2022年高二生物人教版選修1教案：5-2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》

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1、2022年高二生物人教版選修1教案：5-2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》 一、【課題目標(biāo)】 （一）知識(shí)與技能 1、了解PCR技術(shù)的基本操作 2、理解PCR的原理 3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用 ???（二）過(guò)程與方法 　　在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件 （三）情感、態(tài)度與價(jià)值觀 通過(guò)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神 二、【課題重點(diǎn)】 PCR的原理和PCR的基本操作 三、【課題難點(diǎn)】 　PCR的原理 四、【教學(xué)方法】 啟發(fā)式教學(xué) 五、【教學(xué)工具】

2、 多媒體課件 六、【教學(xué)過(guò)程】 （一）引入新課 在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測(cè)、古生物鑒定等都離不開對(duì)DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來(lái)研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)――PCR技術(shù)。 （二）進(jìn)行新課 1．基礎(chǔ)知識(shí) PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程類似： 1．1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析： 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 D

3、NA聚合酶 打開DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點(diǎn) 1．2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程 （1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合教材圖5－6） 核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖） 由核苷酸通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長(zhǎng)鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)： （2）DNA的復(fù)制過(guò)程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。 引物結(jié)合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對(duì)結(jié)合，確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對(duì)。 DNA聚

4、合酶結(jié)合： 子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。 后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(lái)（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈） 子鏈合成特點(diǎn)：不能從頭合成；合成方向?yàn)椤?’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對(duì)功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對(duì)無(wú)誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒(méi)有校對(duì)功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯(cuò)配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真

5、的DNA鏈。 思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？ DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對(duì)；DNA聚合酶的復(fù)查功能。 思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。 1．3DNA分子復(fù)制的人工控制 解開螺旋：在80～100℃時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。 恢復(fù)螺旋：在50℃左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。 復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。 反應(yīng)場(chǎng)所：PCR儀（自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。 思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）4．PCR的反應(yīng)過(guò)程 變性 復(fù)性 延伸

6、 變性：在95℃時(shí)DNA解旋 復(fù)性：在50℃時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合 延伸：在72℃時(shí)合成DNA子鏈（兩個(gè)引物間的序列） 2．實(shí)驗(yàn)操作 2．1 PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水 2．2 實(shí)驗(yàn)操作步驟 2．3 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液； （2）將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中； （3）將微量離心管放到PCR儀中； （4）設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。 （5）DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。 2．4 水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。

7、 3．實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 3．1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。 3．2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。 3．3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。 3．4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。 4．結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 4．1反應(yīng)液稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，添加98μL蒸餾水；2．分光光度計(jì)調(diào)零：將100μL蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。 4．2將100μL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測(cè)定在260nm處的光吸收值。 4．3計(jì)算：DNA含量＝50×光吸收值×稀釋倍數(shù) （三）課堂總結(jié)、點(diǎn)評(píng) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

8、DNA片段 PCR原理 DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物 DNA的變性和復(fù)性受溫度影響 PCR過(guò)程 變性 復(fù)性 延伸 操作步驟 配制PCR反應(yīng)體系 移入離心管 放入PCR 設(shè)置工作參數(shù) DNA擴(kuò)增 測(cè)定含量 稀釋 調(diào)零 測(cè)定并讀數(shù) 計(jì)算 （四）實(shí)例探究 例1 在（ ）的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開 A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃ 解析：蛋白質(zhì)大多不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。 答案：B

9、 例2 關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是（ ） A. DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5’端延伸DNA鏈 B. DNA復(fù)制不需要引物 C. 引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 D. DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸 解析：由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3’端即復(fù)制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。 答案：C ☆綜合應(yīng)用 例3 下列有關(guān)PCR描述，不正確的是（ ） A. 是一種酶促反應(yīng) B. 引物

10、決定了擴(kuò)增的特異性 C. 擴(kuò)增產(chǎn)量按y＝（1＋X）n D. 擴(kuò)增對(duì)象是氨基酸序列 E. 擴(kuò)增對(duì)象是DNA序列 解析：PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸，短時(shí)間內(nèi)迅速?gòu)?fù)制上百萬(wàn)份的DNA拷貝，其擴(kuò)增產(chǎn)量為y＝（1＋X）n，y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，x表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，因此答案選D。 答案：D （五）鞏固練習(xí) 1．DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（ ） A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子 C兩條鏈

11、作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子 D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來(lái)的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子 2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過(guò)程的正確順序是（ ） ①互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂②互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu) A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤ 3.下列各項(xiàng)過(guò)程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有（ ） ①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄 A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤

12、 D①③④⑤ 4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ ） ①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度 A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧ 5.利用PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過(guò)3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長(zhǎng)鏈？（ ） A 2 B 4 C 8 D 16， 6.關(guān)于DNA分子的敘述中，正確的是（ ） A .DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，同向平行 B.DN

13、A的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，反向平行 C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行 7.假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA的片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段（ ） A 215 B 230 C 260 D 231 8.DNA的合成方向總是（ ）延伸。 A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端 C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端 9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（ ）

14、A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度 10.DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（ ） A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同 答案： CDADA CBCCB 七、【課余作業(yè)】 1、PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別？ 2、如果在案件偵破過(guò)程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？ 八、【教學(xué)體會(huì)】 教師在教學(xué)過(guò)程中，可以鮮引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識(shí)，在此基礎(chǔ)上，學(xué)生可加深對(duì)于PCR原理的認(rèn)識(shí)。對(duì)于PCR反應(yīng)過(guò)程的教學(xué)，應(yīng)以

15、讀圖識(shí)圖為主。教材中反應(yīng)過(guò)程圖解詳細(xì)的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應(yīng)的三個(gè)基本步驟—變性、復(fù)性、延伸；每一步驟的作用。教師在教學(xué)中可以請(qǐng)學(xué)生在讀圖的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文字說(shuō)明來(lái)加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時(shí)，教師要及時(shí)給予解答。 九、【資料袋】 免疫-PCR 免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測(cè)系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性來(lái)檢測(cè)抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測(cè). 免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個(gè):①抗原-抗體反應(yīng)，②與嵌合連接分子結(jié)合，③PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技

16、術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個(gè)與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標(biāo)記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物，通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA來(lái)判斷是否存在特異性抗原. 免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為:①特異性較強(qiáng)，因?yàn)樗⒃诳乖贵w特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴(kuò)增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個(gè)抗原的檢測(cè).③操作簡(jiǎn)便，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多，一般實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)行.