)字PCR的這種理論分布呢？泊松分布（Poisson Distribution）是數(shù)字PCR設(shè)想成立的一個(gè)非常重要的依據(jù)，數(shù)字PCR的結(jié)果需要根據(jù)泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來進(jìn)行分析，即： 式中，為每個(gè)微反應(yīng)室中DNA的平均濃度（拷貝數(shù)），p則代表在條件下，每個(gè)微反應(yīng)室中包含k個(gè)拷貝DN

41、A的概率，樣品的稀釋系數(shù)為m，因?yàn)閙能夠決定樣品稀釋后的濃度，故位=cm。其中c為樣品的原始濃度（拷貝數(shù)），當(dāng)k=0時(shí)，體系中不含DNA。上式可變?yōu)閜=e，可以視為無熒光信號(hào)的微反應(yīng)室個(gè)數(shù)與所有微反應(yīng)室總數(shù)的比值：n-fn=e-cm上式中，n代表微反應(yīng)室總數(shù)，f代表檢測到熒光信號(hào)的微反應(yīng)室個(gè)數(shù)。對(duì)上式兩邊取自然對(duì)數(shù)ln，可得：n-fn=e-cm所以，根據(jù)數(shù)字PCR微反應(yīng)室總數(shù)、有熒光信號(hào)的微反應(yīng)室個(gè)數(shù)以及樣品DNA的稀釋系數(shù)，就可計(jì)算得出樣品的原始濃度（拷貝數(shù)）41。數(shù)字PCR是一種絕對(duì)測量方法，原因有二：第一，在樣品被極度稀釋和細(xì)分后，只有含有1個(gè)DNA分子的細(xì)分試樣中才能夠發(fā)生PCR反應(yīng)并

42、將產(chǎn)生的熒光信號(hào)放大，從而使系統(tǒng)通過逐個(gè)計(jì)數(shù)的的辦法來計(jì)算樣品中的DNA分子數(shù)，即便細(xì)分試樣中含有干擾信號(hào)的雜質(zhì)分子（如反應(yīng)抑制因子），但由于雜質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)和靶標(biāo)DNA并不在同一水平，因此其信號(hào)將不會(huì)影響最終的檢測結(jié)果42；第二,通過數(shù)字PCR進(jìn)行定量分析時(shí)，不需要依賴任何的外部標(biāo)準(zhǔn)，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線等，僅僅需要樣品本身的DNA來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并最終通過逐個(gè)計(jì)數(shù)的方法計(jì)算初始濃度43。和熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR具有以下優(yōu)勢：（1）能夠有效地避免擴(kuò)增反應(yīng)中抑制反應(yīng)因子的干擾，具有較高的反應(yīng)效率；（2） 無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，也不需使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等的任何外部標(biāo)準(zhǔn)；（3）具有更高精確性，

43、這為一些高要求的計(jì)量分析提供了很大幫助；（4）靈敏度高，非常適合低拷貝樣品的定量，并為轉(zhuǎn)基因成分含量極低的樣品檢測提供了可能；（5）由于數(shù)字PCR采用終點(diǎn)法的檢測模式，并且在反應(yīng)中能夠排除抑制因子的干擾，這也使其在很大程度上避免了熒光定量反應(yīng)中基體效應(yīng)帶來的偏差44。1.3.3.2四大數(shù)字PCR平臺(tái) 在數(shù)字PCR的概念提出并不斷完善后，各大公司迅速瞄準(zhǔn)了數(shù)字PCR的市場潛力，相繼推出了基于不同技術(shù)的數(shù)字PCR平臺(tái)。目前，全球一共有四大數(shù)字PCR平臺(tái)，分別是基于親疏水芯片技術(shù)的數(shù)字PCR、微流體芯片數(shù)字PCR、微滴式數(shù)字PCR和3D數(shù)字PCR。1.3.3.2.1微流體芯片數(shù)字PCRFluidig

44、m公司率先在2006年底推出了首個(gè)商業(yè)化的數(shù)字PCR平臺(tái)Bio-Mark 高通量基因分析系統(tǒng)（chamber digital PCR，cdPCR）。該系統(tǒng)有效地結(jié)合了微流體技術(shù)、生物技術(shù)和微電子技術(shù)，技術(shù)核心在于集成液體通路技術(shù)，即利用集成電路的制作工藝，通在硅片上刻出許多微管和微腔，并設(shè)計(jì)了各個(gè)閥門來控制液體在微管和微腔中的流動(dòng)，從而完成反應(yīng)體系的分液、混合和PCR擴(kuò)增。該技術(shù)在很大程度上簡化了樣品和試劑的分液操作，每個(gè)細(xì)分試樣的反應(yīng)體僅為幾納升，大大減少了樣品和試劑的使用量45。Bio-Mark基因分析系統(tǒng)由如下四部分構(gòu)成：整合了高性能計(jì)算機(jī)的Bio-Mark實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、IFC微流體芯

45、片、IFC Controller（將反應(yīng)體系導(dǎo)入至IFC微流體芯片中）以及反應(yīng)結(jié)果分析軟件。目前，F(xiàn)ludigm提供兩種類型的IFC微流體芯片：動(dòng)態(tài)芯片（Dynamic Array，有48.48和96.96兩種規(guī)格）和數(shù)字芯片（Digital Array，有12.765和48.770兩種規(guī)格），能夠滿足不同通量和目的的實(shí)驗(yàn)分析（圖1-6）。圖1-6 Fludigm 12.765 數(shù)字芯片（左）和48.48動(dòng)態(tài)芯片（右）Figure 1-6 Fludigm 12.765 digital array (left) and 48.48 dyanamic array整個(gè)過程分為如下五個(gè)步驟：（1）在芯

46、片中加入control line并使用IFC Controller準(zhǔn)備芯片；（2）將配制好的反應(yīng)體系加入芯片的上樣孔中，并使用IFC Controller使反應(yīng)體系進(jìn)入到數(shù)百（765或770）個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)微室中；（3）將芯片載入BioMark系統(tǒng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（4）通過分析軟件分析擴(kuò)增結(jié)果，計(jì)算樣品中初始DNA濃度。1.3.3.2.2基于親疏水芯片技術(shù)的數(shù)字PCR在Fludigm推出BioMark的第四年，Life Technologies公司也推出了OpenArray系統(tǒng)，這是一種基于親疏水芯片和通道技術(shù)的數(shù)字PCR平臺(tái)。擴(kuò)增反應(yīng)需要在其生產(chǎn)的OpenArray 平板上運(yùn)行，Ope

47、nArray平板上共有3072個(gè)通孔，每一個(gè)通孔都可作為獨(dú)立的PCR反應(yīng)孔，每個(gè)通孔的直徑和深度都為300m。平板以48個(gè)子陣排列，每個(gè)子陣包含64通孔，共計(jì)3072個(gè)通孔。平板表面因?yàn)榻?jīng)過特殊處理的包被而表現(xiàn)出疏水的特性，但通孔內(nèi)部是親水并具有生物兼容性的。在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，通過表面張力的作用，每一個(gè)通孔中都進(jìn)入了33納升反應(yīng)體系46。一塊OpenArray平板可以進(jìn)行48個(gè)樣品的數(shù)字PCR反應(yīng)， 而OpenArray系統(tǒng)一次最多可以同時(shí)運(yùn)行3塊OpenArray平板。即一次可以總共分析144個(gè)樣品，達(dá)到了較高的通量。OpenArray系統(tǒng)的數(shù)字PCR的實(shí)驗(yàn)流程主要包括如下五步：（1）稀釋

48、：將樣品DNA稀釋到最適濃度；（2）上樣：將樣品和反應(yīng)體系加入OpenArray平板的上樣孔中；（3）循環(huán)與成像：利用OpenArray AccuFill系統(tǒng)將體系載入OpenArray平板；（4）密封：將完成上樣的平板插入OpenArray箱中，裝滿浸液，用封箱膠水將其密封；（5）利用OpenArray 實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)運(yùn)行PCR反應(yīng)。圖1-7 TaqMan OpenArray數(shù)字PCR平板 Figure 1-7 TaqMan OpenArray digital PCR plate1.3.3.3 微滴式數(shù)字PCR數(shù)字技術(shù)不斷發(fā)展成熟，微滴式數(shù)字PCR問世了。微滴式數(shù)字PCR（droplet di

49、gital PCR，ddPCR）最初由QuantaLife公司開發(fā)，2011年10月，Bio-Rad公司收購QuantaLife公司并推出QX100 ddPCR系統(tǒng)。與上文提到的兩種基于芯片技術(shù)的數(shù)字PCR不同，QX100 ddPCR系統(tǒng)是通過微滴實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的細(xì)分。因?yàn)榧尤肓撕刑厥獬煞值念A(yù)混液，反應(yīng)體系能夠形成數(shù)以萬計(jì)（最多可達(dá)10,000）個(gè)納升級(jí)的微滴，并將DNA分子隨機(jī)分布到這些微滴中，這樣有些微滴含有一個(gè)至數(shù)個(gè)DNA分子，有些微滴則不含DNA分子。也就是說，每個(gè)微滴都成為了一個(gè)獨(dú)立的PCR微反應(yīng)室。PCR擴(kuò)增完成后，微滴分析儀（droplet reader）會(huì)逐個(gè)讀取每個(gè)微滴，

50、區(qū)分陽性微滴和陰性微滴，并通過對(duì)它們的分別計(jì)數(shù)、比例和泊松分布的原理，計(jì)算出初始的樣品濃度或拷貝數(shù)47。QX100系統(tǒng)主要包括微滴生成儀和微滴讀取儀兩個(gè)部分，具體的工作流程包括如下幾個(gè)步驟：（1）配制反應(yīng)體系，將其加入微滴生成卡中；（2）將微滴生成卡放入微滴生成儀，運(yùn)行儀器，生成微滴；（3）將微滴從微滴生成卡轉(zhuǎn)移至96孔板中；（4）把96孔板置入PCR儀，運(yùn)行PCR程序；（5）擴(kuò)增結(jié)束，將96孔板轉(zhuǎn)移到微滴讀取儀上，讀取擴(kuò)增結(jié)果。圖1-8 BioRad微滴數(shù)字PCR工作流程Figure 1-8 The workflow of droplet digital PCR1.3.3.4 3D數(shù)字PCR

51、3D數(shù)字PCR是Life Technologies公司于2013年最新推出的數(shù)字PCR平臺(tái)，即 QuantStudio系統(tǒng)。這也是一種基于芯片的數(shù)字PCR，其技術(shù)核心在采用了于高密度納米流體芯片，芯片上包含20,000個(gè)微孔可進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)微孔的直徑僅為60微米。3DPCR還有另外的有點(diǎn)，它體積非常小巧，寬度約5英寸，深度約8.5英寸，高度約8英寸，價(jià)格也較其他數(shù)字PCR低，是一種具有廣闊發(fā)展空間的數(shù)字新型PCR平臺(tái)48。圖1-9 QuantStudio 3D數(shù)字PCR芯片F(xiàn)igure 1-9 QuantStudio 3D digital PCR chip1.3.4數(shù)字PCR及其應(yīng)用 數(shù)

52、字PCR自上市以來就表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，已經(jīng)有諸多學(xué)者將其利用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)中主要有絕對(duì)定量、稀有突變檢測和拷貝數(shù)變異等49。對(duì)于前三種數(shù)字PCR平臺(tái)的應(yīng)用報(bào)道較多，3D數(shù)字PCR由于今年剛剛上市，目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。在這些文章中，數(shù)字PCR都被證明具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。在轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測中，主要是發(fā)揮數(shù)字PCR在絕對(duì)定量上的優(yōu)勢，M. J. Burns等人通過Fludigm的數(shù)字芯片和動(dòng)態(tài)芯片分析了歐盟有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中轉(zhuǎn)基因玉米MON810的含量，并對(duì)該平臺(tái)的靈敏度進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)能夠檢測到5個(gè)拷貝的外源基因；Corbisier等50也用該技術(shù)對(duì)M

53、ON810中的外源序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)，并使用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)同一樣品在熒光定量PCR平臺(tái)上進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果一致，在一定程度上證明了數(shù)字PCR的可靠性；Morisset等人則著重使用ddPCR分析了食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分含量，發(fā)現(xiàn)ddPCR比定量PCR有著更好的靈敏度（5-6拷貝的檢測極限）和動(dòng)態(tài)范圍（約10,000拷貝以內(nèi)），并且是進(jìn)行雙重定量檢測的絕佳選擇44。另外，對(duì)于數(shù)字PCR價(jià)格昂貴的問題，Morisset等人認(rèn)為，在大批量樣品處理時(shí)，數(shù)字PCR的價(jià)格反而低于熒光定量PCR44。1.3.5展望隨著轉(zhuǎn)基因植物的種類逐漸增多、種植面積不斷增加，市面上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類也越來越琳

54、瑯滿目，這都對(duì)轉(zhuǎn)基因閾值標(biāo)識(shí)的管理帶來了極大的麻煩，如何準(zhǔn)確、精確地對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量，已經(jīng)成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)研究的一大重點(diǎn)。傳統(tǒng)的熒光定量PCR依然是公認(rèn)的經(jīng)典方法，但數(shù)字PCR的面世更是給大家?guī)砹讼Ｍ核灰蕾嚾魏瓮獠繕?biāo)準(zhǔn)、能夠有效節(jié)省試劑和樣品、具有更高的靈敏度。這些都使得數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測中表現(xiàn)出巨大的潛力。然而，數(shù)字PCR的普及和推廣依然面臨著很多問題，最大的問題就是價(jià)格昂貴，cdPCR的芯片為400美金一張，OpenArray為150美金一張，ddPCR相對(duì)較低，平均每個(gè)樣品需要3美金的檢測費(fèi)用49，但這些費(fèi)用都是不包含儀器和耗材的價(jià)格，可見

55、數(shù)字PCR的昂貴。另外，數(shù)字PCR的檢測通量也比較低，熒光定量最多可以使用384孔板進(jìn)行，然而數(shù)字PCR最多也只能同時(shí)檢測144個(gè)樣品（OpenArray），使得大批量的檢測費(fèi)時(shí)費(fèi)力。可見，數(shù)字PCR還需要各界科學(xué)家們的共同努力，才可以真正實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的快速化、準(zhǔn)確化、高通量化和低成本化。上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章第二章 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Genetically Modified Organism Reference Material, GMO-RM）是具有一種或多種足夠均勻、穩(wěn)定，并能很好地確定轉(zhuǎn)基因成分含量的物質(zhì)，在轉(zhuǎn)基因生物及其

56、產(chǎn)品檢測中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)常用于給未知含量的材料賦值、校準(zhǔn)測量儀器或裝置以及評(píng)價(jià)測量方法51。轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測中發(fā)揮著極其重要的作用，它擔(dān)當(dāng)著“金標(biāo)準(zhǔn)”的角色。轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值，就是確定的轉(zhuǎn)基因成分含量質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的準(zhǔn)確程度，該轉(zhuǎn)基因百分含量是基于材料DNA中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)比例來計(jì)算的?？梢?，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身必須具有非常精確和穩(wěn)定的特性量值，才能夠用于盲樣的準(zhǔn)確定值。目前，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程中，多用于重量法和實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同的熒光定量PCR法來進(jìn)行賦值52。 本章節(jié)針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中最為常用的兩種類型基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別使用傳統(tǒng)的熒光定量PCR、cdPCR和d

57、dPCR三種方法對(duì)其進(jìn)行定值，并且探討了可能的影響因素（如DNA提取方法、樣品分子結(jié)構(gòu)）對(duì)定值造成的影響，最終將三種平臺(tái)的定值結(jié)果作以全面的比較分析，證明數(shù)字PCR是一種非常適用于轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的新技術(shù)。上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章第一節(jié)第一節(jié) 通過數(shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因生物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值轉(zhuǎn)基因生物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由原始植物材料制成，通常由純合的轉(zhuǎn)基因植物材料和非轉(zhuǎn)基因植物材料按一定質(zhì)量比例配置而成，是發(fā)展最早且應(yīng)用最廣泛的一類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值是指轉(zhuǎn)基因成分（質(zhì)量或拷貝數(shù)）占總質(zhì)量或拷貝數(shù)的百分含量，例如，例如，歐盟有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-BF423d的特性量值是98.5g/

58、kg，則表明每千克該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含有98.5g轉(zhuǎn)基因玉米MIR604。2.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器2.1.1實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因水稻種子TT51-1（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)和提供）；轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（轉(zhuǎn)基因含量分別為5.0%、1.0%和0.5%，由上海交通大學(xué)國家轉(zhuǎn)基因生物分子特征驗(yàn)證測試中心制備）。2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器Nanodrop ND-1000 biophotometer核酸蛋白分析儀（Thermo Scientific公司，美國）；ABI Veriti 96 Well定性PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司，美國）；DY-501型核酸電泳儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司

59、，上海）；UVP Biodoc-It 220 凝膠成像一體機(jī)（SpringScientific公司，美國）；ABI 7900HT熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；Bio-MarkTM Digital PCR系統(tǒng)（Fluidigm富魯達(dá)公司，美國）；QX100TM Droplet DigitalTM PCR系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；Allegra X-22R臺(tái)式冷凍離心機(jī) （Beckman Coulter公司，美國）；Synergy2多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國）Thermo Pico 17離心機(jī) (Thermo Fisher Scientifi

60、c，美國)； LABCONCO Class II A2生物安全柜（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，上海）；PRECISA XT220A 分析天平（上海普利賽斯國際貿(mào)易有限公司，上海）；使用的其他儀器有：Vortex-Genie 2渦旋振蕩儀、低速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、制冰機(jī)和多量程移液器等。2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑以下試劑已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，均從公司購買：DNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，德國）；Wizard Magnetic DNA Purification System For Food（Promega，美國）；ABI GE Mix （Applied Biosystems，美國）；Qu

61、ant-iT PicoGreen dsDNA Kit（Invitrogen，美國）；TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 美國)；ddPCR Master Mix (Bio-Rad, 美國)；實(shí)驗(yàn)中用到的PCR引物和探針均由Invitrogen公司合成。以下試劑為自行配制： 10TE Buffer：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.1 mmol/L EDTA，調(diào) pH8.0；5TBE：108g Tris-堿，55g硼酸，20ml 0.5 mmol/L EDTA，稀世至總體積2L。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1

62、三種方法提取植物基因組DNADNA的質(zhì)量（濃度、純度等）會(huì)對(duì)PCR的效率產(chǎn)生一定影響，為了考察其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的影響，本章選擇了三種實(shí)驗(yàn)室的常用的DNA提取方法，來對(duì)比其抽提DNA后的定值結(jié)果。三種方法分別是： CTAB法、Qigen公司生產(chǎn)的DNeasy Plant Mini Kit商業(yè)化試劑盒以及Promega公司生產(chǎn)的Wizard Magnetic DNA Purification System For Food商業(yè)化試劑盒分別通過這三種方法抽提轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的100%、5%、1%、0.5%四種百分含量的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA。具體步驟如下：CTAB法：（1） 稱取80-150 mg樣品裝入2 mL Eppendorf管中；（2） 加入600-700L已預(yù)熱的Buffer A，顛倒混