生物化學(xué)技術(shù)補(bǔ)充1吸收光譜分析法.ppt

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補(bǔ)充1光譜檢驗(yàn)技術(shù),概念及分類,概念利用各種化學(xué)物質(zhì)具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)分類（根據(jù)物質(zhì)對(duì)光譜響應(yīng)特征的不同，可將其分為）發(fā)射光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)在生化技術(shù)方面，光譜分析是一類十分重要的技術(shù)，應(yīng)用極為廣泛；它既可以研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也可以對(duì)特定物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析,一、吸收光譜分析法,吸收光譜是指波長(zhǎng)連續(xù)分布的光透過(guò)物質(zhì)時(shí)，某些波長(zhǎng)的光被物質(zhì)吸收而產(chǎn)生暗線或暗帶組成的光譜吸收光譜分析法利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量的技術(shù)稱為吸收光譜分析法，是實(shí)驗(yàn)室最常用的分析技術(shù)之一特點(diǎn)它操作簡(jiǎn)便、快速，線性范圍較寬，應(yīng)用廣泛分類目前最常應(yīng)用的技術(shù)有可見(jiàn)紫外分光光度法和原子吸收分光光度法,(一)可見(jiàn)-紫外分光光度法,1.原理L-B爾定律（可見(jiàn)-紫外光區(qū)波長(zhǎng)為200760nm，其中200400nm為紫外光）2.方法對(duì)比法標(biāo)準(zhǔn)曲線法,3.排除干擾的方法,當(dāng)兩種或兩種以上的組分共存時(shí)，可出現(xiàn)吸收光譜重疊的情況；測(cè)定某一組分時(shí)，其他組分對(duì)它會(huì)有不同程度的干擾，此時(shí)可采用雙波長(zhǎng)法排除雜質(zhì)的干擾吸收光譜相互重疊的a、b兩組分。選擇各自的測(cè)得波長(zhǎng)1和2，使干擾組分在這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)相同，而欲測(cè)組分在兩波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)有顯著的區(qū)別。用這樣兩個(gè)波長(zhǎng)測(cè)得混合物溶液的吸光度差值A(chǔ)，只與欲測(cè)組分的濃度成正比，而不受共存組分的影響,在測(cè)得波長(zhǎng)1和2處測(cè)得混合物的吸光度分別是A1a+b和A2a+b，則Aa+b=A1a+b-A2a+b=A1a+A1bA2aA2b=Aa+Ab因組分a在1和2處的吸光系數(shù)相等，即欲測(cè)組分b在兩波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)相差愈大，則靈敏度愈高。用雙波長(zhǎng)法還能消除樣品溶液背景吸收的干擾和混濁的干擾，提高測(cè)定的準(zhǔn)確性。近年來(lái)由于新的、靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過(guò)程即可直接比色測(cè)定；還可采用聯(lián)立方程法、等吸收點(diǎn)法等解決定量中的干擾問(wèn)題,3.分光光度計(jì)的光源檢查和波長(zhǎng)校正,(1)光源檢查即波長(zhǎng)的初步檢查不論何種分光光度計(jì)在校正之前都要先檢查光源。檢查方法是將波長(zhǎng)選定在580nm處，將狹縫開(kāi)到最大(或打開(kāi)光門)，打開(kāi)鎢燈，在比色皿內(nèi)插一白紙片。光源正常時(shí)，應(yīng)看到均勻的黃色光斑，邊緣清晰整齊；如果明暗不勻，形狀異常，則應(yīng)調(diào)節(jié)光源燈的位置,常用的方法有用含某些特定元素的玻璃來(lái)較正最常用的有鐠釹玻璃、鈥玻璃等。校正時(shí)將這種玻璃放在比色皿座上，以空氣調(diào)0，測(cè)定幾個(gè)吸收峰值的波長(zhǎng)是否相符。如最常用的測(cè)定鐠釹濾光片在585nm的雜光水平應(yīng)在5%以內(nèi)可利用某些標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正如標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀溶液(在1000ml的0.05molL的KOH溶液中溶解0.0400g純重鉻酸鉀(K2CrO4)，在25以1cm比色皿在各波長(zhǎng)測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)吸光度，如表21。重鉻酸鉀溶液的優(yōu)點(diǎn)是在紫外區(qū)270nm及370nm處有兩個(gè)最大吸收,(2)波長(zhǎng)校正,(二)原子吸收分光光度法,1.原理基于光源輻射出具有待測(cè)元素特征譜線的光，通過(guò)原子化器被其中待測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收，根據(jù)吸收而導(dǎo)致輻射特征譜線光被減弱的程度來(lái)測(cè)定待測(cè)元素的含量2.方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法、直接比較法和標(biāo)準(zhǔn)加入法主要用于鈣、鎂、銅、鉛、鋅等微量元素的測(cè)定3.原子吸收分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有單光束型和雙光束型兩類。主要由光源、原子化器、單色器和檢測(cè)系統(tǒng)組成,在微量元素測(cè)定中，首先根據(jù)有關(guān)資料了解儀器待測(cè)元素的靈敏度和檢出限對(duì)靈敏度達(dá)不到要求的可以選擇最靈敏的吸收線，選用小的狹縫寬度，采用較小的燈電流和最佳火焰類型及狀態(tài)等來(lái)提高靈敏度測(cè)定物質(zhì)溶解后干擾要小，易于噴霧和原子化，稀釋后測(cè)定結(jié)果應(yīng)在線性范圍內(nèi)儀器通電后要預(yù)熱30min，使光源的發(fā)射穩(wěn)定。狹縫的寬度影響光的譜帶寬度與檢測(cè)器的接受能量，使用較寬的狹縫可以增加光強(qiáng)度，提高信噪比，改善檢出限當(dāng)吸收線附近有干擾譜線與非吸收光存在時(shí)，使用較寬的狹縫會(huì)降低靈敏度。在火焰化法中，火焰的類型是影響原子化效率的主要因素。因此，需通過(guò)調(diào)節(jié)燃?xì)馀c助燃?xì)獾牧髁揩@得最佳原子化條件，以達(dá)到最高的測(cè)定靈敏度總之，一種元素的原子吸收法測(cè)定需要考慮儀器工作的各種條件，以期達(dá)到實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果,二、發(fā)射光譜分析法,基本概念熒光某些物質(zhì)吸收了一定波長(zhǎng)的光能后，獨(dú)自從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，此類分子經(jīng)與同類或其他類分子相互碰撞，消耗相當(dāng)，而下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能階。最低能階下降到基態(tài)，同時(shí)發(fā)射出較原來(lái)所吸收的頻率低、波長(zhǎng)長(zhǎng)的光能，稱為熒光熒光分析法對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定的方法發(fā)射光譜分析法分類熒光分析法火焰光譜法,(一)熒光分析的基本原理,1.原理利用元素的原子所發(fā)射的共振熒光波長(zhǎng)的差異，可確定元素的種類或物質(zhì)分子中某種結(jié)構(gòu)，據(jù)熒光的強(qiáng)弱可以測(cè)定物質(zhì)的含量2.方法熒光分析定量是基于熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的溫度下，當(dāng)激發(fā)光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度、熒光測(cè)定波長(zhǎng)以及液層厚度一定時(shí)，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度F與該溶液中熒光物質(zhì)的濃度C成正比，即F=kC。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法，對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行定量。在一定條件下，熒光物質(zhì)的濃度愈大，發(fā)射的熒光強(qiáng)度也愈強(qiáng)（熒光分析的靈敏度比分光度法高，通?？蛇_(dá)10-13gL，對(duì)特定物質(zhì)甚至可達(dá)到10-15gL）,(二)影響熒光分析的因素,1.溶劑配制溶液的溶劑除水外，常用的乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳、氯仿、丙酮等溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測(cè)定，必須經(jīng)過(guò)重蒸餾等凈化處理才能使用2.熒光物質(zhì)的濃度熒光強(qiáng)度與溶液的線性關(guān)系只限于很稀的溶液，符合下列方程：F=kCI0，式中F為熒光強(qiáng)度，C為溶液的濃度，I0為激發(fā)光強(qiáng)度，k為熒光效率。對(duì)于較濃的溶液，熒光強(qiáng)度并不隨濃度增大而增加，相反，卻隨溶液濃度增大而下降。當(dāng)熒光物質(zhì)濃度高時(shí)，分子間碰撞增加，使熒光強(qiáng)度減弱；另外，濃度較大時(shí)，激發(fā)光被表面的熒光物質(zhì)所吸收，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，以致使后面的溶液不易受照射而不發(fā)光3.溫度大多數(shù)情況下，溫度升高，分子間碰撞次數(shù)便增加，消耗分子的內(nèi)部能量而產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象；溫度降低時(shí)，則熒光強(qiáng)度增大,(三)熒光分析技術(shù)的應(yīng)用,熒光分析法靈敏度高、取樣量少，廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，在生化技術(shù)領(lǐng)域主要用于糖類、胺類、甾族化合物、DNA與RNA、酶與輔酶、維生素等物質(zhì)的分析測(cè)定熒光強(qiáng)度常用熒光分光光度計(jì)，它主要包括激發(fā)光源、一對(duì)單色器、比色杯和檢測(cè)器等部件,熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜,激發(fā)光譜與熒光光譜,激發(fā)光譜（吸收光譜）熒光物質(zhì)吸收紫外光后被激發(fā)出熒光，如果將激發(fā)光的光源用單色器使其分光后，測(cè)定在每一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，物質(zhì)發(fā)射的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)作圖，得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜熒光光譜（發(fā)射光譜）如果使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，而讓物質(zhì)所發(fā)生的熒光通過(guò)單色器色散，依次將不同波長(zhǎng)的熒光照射到單色器上，并依次測(cè)定其熒光強(qiáng)度，然后以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的熒光作圖，得到該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜,三、散射光譜分析法,散射光譜分析法測(cè)定光通過(guò)溶液混懸顆粒后的吸光度或光散射程度的一類定量方法散射比濁法是指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)遇到抗原抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)以及抗原抗體復(fù)合物顆粒大小、數(shù)目密切相關(guān)。散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比透射比濁法是測(cè)定一定體積的溶液通過(guò)的光線量(光通量)，當(dāng)光線通過(guò)時(shí)，由于溶液中存在抗原抗體復(fù)合物粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測(cè)得的光通量和抗原抗體復(fù)合物的量成反比,發(fā)射光譜分析法,(一)散射免疫比濁分析1散射顆粒與散射光的關(guān)系懸浮在反應(yīng)溶液中的分子，無(wú)論是固體還是膠體粒子都可以是散射中心。當(dāng)入射光通過(guò)時(shí)，如果顆粒直徑比入射光的波長(zhǎng)小很多，則散射光比較均勻的分布于顆粒的四周，稱為Rayleigh散射；如果顆粒直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)地大于入射光的波長(zhǎng)，則散射光的分布呈明顯不勻稱為Mie散射,2.反應(yīng)物含量與散射濁度抗原抗體結(jié)合反應(yīng)中，遵守典型的Heidelberger曲線,(二)免疫透射比濁分析,原理試驗(yàn)中設(shè)計(jì)檢測(cè)抗體過(guò)量，待測(cè)樣品中的Ig在反應(yīng)介質(zhì)中與相應(yīng)的檢測(cè)抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成不溶性復(fù)合物，在聚乙二醇(PEG)的作用下，加速抗原-抗體復(fù)合物的形成并增加其穩(wěn)定性，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變，利用分光光度計(jì)測(cè)定光線被吸收的量，待測(cè)樣本的抗原含量與吸光度成正比，光通量與抗原含量成反比。利用標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣本的濁度變化在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出來(lái),