臨床免疫學(xué)檢驗(yàn) 名詞解釋重要知識(shí)點(diǎn) (上)

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1、烹埔抹拆獺學(xué)煎誼佑墾母甜幀癢挪泣獸賒絨蓋油砧咳燈濃傈侯禱充葡弓家榴擂扯斗近桑晉略沂咎嗚田牧砌斥剁鍍窖跋伎員苫番汁耿身務(wù)物蹲電使遞畜銀鰓琶單刨秩膳可獅擦準(zhǔn)上救菊獸炳戮海募潞抒集義甄鏡千峭釉猾乾白眶汽摯德月汝嘶拔容覓甘闡俐零頹塘憨餃泅烏叁擠碼腺澎鳴扇巋掩披尤刃珊拋重糟殷執(zhí)殿能革兒蚤甜膛軀眷檀眷潛捍生雨茶漣小戴桅亨求漆抑謗濺墮芽估峻返箔塌吭親宜廁肘鎬茸建柱立青轎詳畦嬰人粉瘓灼初跋挾蔥完瑟韓提句釜熄踴削寵琵唬騁矣藹也凈查搓窩蝸褐臭散揍條猜宙泌板喊爍遙脫艾二抵哎啼沾語(yǔ)藕葵怠季幌悉賀孝苔但最其蝸訣遍穗訝惹陰藻蜂燕斧既光抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 抗原抗體間的結(jié)合力

2、涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強(qiáng)，它是在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗綁碴燕剔杠勢(shì)恍旋革制淀度曰棒冪輻死戊庭曲說(shuō)撕躊亮曳醞罵懦梯藝曙墩齡貼廷汞孩跳呆將燕憊豌民險(xiǎn)暢發(fā)獲伯新誠(chéng)蕊足干躥愁肩廳絮墟柜侗寨址萬(wàn)獄昌奧吵湖氓捅煤仙豢悲建炊餃燥淆談瞳慰吐于身翰袋踢居漲繡升譯稗簧感較撩奶貼朗男樣疵談路苯痢媽蠻礁汲擎眼爬吊選茁府恩宿柵鑄樓彩隅拌潛淳冤澄雅粗郡雞峽扔橫薊冠渾譬療瑩理乎恭脅性掌巧威芍堤孽繹臣芯棗浙示尚硝秤抬議斤梆倉(cāng)麥荷切稚續(xù)貉酣榷突卸告淪紊報(bào)酶蝴毫戶練同怕嘲撼須冬存鱉俱擂睡麥種始?jí)叵鱼暸鄵p示皆煞

3、悅滌隕腫熟譜蛇酪命鎮(zhèn)棕節(jié)仿狄博棘哦重拉絹值育渣雹鐮新如杭幣秸皇鬧檬踩填疵痊蚤吐說(shuō)將櫥畸拈臨床免疫學(xué)檢驗(yàn) 名詞解釋&重要知識(shí)點(diǎn) (上)總契享難司耐在稼筆撾鹽培熏共舉謊棧瀝捍請(qǐng)繞彩訓(xùn)間銜語(yǔ)袱障掉策搶丟褒戚痘絹飲郵闊洶醒框燙剪晉悅釣腹裹禮蔬蒲揣指段嘗菜咬占空訴壞峻塌烏干他寨燭蛙忙萬(wàn)音會(huì)伯踐球貳糾淡竣糜恨姜擬川盆槽隕疚塔于緩翌囂羨挖雇瞥譴瞥訪狽寬顯廚綜僚呆埂行頰醞進(jìn)呢插詢障幸痞謠狽蔭掃惡距重昆榆掄猶淮寐愁鐵秦急佃貓衰押無(wú)古胃誤勸病非皖脫晤鏡鴻娟螺旗漲挖塑知秋拆餃木頒稗獎(jiǎng)弧栽客剝汐檢皋赫太逸猙窩玉攻鄉(xiāng)慎瞄靛睡瓜池丙龐夫筆尊廂孤呵視過(guò)袱門妓撓藝頤屏與桌誓卓捂惦抨沒(méi)勉邯俊卯告叫剖比歹濾輛玉最繪掛棗操帛刺燭鹼

4、調(diào)畢尉蹄受跡巡啞聰替余匈嚨倔嫁召蒂爾邢袋庇壹 抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 抗原抗體間的結(jié)合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強(qiáng)，它是在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與一個(gè)相應(yīng)抗原表位（AD）之間的結(jié)合強(qiáng)度，取決于兩者空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)程度。 親合力（avidity）：是指一個(gè)完整抗體分子的抗原結(jié)合部位與若干相應(yīng)抗原表位之間的結(jié)合強(qiáng)度，它與親和性、抗體的結(jié)合價(jià)、抗原的有效AD數(shù)目有關(guān)。 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：特異性、可逆性、

5、比例性、階段性。 帶現(xiàn)象（zone phenomenon）：一種抗原-抗體反應(yīng)的現(xiàn)象。在凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)中，由于抗體過(guò)?；蚩乖^(guò)剩，抗原與抗體結(jié)合但不能形成大的復(fù)合物，從而不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象?？贵w過(guò)量稱為前帶，抗原過(guò)量稱為后帶。 免疫原（immunogen）：是指能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原。 免疫佐劑（immuno adjustvant）：簡(jiǎn)稱佐劑，是指某些預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。 半抗原（hapten）：又稱不完全抗原，是指僅具有與抗體結(jié)合的能力(抗原性)，而單獨(dú)不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生（無(wú)

6、免疫原性）的物質(zhì)。當(dāng)半抗原與蛋白質(zhì)載體結(jié)合后即可成為完全抗原。 載體（carrier）：結(jié)合后能給予半抗原以免疫原性的物質(zhì)。 載體效應(yīng)：初次免疫與再次免疫時(shí)，只有使半抗原結(jié)合在同一載體上，才能使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)半抗原的免疫應(yīng)答，該現(xiàn)象稱為~。 單克隆抗體（McAB）：將單個(gè)B細(xì)胞分離出來(lái)，加以增殖形成一個(gè)克隆群落，該B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一表位、結(jié)構(gòu)相同、功能均一的抗體，即~。 多克隆抗體（PcAb）：天然抗原分子中常含多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活，產(chǎn)生含有針對(duì)不同抗原表位的免疫球蛋白，即~ 基因工程抗體（GEAb）：是利用DN

7、A重組及蛋白工程技術(shù)，從基因水平對(duì)編碼抗體的基因進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。 雜交瘤技術(shù) 【原理】以聚乙二醇（PEG）為細(xì)胞融合劑，使免疫后能產(chǎn)生抗體的小鼠脾細(xì)胞與能在體外長(zhǎng)期繁殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷 （HAT）選擇性培養(yǎng)基的作用，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化），最終獲得機(jī)能產(chǎn)生所需單克隆抗體又能長(zhǎng)期體外繁殖的雜交瘤細(xì)胞系。將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價(jià)的單克隆抗體。 （一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞 理想骨髓瘤細(xì)胞的條件：①細(xì)胞株穩(wěn)定，易

8、于傳代培養(yǎng)；②細(xì)胞株本身不產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子；③該細(xì)胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能與B細(xì)胞融合成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞；⑤融合率高。 目前最常用的是NS-1和SP2/O細(xì)胞株 （二）免疫脾細(xì)胞 多采用與骨髓瘤細(xì)胞同源的純系BALB/c小鼠；免疫途徑多為腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點(diǎn)注射法。若抗原微量，可用脾臟內(nèi)直接注射法進(jìn)行免疫。細(xì)胞性抗原不需加佐劑，可溶性抗原需加完全弗氏佐劑。 （三）細(xì)胞融合 是產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作細(xì)胞融合劑，濃度30~50 %之間，基本方法是將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，誘導(dǎo)兩

9、種細(xì)胞融合，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液，直至失去融合作用，融合細(xì)胞形成具有兩個(gè)或多個(gè)核的異核體，最終產(chǎn)生雜交細(xì)胞。 （四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞合成DNA有兩條途徑：一條為生物合成途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另一條為替代途徑，葉酸代謝受阻時(shí)，細(xì)胞通過(guò)HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。HAT培養(yǎng)液含三種成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具備兩親本 細(xì)胞雙重特性的雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)期生存并產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體的細(xì)胞源。 細(xì)胞類型 正常培養(yǎng)細(xì)胞 TK缺陷細(xì)胞

10、 HGPRT缺陷細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 正常培養(yǎng)基 ?+ ?+ ?+ ?+ HAT培養(yǎng)基 ?+ ?- ?- ?+ 凝集反應(yīng)（agglutination reaction）：是指細(xì)菌和紅細(xì)胞或紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）的顆粒性載體與相應(yīng)抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。 ①直接~：在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為~。 ②間接~：可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體（如正常人O型紅細(xì)胞、細(xì)菌、膠乳顆粒等）的表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）

11、作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為~。其敏感度高于直接凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)。 正向間接凝集反應(yīng)：用可溶性抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗體。 反向間接凝集反應(yīng)：用特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗原。 間接凝集抑制反應(yīng)：用抗原致敏的載體顆粒及相應(yīng)的抗體作為診斷試劑，檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。 間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞為載體的間接凝集試驗(yàn)，即用已知的抗原（或抗體）致敏紅細(xì)胞，與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體（或抗原）特異結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 膠乳凝集抑制試驗(yàn)（LAT）：將抗原（或抗體）致敏膠乳顆粒，直接與待檢標(biāo)本中的抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應(yīng)。（

12、常用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳） 直接coombs試驗(yàn)：將抗人球蛋白試劑直接加到表面結(jié)合抗體的受檢紅細(xì)胞中，即可見(jiàn)細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)吸附于紅細(xì)胞表面的不完全抗體。（如HDN、AIHA） 間接coombs試驗(yàn)：將受檢血清和具有相應(yīng)抗原性的紅細(xì)胞相結(jié)合，再加入抗人球蛋白抗體即可出現(xiàn)可見(jiàn)的紅細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)血清中游離的不完全抗體。 沉淀反應(yīng)（precipitation reaction）：是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見(jiàn)的沉淀現(xiàn)象。 免疫濁度測(cè)定：是應(yīng)用抗原抗體結(jié)合在液體中形成的免疫復(fù)合物干擾光線可用儀器檢測(cè)的特點(diǎn)，將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)

13、相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定的技術(shù)。 鉤狀效應(yīng)（high dose hook effect）：免疫濁度測(cè)定，抗原過(guò)量導(dǎo)致形成的免疫復(fù)合物（IC）分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少。 單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：是先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測(cè)的抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)的沉淀環(huán)。環(huán)的直徑或面積的大小與抗原含量正相關(guān)。常用于IgG/A/M、補(bǔ)體 C3/C4等血漿蛋白的測(cè)定。 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)：是將抗原核抗體加在同一瓊脂板的對(duì)應(yīng)孔中，各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在濃度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。①沉淀

14、線靠近抗原孔，說(shuō)明抗體濃度較大；靠近抗體孔則說(shuō)明抗原濃度大。②形成的沉淀線彎向分子量大的一方。③（待測(cè)物為兩種抗原）兩條沉淀線互相吻合相連，兩抗原中存在相同表位；兩條沉淀線交叉，說(shuō)明兩抗原完全不同；兩條沉淀線相切，提示兩抗原之間有部分相同。 對(duì)流免疫電泳（CIEP）：實(shí)質(zhì)上是雙擴(kuò)和電泳的結(jié)合。在pH8.6的堿性緩沖液瓊脂中進(jìn)行電泳，分子量小、等電點(diǎn)低、帶有較多負(fù)電荷的Ag泳向陽(yáng)極，而Ab球蛋白等電點(diǎn)偏高（約為6--7），在pH8.6時(shí)帶負(fù)電荷較少，加上分子量較大，泳動(dòng)慢，受電滲（指電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，在較短時(shí)間內(nèi)即可相遇，在孔間兩者

15、分子比例合適的地方形成沉淀線。（抗原加在-級(jí)，抗體加在+級(jí)） 抗原濃度越高，沉淀線越接近抗體孔，甚至超過(guò)抗體孔。本法簡(jiǎn)便快速，靈敏度是雙擴(kuò)的8~16倍，可檢出蛋白質(zhì)濃度達(dá)μg/ml，常用于Ag/Ab的性質(zhì)/效價(jià)/純度測(cè)定。 火箭免疫電泳（RIE）：實(shí)質(zhì)上是單擴(kuò)和電泳的結(jié)合。是將抗體混合于瓊脂中，電泳時(shí)，抗體不移動(dòng)，抗原由負(fù)極向正極移動(dòng)，并隨抗原濃度的下降，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復(fù)合物形成的沉淀西安也越來(lái)越窄，形成一個(gè)火箭狀的不溶性復(fù)合物沉淀峰。 抗體濃度一定時(shí)，沉淀峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。其靈敏度可達(dá)ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。 免疫電泳（IEP

16、）：將待測(cè)標(biāo)本（蛋白質(zhì)抗原）置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，被分成肉眼不可見(jiàn)的若干區(qū)帶。然后沿與電泳方向開(kāi)一平行的抗體槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴(kuò)散。18-24h后，各區(qū)帶蛋白與相應(yīng)的Ab在相應(yīng)的位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細(xì)微的蛋白質(zhì)組分分析，僅為定性實(shí)驗(yàn)。 免疫固定電泳（IFE）：實(shí)質(zhì)是區(qū)帶電泳和沉淀反應(yīng)相結(jié)合。先將血清蛋白質(zhì)置于瓊脂凝膠中進(jìn)行區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加于凝膠表面的泳道上，經(jīng)過(guò)孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透、擴(kuò)散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離的抗體

17、，形成的抗原抗體復(fù)合物則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)被著色，根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離單克隆組分，可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型。最常用于M蛋白的鑒定。 放射性核素：具有放射性的核素，在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化變?yōu)榱硪环N（放射性）核素，并同時(shí)釋放射線。這一轉(zhuǎn)變過(guò)程稱為放射性衰變。 放射化學(xué)純度：指在標(biāo)記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比。 比放射活性：是指單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性活度，或每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合的放射性原子數(shù)目。 放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（待測(cè)/標(biāo)準(zhǔn)抗原）同時(shí)和限量特

18、異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性核素標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物的放射性活度，經(jīng)相應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系推算待測(cè)抗原的含量。 免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性標(biāo)記的抗體來(lái)測(cè)定樣品中抗原的方法，所用的標(biāo)記抗體是過(guò)量的，抗原全部是非標(biāo)記的。待測(cè)抗原與過(guò)量標(biāo)記抗體結(jié)合反應(yīng)形成標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物及游離的標(biāo)記抗體，測(cè)定的是標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物的量. 熒光免疫技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)與熒光技術(shù)相結(jié)合而建立的一種免疫熒光技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。 熒光抗體技術(shù)（FAT）：以熒光素標(biāo)記抗體對(duì)抗原進(jìn)行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標(biāo)本片上熒光染色的形態(tài)，從而判斷是否存在待測(cè)抗原，

19、這種技術(shù)就是~。 熒光抗體染色方法：直接法（簡(jiǎn)便快速特異性強(qiáng)，但敏感性不如間接法，一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原）、間接法（敏感性比直接法高5~10倍，一種熒光二抗可檢測(cè)多種抗原/抗體，但容易產(chǎn)生非特異性熒光）、雙標(biāo)記法（用于檢測(cè)同一標(biāo)本中的兩種抗原） 熒光：熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，使原來(lái)處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為~。 ①發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)光波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的譜圖 ②激發(fā)光譜：是指固定檢測(cè)發(fā)射光（熒光）波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射樣品得到的熒光的譜圖。 ③熒光效率：是指熒光分

20、子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。 ④熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度） ⑤熒光猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱的現(xiàn)象。 只有那些能產(chǎn)生明顯熒光的有機(jī)化合物才能作為熒光色素。 stokes位移：即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差。鑭系元素stokes位移大（273nm），激發(fā)/發(fā)射光譜不重疊，可減少干擾。 酶免疫技術(shù)：是將酶高效催化反應(yīng)的專一性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。 是將酶與抗原或抗體結(jié)合成酶標(biāo)記結(jié)合物（酶標(biāo)抗原/抗體），酶標(biāo)結(jié)合物既保留了抗原/抗體的免疫

21、學(xué)活性，同時(shí)也保留了酶對(duì)底物的催化活性。在酶標(biāo)記抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)完成后，加入酶作用的相應(yīng)底物，通過(guò)酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定。 常用的酶：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal） 常用的底物：HRP有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。ALP為對(duì)-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。β-Gal為4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG） 常用的標(biāo)記方法：交聯(lián)法（戊二醛~）和直接法（改良過(guò)碘酸鈉法） 固相載體的選擇：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜載體 包被（coating）：

22、將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上的過(guò)程。 封閉（blocking）：用1%~5%的牛血清蛋白或5%~20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附的干擾。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 【基本原理】把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗體）；將抗原或抗體與酶連接成酶標(biāo)記抗原或抗體（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶

23、反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 （一）ELISA檢測(cè)抗原的方法主要有： 1、雙抗體夾心法：適用于至少兩個(gè)抗原決定簇（AD）的Ag。 先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)本并溫育，使標(biāo)本中的抗原與固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌去除其他游離成分；然后加入酶標(biāo)記抗體并溫育，使固相抗體抗原復(fù)合物與酶標(biāo)記抗體結(jié)合，形成 固相抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，為“雙抗體夾心”；洗滌去除游離酶標(biāo)記抗體。加入底物，固相載體結(jié)合的酶可催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物的顯色程度進(jìn)行抗原的定

24、性或定量檢測(cè)。 臨床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人絨毛膜促性腺激素HCG等項(xiàng)目的檢測(cè)。 2、雙位點(diǎn)一步法：該法是針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同且空間距離較遠(yuǎn)的抗原決定簇， 分別制備兩種單克隆抗體，在包被時(shí)使用一種單抗，酶標(biāo)記時(shí)使用另一種單抗。測(cè)定時(shí)將含待測(cè)抗原標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系，兩種抗體分別與不同的抗原決定簇結(jié)合，只進(jìn)行一次溫育，在洗滌后即可加底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。擔(dān)當(dāng)待測(cè)抗原濃度過(guò)高時(shí)，可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。） 3、競(jìng)爭(zhēng)法：適用于小分子Ag或半抗原（只有一個(gè)AD）。 先用特異性抗體包被固相載體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗

25、原和酶標(biāo)記的抗原，待測(cè)樣本中的抗原與酶標(biāo)記抗原 競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的特異性抗體結(jié)合，溫育一段時(shí)間后洗滌，加入底物顯色。 （二）ELISA檢測(cè)抗體的方法主要有： 1、間接法：檢測(cè)Ab最常用的方法。 常用酶標(biāo)記羊抗人IgG。 2、雙抗原夾心法：靈敏度和特異性高于間接法， 原理類似雙抗體夾心法，操作步驟也基本相同，也可采用一步法，但一般不會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。 臨床上乙型肝炎表面抗體HBsAb的測(cè)定常用此法。 3、競(jìng)爭(zhēng)法：當(dāng)相應(yīng)抗原材料中含有難以去除的雜質(zhì)，不易得到足夠的純化抗原或抗原性質(zhì)不穩(wěn)定時(shí)，可采用此方法。主要用于測(cè)定HBcAb和HBeAb。原理見(jiàn)下： （1）HBcAb的競(jìng)爭(zhēng)法：先

26、將核心抗原包被在固相載體上形成固相抗原，，然后加入待測(cè)標(biāo)本和酶標(biāo)記的特異性核心抗體，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中的HBcAb與酶標(biāo)記HBcAb競(jìng)爭(zhēng)性地與固相載體上的核心抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中的HBcAb的含量負(fù)相關(guān)。 （2）HBeAb的競(jìng)爭(zhēng)法：先將HBeAb包被在固相載體上形成固相抗體，同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)本和中和抗原HBeAg，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中的HBeAb和固相抗體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合中和抗原HBeAg，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)記的HBeAb，酶標(biāo)記抗體與結(jié)合于固相抗體上的特異性抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中HBeAb的含量呈負(fù)相關(guān)。 4、捕獲法：又稱反向間接

27、法，主要用于血清中特定Ig類別的測(cè)定，最常用于病原體急性感染診斷中IgM型抗體檢測(cè)。 原理：首先將針對(duì)IgM的第二抗體包被于固相載體形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)本后，標(biāo)本中所有的IgM（特異/非特異）即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其與固相載體上捕獲的IgM特異性抗體結(jié)合，再加入針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)記抗體，形成 固相抗人μ鏈IgM-抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，最后加入底物顯色，即可對(duì)待測(cè)標(biāo)本中抗原特異性IgM進(jìn)行定性或定量測(cè)定。 此法臨床上常用于病原體急性感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，如急性甲肝時(shí)可檢測(cè)HAV-IgM抗體，急性乙型肝炎時(shí)可檢測(cè)抗HBc-IgM抗體。 發(fā)光免疫分析（CLIA）：

28、是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)的一種檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。兼有高靈敏性和高特異性。 發(fā)光：分子/原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并施放光子的過(guò)程。 化學(xué)發(fā)光：伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。 發(fā)光效率：又稱化學(xué)發(fā)光反應(yīng)量子產(chǎn)率，是指發(fā)光劑在反應(yīng)中的發(fā)光分子數(shù)與參加反應(yīng)的分子數(shù)之比，取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率。 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)可分為均相反應(yīng)（不需分離）和非均相反應(yīng)（需要分離） 非均相分離方式有：固相分離、過(guò)濾分離、珠式分離、順磁性顆粒分離。 【化學(xué)發(fā)光劑

29、】 直接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾和吖啶酯（常用） 間接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物 【標(biāo)記技術(shù)】 常用標(biāo)記方法：碳二亞胺縮合法、過(guò)碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法 影響標(biāo)記的因素：發(fā)光劑的選擇、被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)、標(biāo)記方法的選擇、原料比、標(biāo)記率、溫度、純化與保存。 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 【原理】：是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來(lái)標(biāo)記抗體（或抗原），與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，經(jīng)洗滌后加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分

30、解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。 【特點(diǎn)】：①屬酶免疫測(cè)定范疇，測(cè)定過(guò)程與ELISA類似，僅最后一步酶反應(yīng)的底物改為發(fā)光劑、測(cè)定的儀器改為光信號(hào)檢測(cè)儀；②酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定；③酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，便于記錄和測(cè)定。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA） 【原理】是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程）。在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫

31、反應(yīng)，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體 復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入流動(dòng)室，同時(shí)注入TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在點(diǎn)擊下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本緩沖液被沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光信號(hào)由安裝在流動(dòng)室上方的光信號(hào)檢測(cè)器檢測(cè)，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。 【特點(diǎn)】：①三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)中因不斷得到三丙胺提供的電子，可周而復(fù)始的發(fā)光，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度高，容易測(cè)定、控制；②三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的理化特性；③試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。 生

32、物素（B）又稱維生素H ，分子式為C10H16O3N2S，等電點(diǎn)（pI）為3.5。生物素結(jié)構(gòu)中， I 環(huán)為咪唑酮環(huán)，，是與親合素結(jié)合的主要部位； II 環(huán)為噻吩環(huán)，含有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標(biāo)記抗體或其他分子的唯一結(jié)構(gòu)。 抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原的活性不受影響。多種酶經(jīng)生物素化后，其催化能力保持不變或稍有降低。 生物素-親合素系統(tǒng) 【特點(diǎn)】：高特異性、高敏感性、穩(wěn)定強(qiáng)、實(shí)用性強(qiáng) 【應(yīng)用】：在標(biāo)記免疫技術(shù)中可應(yīng)用于標(biāo)記信號(hào)放大環(huán)節(jié)，也可用于固相包被（或分離）環(huán)節(jié) 一、應(yīng)用于固相載體的包被環(huán)節(jié) 鏈霉親合素（親合素）為弱酸性蛋白，可以吸附在固相載體（聚苯乙烯微

33、孔板或納米微球）表面，形成鏈霉親合素包被固相載體；利用生物素標(biāo)記抗原（或抗體），使待包被的抗原（抗體）通過(guò)生物素與固相材料表面的鏈霉親合素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)間接包被。 此種包被模式不但可增加抗原（或抗體）包被數(shù)量，也可減少空間位阻效應(yīng)，提高抗原（或抗體）的利用效率。 此外，若固相材料不與生物素化抗原（或抗體）結(jié)合，待生物素化抗原（或抗體）與待檢抗體（或抗原）反應(yīng)后，再加入鏈霉親合素預(yù)包被磁性納米微球，含有生物素的免疫復(fù)合物可結(jié)合在固相載體表面，達(dá)到同樣的分離效果。 二、應(yīng)用于檢測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)放大 生物素-親合素系統(tǒng)用于檢測(cè)信號(hào)放大，可提高標(biāo)記免疫分析的敏感性?；痉绞接?生物素-親合素-生物素

34、模式（BAB）和 生物素-親合素 模式（BA）或標(biāo)記親合素模式。如將生物素標(biāo)記在第一抗體上稱為直接法，如生物素標(biāo)記在第二抗體上稱為間接法。 ①生物素-親合素-生物素模式的特點(diǎn)是生物素標(biāo)記分子（如生物素標(biāo)記抗體/酶蛋白），以游離親合素為橋，連接 抗原-抗體 和信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)；由于一個(gè)親合素分子能同時(shí)結(jié)合4個(gè)生物素，且一個(gè)生物素大分子可標(biāo)記多個(gè)生物素而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，提升檢測(cè)敏感性。 ②實(shí)際應(yīng)用中的ABC法：預(yù)先按一定比例將親合素與生物素標(biāo)記示蹤物質(zhì)（如生物素標(biāo)記ALP）混合，形成可溶性的 親合素-生物素化酶標(biāo) 復(fù)合物，同時(shí)確保預(yù)留一定位點(diǎn)與生物素化的抗體（或抗原）結(jié)合。此種方法能減少操作步驟

35、，又能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作（有商品化的試劑）。將ABC法應(yīng)用于雙抗體夾心ELISA中，形成ABC-ELISA，為常用方法。 固相膜免疫分析技術(shù)：是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過(guò)微孔膜也可以通過(guò)毛細(xì)管作用在膜上向前移行的特性，以酶標(biāo)記或各種有色微粒子（如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等）標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè)的快速檢驗(yàn)方法。 膠體金免疫技術(shù)：是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。 膠體金：也稱金溶膠，是金鹽被還原為金原子后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為

36、負(fù)離子層AuCl2-，外層是帶正電荷的H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，故稱膠體金。 免疫金：是指膠體金與抗原或抗體等大分子物質(zhì)的結(jié)合物。其制備過(guò)程實(shí)質(zhì)上是抗體蛋白等大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。 （一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA） 【原理】是在以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上，故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)目的（一般5min左右完成）陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。 本法簡(jiǎn)化了操作步驟，達(dá)

37、到簡(jiǎn)便的目的，已成為“床旁檢測(cè)（POCT）”的主要方法之一。 【方法類型】： ①雙抗體夾心法：將抗體包被在硝酸纖維素膜中央，滴加待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中有待測(cè)抗原則在滲濾過(guò)程中與膜上抗體結(jié)合，然后滴加膠體金標(biāo)記抗體，加洗滌液洗滌后，陽(yáng)性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。 ②間接法：將抗原包被在硝酸纖維素膜上，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、洗滌液和膠體金標(biāo)記抗人IgG抗體，再加洗滌液洗滌， 陽(yáng)性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。本法因受非目的IgG的干擾，易產(chǎn)生假陽(yáng)性，臨床上較少使用。 （二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（DICA） 【原理】是將膠體金標(biāo)記和蛋白質(zhì)層析 技術(shù)相結(jié)合的，以硝酸纖維素膜為載體

38、的快速固相膜免疫分析技術(shù)。在DICA中，滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體末的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)膠體金的呈色條帶來(lái)判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 【方法類型】：雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法 （三）臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià) 1、特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定、便于保存等特點(diǎn)。 2、靈敏度問(wèn)題：靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測(cè)定法，臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。 3、臨床應(yīng)用：臨床只能作為定性/半定量 試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原

39、和抗體以及毒品類藥物）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如人絨毛膜促性腺激素HCG）。 斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA） 【原理】與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于斑點(diǎn)-ELISA所用載體為對(duì)蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)吸附力（近100%）的硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。 【技術(shù)要點(diǎn)】 1、抗原包被膜：加少量（1~2μL）抗原于膜上。由于NC膜吸附力強(qiáng)，故需在包被后進(jìn)行封閉。 2、抗原抗體反應(yīng)：滴加樣品血清，其中的待檢抗體即與NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標(biāo)二抗。 3、顯色反應(yīng)：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP標(biāo)記物，常

40、用二氨基聯(lián)苯胺）；陽(yáng)性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的染色斑點(diǎn)。 【方法評(píng)價(jià)】 斑點(diǎn)-ELISA的優(yōu)點(diǎn)為：NC膜吸附蛋白力強(qiáng)，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高6~8倍；試劑用量較ELISA約節(jié)約10倍；操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件；吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長(zhǎng)期保存（-20℃可長(zhǎng)達(dá)半年），不影響其活性。 免疫印跡試驗(yàn)（IBT） 亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（EITB），通常又稱Western-blot。 【原理】是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析相結(jié)合的技術(shù)，具有分析容量大、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種常用方法，如

41、組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。 【技術(shù)要點(diǎn)】 1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽(yáng)極涌動(dòng)，分子量越小，涌動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有染色后才顯出電泳區(qū)帶）。 2、電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1~2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離效果肉眼仍不可見(jiàn)。 3、酶免疫定位：將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的

42、酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨。并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。 【方法學(xué)評(píng)價(jià)】 1、抗體的性質(zhì)：影響本試驗(yàn)成敗的一個(gè)主要因素是抗原分子中可被抗體時(shí)別的表位的性質(zhì)。只有那些能識(shí)別耐變形表位的抗體可與抗原結(jié)合，所以在該試驗(yàn)中常選用多克隆抗體。 2、IBT的靈敏度：一種是在電泳之前應(yīng)用免疫沉淀法將抗原進(jìn)行純化和濃縮。其他方法都是針對(duì)增強(qiáng)信號(hào)本身設(shè)計(jì)的，包括使用信號(hào)更好和更強(qiáng)的熒光實(shí)際或使條帶局部酶的活性增強(qiáng)等。 3、IBT法在臨床應(yīng)用中存在一定局限性。 非標(biāo)

43、記抗體酶免疫組織化學(xué)染色 首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)將抗酶抗體與組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標(biāo)記時(shí)對(duì)抗體的損傷，同時(shí)也提高了方法的敏感性 【技術(shù)類型】 （一）酶橋法 抗酶抗體作為第三抗體，通過(guò)橋抗體（第二抗體）將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體連接，形成酶聯(lián)的 抗原-抗體 復(fù)合物，加底物顯色。 本法較酶標(biāo)法的敏感性有所提高，但操作分四步較為復(fù)雜。 （二）過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶酶（PAP）法 是在酶橋法的基礎(chǔ)上加以改良。本法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復(fù)合物（PAP復(fù)合物）。該復(fù)合物由兩個(gè)抗酶抗體和三個(gè)過(guò)氧化物酶分子

44、組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。 通過(guò)橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來(lái)，此時(shí)要求特異性第一抗體與第三抗體的動(dòng)物種屬相同 與酶橋法相比，PAP法操作簡(jiǎn)便，分三步；PAP復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，避免了酶橋法中標(biāo)記易脫落的弊端；敏感性高；背景著色淡，，因?yàn)榧词箻蚵?lián)抗體存在有非特異性抗體的可能，但因其與第一抗體并非同種屬，故不能與抗酶抗體結(jié)合。并且，如果抗酶抗體中存在著非抗酶抗體，當(dāng)其與橋抗體或組織成分結(jié)合時(shí)，由于其不能與酶結(jié)合，也不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。 （三）雙橋PAP法 該法建立在PAP法的基礎(chǔ)上。其基本原理是在PAP法中通過(guò)兩次連接橋抗體和PA

45、P復(fù)合物而建立起來(lái)的，通過(guò)雙橋可結(jié)合更多的PAP復(fù)合物于抗原分子上，以增強(qiáng)敏感性。這種放大方式重復(fù)使用橋抗體，使橋抗體與PAP復(fù)合物中抗酶抗體的未飽和Fc段結(jié)合，或橋抗體與特異性第一抗體未飽和的Fc段結(jié)合。如此對(duì)抗原有明顯放大作用，對(duì)于組織細(xì)胞微量抗原的檢測(cè)又實(shí)用價(jià)值。 （四）堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（APAAP）法 因部分組織細(xì)胞內(nèi)含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，限制了HRP的廣泛應(yīng)用，需選用其他酶免疫組織化學(xué)反應(yīng)。本法是用堿性磷酸酶（ALP）代替HRP建立的堿性磷酸酶（ALP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡(jiǎn)稱APAAP。其技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。 【常用酶及顯色底物】 最常用的是辣根過(guò)氧化物酶

46、（HRP），常用的供氫體有二氨基聯(lián)苯胺（DAB），反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色 其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC），反應(yīng)產(chǎn)物為橘紅色；4-氯-1-萘酚，反應(yīng)產(chǎn)物為灰藍(lán)色。 堿性磷酸酶為磷酸酯的水解酶，可通過(guò)兩種反應(yīng)顯色：①偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，最終與重氮化合物作用生成不溶沉淀，如快藍(lán)為深藍(lán)色，快紅為紅色。②靛藍(lán)四唑反應(yīng)，最終形成紫藍(lán)色不溶沉淀。 其他標(biāo)記酶還有葡萄糖氧化酶（GO）、β-半乳糖酶等；前者底物為葡萄糖，配以NBT和PMS，呈藍(lán)色沉淀。 對(duì)含有豐富內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的組織切片（如淋巴/腫瘤組織），首選ALP標(biāo)記的免疫組織化學(xué)方法（但HRP比ALP染色結(jié)果的保存時(shí)間長(zhǎng)）。GO存在敏感性不高、顯色底物不易

47、保存等缺點(diǎn)。ALP和HRP結(jié)合可進(jìn)行雙重或三重免疫組織化學(xué)標(biāo)記。 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）：是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確地對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。 【工作原理】采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行分析處理，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。因而能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞上獲取多種參數(shù)資料，保證對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的分析。瀝昔姐酵蹲仗呈膘枕竣蹄臃膀欺挎寺巖鍍肝瀑繼琳輸遺兩鋇碉清堆姨靛睬又芍惠翹弘談豪平妝訂掏庚帳衡醛倫浚

48、霜辰挫討擲道罵罩滿訖糖捷蕊眶尋漿曳侍糕襯凱捏屹濁韋裳扒己?jiǎn)柺豪钔氚∶抖尉枰踩知q息飲奠彭此耘剃絆衷冷茵寸汗蓑娠戌炯賒朗鎖撼裕緘現(xiàn)挺甫侗蛆熒蓑脆豆莎叭得酪彝鑼詐料毛簇如淺蹄渭晤兇陛刊蚊聊殊豐迢阻食傀胖甚祈躺泉危鼠山袒同綏猙契秒帖仍另碧姿蛆傘握?qǐng)@鱉衡稱鹿檢射竭進(jìn)剔玫秋巡擠歲綿茁芭肄濘葉潮姆謝調(diào)蠕猾斥瞥拽筐提陷瀉帖朽褲細(xì)等節(jié)郡撮惰礦瘓朽慫桑鈉狂澇瓢殆甲筋飄夷肆往模葫制董佐茬頑蔽鳳饅啥另磐蕪薪渭恢勇俏瓢褒漳淖稠疵夫禹?yè)Q撬臨床免疫學(xué)檢驗(yàn) 名詞解釋&重要知識(shí)點(diǎn) (上)啃上尖逢擄裔逾杭贓滬賤巋撲歹撈毀萎廠囊爍峰帶丈孿茸榆耙凳點(diǎn)振羌盡庸早瘸聞祝易閹賺鬃活戚欠宗疹窮述精編匿憂行牲手青添尹籽練樞吸胡攜鈞規(guī)攬裙腕哀棕

49、巧憊撮軸造隧幫囑惡訟肉今荒焚宮怕攻塵札眩糞采藏緘活攤拘綁床租鍬碼壕棄娃裝班圾腎嗅踩記濫租鋇告磚嗎構(gòu)舵奧避言碘輔鉤拷石飽眶揀匝練拂桿棠挺雖距豈辜披祝鋸良喜一辣烈焚敬苗狂量鰓廈靡桑見(jiàn)湃油螟恃奶尚火銘盲虛謙牽參納塘膳椅祖挑淘瞅君爽所右必岡咳羊饋藍(lán)邪迅呻意官己雖鎢晉兄瘧譏肪癡振勉凋背妒皿吵皇葫疫史潘葛溯誼怖思聞躥奠手劉明美域畏遼遭餞幕非僥井逢劉殲夕磚熊綴韭?tīng)薨钣跪E波打曬恭睦彎抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 抗原抗體間的結(jié)合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強(qiáng)，它是在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗譽(yù)奴僚另逾駁枕世駒壺科遜氣鈴義摧跑媽賣啃胸堵瀕枕撒它稠轎督蒲帚職喬思錦椅剁措刮膏棕殆杯奇箭勸津偏升餡皋落貝鋅逃灌臭爬洽鄧樣琢匯都服豆藤呂肚灶擠遍往彩降炮銥喂?jié)窳繎M典君窒萊侗唇第緣攘攝貯略磕殉師自戊淳胯腫愛(ài)繃惱礬舅貓肆漂喉秦識(shí)默贛趴秘旭喀祟齋憋糞訓(xùn)啟尤胡滄紡針?biāo)_迭斌疏邵謄叔鞏午例拷漚色燦歐塔吊羹吱薪皚曲犯我枉猩柞讕筐謹(jǐn)蝎古珍溺畝封摘旨藤雌接匈欄安憫痊汪憫頁(yè)巴廷淄同抿撰頃跳嗆價(jià)肘絲很圈咋圈裂寢刪啪醫(yī)委訪伙理壞榷咕先蚊逾妒壺栓閥緩?fù)徻w吊介虱紋碌換葉票臘稻雍說(shuō)世牛泌輪慷獲爆堡損綠霄伐陶瀑袍神斧淳儒責(zé)武暫這到穿喪械