生物化學(xué)：第十八章 重組DNA技術(shù)

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1、 第十八章第十八章 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)基因重組基因重組(genetic recombination)(genetic recombination) 是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的DNADNA進(jìn)行切割、連接，進(jìn)行切割、連接，組成一個(gè)新的組成一個(gè)新的DNADNA分子的過程，又稱分子的過程，又稱DNADNA重組重組?；蚩寺』蚩寺?gene cloning)(gene cloning) 將重組將重組DNADNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的同一殖，以獲得大量的同一DNADNA分子，稱此為分

2、子，稱此為基因克隆、基因克隆、DNADNA克隆克隆或分子克隆或分子克隆。基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering) 是將不同來源的是將不同來源的DNADNA片段與載體分子連接形成重組片段與載體分子連接形成重組DNADNA分子，分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，也稱再導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，也稱重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)。 本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 重要的工具酶重要的工具酶 基因克隆常用的載體基因克隆常用的載體 重組重組DNADNA基本原理基本原理 重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥 工業(yè)中的應(yīng)用工業(yè)中的應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 重要的工具

3、酶重要的工具酶工工具酶具酶 基因工程中的工具酶主要包括基因工程中的工具酶主要包括用于用于DNADNA和和RNARNA分子分子的的切割切割、連接連接、聚合聚合、逆、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄等等相關(guān)相關(guān)的各種酶類的各種酶類。一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE) 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別雙鏈雙鏈DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)中的中的特異堿基序列，并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割的內(nèi)切酶，特異堿基序列，并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割的內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱限制酶限制酶。 根據(jù)限制酶作用特性，一般分為根據(jù)限制酶作用特性，一般分為、和和型，型， 其中常用的是

4、其中常用的是型限制酶型限制酶。命名命名：H in d IIIH in d III 屬屬 種種 株株 同一株具不同特異性酶同一株具不同特異性酶 限制酶（限制酶（型）識(shí)別及切割位點(diǎn)型）識(shí)別及切割位點(diǎn) 特異識(shí)別及切割特異識(shí)別及切割4 4 7 7個(gè)個(gè)bpbp長(zhǎng)度且具有長(zhǎng)度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片斷，主要產(chǎn)生片斷，主要產(chǎn)生3 3種末端結(jié)構(gòu)：種末端結(jié)構(gòu)： 55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平端或鈍端平端或鈍端 回文序列回文序列(palindrome)(palindrome) 是指該部位的核苷酸序列呈是指該部位的核苷酸序列呈180180O O反向重復(fù)反向重復(fù); ; 粘性末端粘性末端

5、(sticky end)(sticky end) 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的55末端突出和末端突出和33末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性。 產(chǎn)生產(chǎn)生5-5-粘性末端粘性末端-G-CTTAA53AATTC-G-35-G-CTTAA53AATTC-G-35+EcoR I 產(chǎn)生產(chǎn)生3-3-粘性末端粘性末端-CTGCA-G53G-ACGTC-35-CTGCA-G53G-ACGTC-+Pst I35 產(chǎn)生平產(chǎn)生平( (頭末頭末) )端端/ /鈍端鈍端5-CCC3-GGGGGG-3CCC-5+Sma I5-CCC3-GGGGGG-3CCC-

6、5 常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱微生物名稱酶名稱酶名稱識(shí)別順序識(shí)別順序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢桿菌解淀粉芽孢桿菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢桿菌球芽孢桿菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大腸桿菌大腸桿菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普羅威登細(xì)菌普羅威登細(xì)菌PstCTGCAGSalpStreptomyces al

7、busSubspecies pathocidicus白色鏈球菌白色鏈球菌SalGTCGACAvaXho10 限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 通過切割不同來源通過切割不同來源DNA雙鏈的特異堿雙鏈的特異堿基序列，基序列，產(chǎn)生產(chǎn)生含有黏性末端或平端的、長(zhǎng)含有黏性末端或平端的、長(zhǎng)度不同的度不同的DNA片段。片段。 用于用于DNA重組、制備探針、分子雜交、重組、制備探針、分子雜交、DNA序列分析等。序列分析等。二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 （最常用的最常用的DNADNA聚合酶有以下聚合酶有以下4 4種種） DNADNA聚合酶聚合酶（全酶）（全酶） DNADNA聚合酶聚合酶大片段大片段Klen

8、owKlenow片段片段 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 T T4 4 噬菌體噬菌體DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 E.Coli E.Coli DNADNA聚合酶聚合酶（DNA pol DNA pol ） 是一個(gè)具有是一個(gè)具有3 3 種酶活性的多功能性酶。種酶活性的多功能性酶。包括：包括： 5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性 DNA pol DNA pol 應(yīng)用應(yīng)用 常用來常用來催化催化DNADNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNADNA 探針探針

9、； cDNAcDNA第二條鏈的合成；第二條鏈的合成； 填補(bǔ)填補(bǔ)3 3 突出末端；突出末端； DNADNA序列分析。序列分析。E. coliE. coli DNA pol. DNA pol. 催化缺口平移催化缺口平移*T*T*T*TMg2+D N a s e I53353 5533553355335dATP,dCTP,dGTP-32P dTTPE. coli DNA POL I Klenow Klenow片段（片段（DNA pol.DNA pol.大片斷）大片斷） KlenowKlenow片段用途片段用途 雙鏈雙鏈DNADNA的的 33末端標(biāo)記；末端標(biāo)記；聚合酶Klenow DNA -32PdN

10、TP雙鏈DNA粘端5-外切酶變性+5335353533555533標(biāo)記探針標(biāo)記末端（2 2）用于用于cDNAcDNA克隆克隆中第二股鏈的合成中第二股鏈的合成； Taq DNA pol Taq DNA pol（耐熱（耐熱DNADNA聚合酶）聚合酶） 作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)1 1） Taq DNA polTaq DNA pol催化催化DNADNA合成的最適溫度范圍合成的最適溫度范圍 70 70 7575，2 2） 9595以上高溫，半小時(shí)不失活，以上高溫，半小時(shí)不失活， 3 3） 最適合用于最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）擴(kuò)增）擴(kuò)增DNADNA片段片段。 三、逆轉(zhuǎn)錄酶三、逆轉(zhuǎn)錄酶(r

11、everse transcriptase) 特點(diǎn)特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3 3種酶種酶活性：活性： 以單鏈以單鏈RNARNA為模板，為模板， 催化合成催化合成cDNAcDNA單鏈單鏈 具有具有RNase H RNase H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA雜交鏈中的雜交鏈中的 RNARNA 以以DNADNA為模板，為模板，催化合成催化合成cDNAcDNA雙鏈。雙鏈。 逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用： 將將mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA，構(gòu)建，構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫； 補(bǔ)平和標(biāo)記補(bǔ)平和標(biāo)記5 5

12、- -末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段； 代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析； 制備雜交探針等。制備雜交探針等。四、四、DNADNA連接酶連接酶(DNA ligase)(DNA ligase) 催化雙鏈催化雙鏈DNADNA中一條鏈的中一條鏈的33OHOH與另一條鏈的與另一條鏈的55POPO3 3H H2 2形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)成完整的形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)成完整的DNADNA長(zhǎng)長(zhǎng)鏈。鏈。 DNADNA連接酶的用途連接酶的用途（1 1） 兩個(gè)雙鏈兩個(gè)雙鏈DNADNA片段連接起來片段連接起來5- ACG AATTCGT-3 5- ACG AATT

13、CGT-3 T T4 4DNADNA連接酶連接酶 5-ACGAATTCGT-35-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2） 修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNADNA分子分子T4DNA連接連接酶酶五、堿性磷酸酶五、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能夠催化水解去除能夠催化水解去除DNADNA或或RNA5-RNA5-端的磷酸基團(tuán)。端的磷酸基團(tuán)。用途用途 制備載體制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 55端磷酸基后，可

14、防止載體自身環(huán)化連接，提端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。高重組效率。 用用3232P P標(biāo)記標(biāo)記5-5-端前，去除端前，去除5-P5-P，再通過激酶作用，再通過激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端進(jìn)行標(biāo)記端進(jìn)行標(biāo)記。六、末端六、末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT)(TdT) 作用作用 將標(biāo)記或未標(biāo)記的將標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的33OHOH末端；也可催末端；也可催化載體分子或待克隆的化載體分子或待克隆的DNADNA片段上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)片段上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一步連接。一步連接。應(yīng)用應(yīng)用 探針標(biāo)記

15、探針標(biāo)記 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接3 3 3 3 重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異堿基序列，切割識(shí)別特異堿基序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸與磷酸與3 3- -羥基羥基 形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA為模板合成為模板合成DNA DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 以以RNARNA為模板合成為模板合成

16、cDNA cDNA 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除切除5 5 末端磷酸末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羥基磷酸化羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化催化3-3-端合成同聚尾端合成同聚尾第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆常用的載體基因克隆常用的載體載體載體(vector)(vector) 是指能在連接酶作用下和外源是指能在連接酶作用下和外源DNADNA片段連接起來，并運(yùn)送片段連接起來，并運(yùn)送到宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。到宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。 其化學(xué)本質(zhì)為其化學(xué)本質(zhì)為DNADNA分子分子 。 本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件載體必須具備的基本條件

17、 載體的分類載體的分類 常用的載體常用的載體一、載體必須具備的基本條件一、載體必須具備的基本條件 具有獨(dú)立復(fù)制能力具有獨(dú)立復(fù)制能力 具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)( (多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)) ) 具有具有遺傳表型或遺傳表型或篩選篩選標(biāo)記標(biāo)記 有有足夠的容量足夠的容量以容納外源以容納外源DNADNA片段片段 可導(dǎo)入受體細(xì)胞?？蓪?dǎo)入受體細(xì)胞。二、載體的分類二、載體的分類*（一）（一） 克隆載體克隆載體 用來克隆和擴(kuò)增用來克隆和擴(kuò)增DNADNA片段的載體。片段的載體。 有質(zhì)粒有質(zhì)粒DNADNA、噬菌體、噬菌體DNADNA和病毒和病毒DNADNA三類三類。 （二）（二） 表達(dá)型載體表

18、達(dá)型載體 為了使插入的外源為了使插入的外源DNADNA能夠表達(dá)為多肽鏈而設(shè)計(jì)能夠表達(dá)為多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體稱為的載體稱為表達(dá)型載體表達(dá)型載體。 表達(dá)型載體表達(dá)型載體除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的啟啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子等表達(dá)調(diào)控等表達(dá)調(diào)控構(gòu)件。構(gòu)件。三、常用的載體三、常用的載體 （一）（一） 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)(plasmid)： 是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀狀DNADNA分子。分子。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下

19、特點(diǎn)： 1. 1. 分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)；有較高的拷貝數(shù)； 2. 2. 具有具有1 1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選；個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選； 3. 3. 具有多克隆位點(diǎn)。具有多克隆位點(diǎn)。 總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的較小、高拷貝的“松弛型松弛型”質(zhì)粒，且具有一質(zhì)粒，且具有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、質(zhì)粒、pUC系列等系列等 pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒 4363 bp 43

20、63 bp 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素基因含一個(gè)抗氨卞青霉素基因( (ampampR R) ) 一個(gè)抗四環(huán)素基因一個(gè)抗四環(huán)素基因 ( (tettetR R) ) ampampR R和和tettetR R抗性基因內(nèi)各有抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入外源基因插入 當(dāng)外源基因插入抗藥基當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。因內(nèi)后，抗藥基因失活。AmpAmpR RAmpAmp敏感敏感( (AmpAmpS S ) )、TetTetR RTetTet敏感敏感( (TetTetS S).).pUC系列質(zhì)粒系列質(zhì)粒 由由pBR322pBR322和

21、和M13M13噬菌體構(gòu)建噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1 1） 2674bp2674bp；（2 2） 有有ampampR R和與和與M13M13噬菌體噬菌體 相同的多克隆位點(diǎn)（相同的多克隆位點(diǎn)（MCSMCS）（3 3）有）有1 1個(gè)來自個(gè)來自E.coliE.coli的的LacZLacZ基基因因片斷片斷, , 編碼半乳糖苷酶，編碼半乳糖苷酶，便于藍(lán)白篩選便于藍(lán)白篩選 ( (二二)噬菌體噬菌體 組成特點(diǎn)組成特點(diǎn)： 雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA分子，分子， 全長(zhǎng)全長(zhǎng)50kb50kb， 含含6666個(gè)基因，個(gè)基因， 在其分子兩端各含有在其分子兩端各含有1212個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是

22、個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為天然的粘性末端，被稱為COSCOS位點(diǎn)位點(diǎn)。 噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖）噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖） 噬菌體感染細(xì)菌后的噬菌體感染細(xì)菌后的兩種生長(zhǎng)途徑兩種生長(zhǎng)途徑 溶菌性生長(zhǎng)溶菌性生長(zhǎng) 噬菌體感染細(xì)菌后，借助其噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2 2個(gè)個(gè)COSCOS位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)成環(huán)，在宿，在宿主菌體內(nèi)主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，顆粒，裂解宿主菌裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。，釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。 溶源性生長(zhǎng)溶源性生長(zhǎng) 噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身噬菌體

23、感染細(xì)菌后，可將自身DNADNA整合整合到細(xì)菌的染色體到細(xì)菌的染色體中去，與之中去，與之一起復(fù)制一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解解 。 第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNADNA基本原理基本原理 （DNADNA重組基本程序包括下列過程）重組基本程序包括下列過程） 分分獲取目的基因和載體獲取目的基因和載體 接接目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩篩重組重組DNADNA的篩選與鑒定的篩選與鑒定一、目的基因的獲?。ㄒ?、目的基因的獲?。ǚ址郑┠康幕蚰康幕?是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克是指所要研究

24、或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。隆或表達(dá)的基因。 目的基因來源目的基因來源 1 1） 制備基因組制備基因組DNADNA 2 2） 制備制備cDNAcDNA 3 3） 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) 4 4） 人工合成基因人工合成基因（一）制備基因組（一）制備基因組DNADNA（基因（基因文庫，文庫， genomic library ）分離、純化基因組分離、純化基因組DNADNA 在在EDTAEDTA等存在下，用蛋白等存在下，用蛋白 RERE 酶酶K K消化細(xì)胞、酚抽提；消化細(xì)胞、酚抽提；大小不同酶切片段大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度離心或電泳常用蔗糖梯度離心或電泳 分離酶切片斷；分離酶切片斷

25、；分別與同樣分別與同樣RERE酶切的載體連接酶切的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 DNADNA連接酶連接；連接酶連接； 導(dǎo)入宿主細(xì)胞、擴(kuò)增導(dǎo)入宿主細(xì)胞、擴(kuò)增 導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)、擴(kuò)增；導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)、擴(kuò)增； 得到分子克隆混合體得到分子克隆混合體 用分子雜交等方法進(jìn)行鑒定、用分子雜交等方法進(jìn)行鑒定、（基因文庫）（基因文庫） 篩選、再擴(kuò)增，分離、回收。篩選、再擴(kuò)增，分離、回收。 （二）制備（二）制備cDNA （cDNA文庫）文庫） 分離目的基因分離目的基因 的的mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄生成逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAcDNA單鏈單鏈 水解去除水解去除mRNAmRNA， 合成合成

26、cDNAcDNA雙鏈雙鏈 水解回折處單鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈得到平端雙鏈cDNAcDNA與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增 構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫。文庫。（三）聚合酶鏈反應(yīng)（三）聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)( PCR) 在體外，在體外，以目的基因?yàn)槟０?，在以目的基因?yàn)槟０?，在DNADNA引物、引物、dNTPdNTP、TaqDNA PolTaqDNA Pol等存在下，構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)體系。經(jīng)等存在下，構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)體系。經(jīng)9494變性、變性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2525 3030次次），擴(kuò)增目的基因），擴(kuò)增

27、目的基因. . （四）人工合成基因（四）人工合成基因 應(yīng)用應(yīng)用DNADNA測(cè)序儀測(cè)出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNADNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。合成目的基因。 （一般先合成短片斷一般先合成短片斷DNADNA，然后再拼接成長(zhǎng)片段，然后再拼接成長(zhǎng)片段） 二、二、 目的基因與載體的連接（目的基因與載體的連接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4種連接方式）種連接方式） 1) 1) 粘性末端連接粘性末端連接 2 2） 平頭末端連接平頭末端連接 3

28、 3） 人工接頭法人工接頭法 4 4） 同源多聚尾連接法同源多聚尾連接法 （一）（一） 粘性末端連接粘性末端連接 將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生 相同粘性末端，再通過相同粘性末端，再通過DNADNA連接酶作用將兩者連接起連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組來，構(gòu)成重組DNADNA分子。分子。 （二）平頭末端連接（二）平頭末端連接 有些限制酶只能將目的基因和載體有些限制酶只能將目的基因和載體DNADNA切割成切割成平端，此時(shí)在平端，此時(shí)在T T4 4DNADNA連接酶連接酶的作用下同樣能連接起的作用下同樣能連接起來。來。（三）（三） 人工接頭法人工

29、接頭法 合成合成連接子連接子與與DNADNA平頭末端連接平頭末端連接限制酶切割限制酶切割, ,產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端連接，構(gòu)建重組連接，構(gòu)建重組DNADNA。（四）同源多聚尾連接法（四）同源多聚尾連接法三、重組三、重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)） 無性繁殖無性繁殖 體外重組后的體外重組后的DNADNA導(dǎo)入導(dǎo)入受體細(xì)胞受體細(xì)胞，然后隨受體細(xì)胞，然后隨受體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，使重組生長(zhǎng)、增殖，使重組DNADNA發(fā)生復(fù)制、擴(kuò)增，這一過程稱發(fā)生復(fù)制、擴(kuò)增，這一過程稱為無性繁殖。為無性繁殖?？寺】寺?從上述無性繁殖細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出含目的從上述無性繁殖細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出含目的DNADNA

30、的的重組體分子即為無性繁殖系或克隆。重組體分子即為無性繁殖系或克隆。宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞 進(jìn)行無性繁殖時(shí)所采用的受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖時(shí)所采用的受體細(xì)胞. . 重組重組DNADNA導(dǎo)入導(dǎo)入宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞的類型類型轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 以以質(zhì)粒質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 以病毒以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) 以以噬菌體噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 用特殊方法處理（用特殊方法處理（CaCL2）后，受體細(xì)胞才具備接）后，

31、受體細(xì)胞才具備接受外源受外源DNA的能力，的能力， 這種細(xì)胞稱這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。 感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。 四、重組四、重組DNA的篩選與鑒定（的篩選與鑒定（篩篩）（篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法） 1） 平板篩選平板篩選 2） 限制酶切圖譜篩選限制酶切圖譜篩選 3） PCR篩選重組體篩選重組體 4） 原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)插入失活插入失活藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選（一）（一） 平板篩選平板篩選 是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選的方法。

32、的方法。 具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（在含抗生素（Amp或或Tet）的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)）的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化的則不能生長(zhǎng)?；膭t不能生長(zhǎng)。1. 插入失活插入失活 當(dāng)外源當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。培養(yǎng)平板上。 抗生素平板篩選抗生素平板篩選（插入失活插入失活） 2. 2. 藍(lán)藍(lán)- -白白篩選篩選 利用藍(lán)色化合物的形成作為利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)

33、菌。，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。 載體：載體：編碼編碼-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 編碼編碼-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 - -互補(bǔ)互補(bǔ)細(xì)菌表達(dá)：細(xì)菌表達(dá)： -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成藍(lán)色菌落藍(lán)色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源插入外源DNADNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能與宿主不能與宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端進(jìn)行進(jìn)行-互補(bǔ)互補(bǔ)產(chǎn)生產(chǎn)生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 藍(lán)藍(lán)白白篩選篩選示意圖示意圖 ( (二二) ) 限制性內(nèi)切酶

34、圖譜鑒定限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定（三）（三） PCRPCR篩選重組體篩選重組體 抽提少量重組抽提少量重組DNADNAPCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增電泳鑒定電泳鑒定序列分析。序列分析。（四）（四） 原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)1 1、獲取、獲取TTTTAAAA質(zhì)粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATT DNADNA重組基本過程重組基本過程( (小結(jié)小結(jié)) )2 2、重組、重組TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT3 3、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中(如E. coli)宿主細(xì)胞染色體DNA重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒體體4 4、篩選、篩選篩選含有重組質(zhì)粒的菌株宿主細(xì)胞

35、染色體DNA重組質(zhì)粒含有外源DNA的“工程菌”5 5、克隆、克隆含有外源DNA的“工程菌”繁殖/擴(kuò)增6 6、表達(dá)、表達(dá)表 達(dá) 產(chǎn) 物 分 離 純 化表達(dá)產(chǎn)物分離純化表達(dá)產(chǎn)物分離純化 五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控 基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牖蚬こ痰淖罱K目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白合適的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。質(zhì)產(chǎn)品。 克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件 基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷; ; 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主

36、基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主 細(xì)胞的細(xì)胞的RNARNA聚合酶有效地識(shí)別聚合酶有效地識(shí)別; ; mRNA mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外 源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。第四節(jié)第四節(jié) 重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)一、疾病基因的發(fā)現(xiàn) 19901990年年美國科學(xué)家率先啟動(dòng)美國科學(xué)家率先啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（HGPHGP），），計(jì)劃歷時(shí)計(jì)劃歷時(shí)1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2

37、2月月1212日日由由SinceSince和和NatureNature雜志同時(shí)向世界雜志同時(shí)向世界宣布，人類基因組宣布，人類基因組3X103X109 9bpbp的最新圖譜，約含的最新圖譜，約含3 3 4 4萬個(gè)萬個(gè)基因；基因； 整個(gè)人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。整個(gè)人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。但要揭示人類但要揭示人類4 4萬個(gè)基因功能的任務(wù)將更為艱巨。萬個(gè)基因功能的任務(wù)將更為艱巨。 人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個(gè)開放框架，而且為分離、鑒定人的定位建立了一個(gè)開放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照

38、模板。類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。 如已知人類遺傳性疾病約有如已知人類遺傳性疾病約有30003000種，推測(cè)可能種，推測(cè)可能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。如果如果利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正常利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正常基因圖譜作對(duì)照分析基因圖譜作對(duì)照分析，必將有助于闡明遺傳病的分，必將有助于闡明遺傳病的分子機(jī)制，這對(duì)遺傳病的基因治療將起到不可估量的子機(jī)制，這對(duì)遺傳病的基因治療將起到不可估量的推動(dòng)作用。推動(dòng)作用。 產(chǎn)品名稱產(chǎn)品名稱 治療功能與醫(yī)藥范圍治療功能與醫(yī)藥范圍 1. 1. 人胰島素人胰島素 治療糖尿病治療

39、糖尿病 2. 2. 人生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素 治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合 3. 3. 干擾素干擾素 治療癌癥、病毒感染治療癌癥、病毒感染 4. 4. 干擾素干擾素 治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎 5. 5. 干擾素干擾素 治療癌癥、病毒感染治療癌癥、病毒感染 6. 6. 人組織纖溶酶原激活因子人組織纖溶酶原激活因子(tPA) (tPA) 溶解血栓，治療急性心肌梗塞溶解血栓，治療急性心肌梗塞 7. 7. 紅細(xì)胞生成素紅細(xì)胞生成素 (Epo) (Epo) 治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平 8. 8. 超氧化物歧化酶

40、超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死 9. 9. 凝血因子凝血因子 治療治療A A型血友病型血友病 10. 10. 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗 防治肝炎防治肝炎 11. 11. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子神經(jīng)生長(zhǎng)因子 維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化 12. 12. 腦啡膚腦啡膚 鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)痛 13. 13. 降鈣素降鈣素 治療骨質(zhì)疏松癥治療骨質(zhì)疏松癥二、二、 生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì) 基因工程生產(chǎn)胰島素的原理（示意圖）基因工程生產(chǎn)胰島素的原理（示意圖） 三、制備基因工程疫苗三、制備基因工程疫苗 基因工

41、程疫苗可以幫助解決傳統(tǒng)技術(shù)難以解決的基因工程疫苗可以幫助解決傳統(tǒng)技術(shù)難以解決的 一些特殊的病原體疫苗。一些特殊的病原體疫苗。如如，（1 1） 乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫 苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2） 有誘發(fā)致癌或產(chǎn)生免疫病理作用的疫苗，如人有誘發(fā)致癌或產(chǎn)生免疫病理作用的疫苗，如人 T T細(xì)胞免疫缺陷病毒（細(xì)胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3） 常規(guī)效果較差的疫苗，如霍亂和痢疾疫苗等常規(guī)效果較差的疫苗，如霍亂和痢疾疫苗等（4 4） 制備一些多價(jià)疫苗等。制備一些多價(jià)疫苗等。四、改良物種特性四、改良物種

42、特性 動(dòng)物藥廠動(dòng)物藥廠通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)感興趣的基因通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)感興趣的基因把把YFG放在放在乳球蛋白的啟動(dòng)子下乳球蛋白的啟動(dòng)子下注入羊卵細(xì)胞注入羊卵細(xì)胞植入借腹懷孕的母羊植入借腹懷孕的母羊體內(nèi)體內(nèi)YFG在乳腺中表達(dá)在乳腺中表達(dá)乳汁中提純?nèi)橹刑峒僘FG蛋白。蛋白。 1. 1. 分離體細(xì)胞分離體細(xì)胞（先處于（先處于“饑餓饑餓”的的“靜止?fàn)顟B(tài)靜止?fàn)顟B(tài)”） 使使“關(guān)閉關(guān)閉”的的基 因 全 部基 因 全 部 “ 打打開開”。2. 2. 植入去核的卵植入去核的卵細(xì)胞中細(xì)胞中胚胎細(xì)胚胎細(xì)胞胞3. 3. 將胚胎細(xì)胞將胚胎細(xì)胞植入寄養(yǎng)母體內(nèi)。植入寄養(yǎng)母體內(nèi)。 五、動(dòng)物克隆五、動(dòng)物克隆 六、其他應(yīng)用六、

43、其他應(yīng)用（略）（略） 基因重組和基因工程（課堂練習(xí)）基因重組和基因工程（課堂練習(xí)）1.1. 基因工程中常用的限制性內(nèi)切酶是基因工程中常用的限制性內(nèi)切酶是 A. A. 型限制酶型限制酶 B. B. 型限制酶型限制酶C.C. 型限制酶型限制酶 D. D. 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶E.E. 核酸外切酶核酸外切酶2.2. 催化催化DNADNA缺口平移反應(yīng)的酶是缺口平移反應(yīng)的酶是A.A. 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 B. DNAB. DNA聚合酶聚合酶C.C. DNA DNA聚合酶聚合酶 D. DNA D. DNA聚合酶聚合酶E.E. Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 3. Klenow片斷具有下列酶活

44、性片斷具有下列酶活性A. 5A. 5 33 外切酶和外切酶和 5 5 33 聚合酶活性聚合酶活性B.B. 5 5 33 和和3 3 55 外切酶活性外切酶活性C. 5C. 5 33 聚合酶聚合酶 和和3 3 55 外切酶活性外切酶活性D.D. 5 5 33 和和3 3 55 聚合酶活性聚合酶活性E. 5E. 5 33 外切酶和外切酶和3 3 55 聚合酶活性聚合酶活性4.4. 堿性磷酸酶的作用是堿性磷酸酶的作用是A. A. 使核酸片段使核酸片段3 3 端加上磷酸基端加上磷酸基B. B. 去除核酸片段的去除核酸片段的3 3 端磷酸基端磷酸基C.C. 去除核酸片段的去除核酸片段的5 5 端磷酸基端

45、磷酸基D. D. 使核酸片段的使核酸片段的5 5 端加上磷酸基端加上磷酸基E. E. 使核酸鏈水解斷裂使核酸鏈水解斷裂5. 下列是關(guān)于基因克隆常用載體的敘述，正確的是A.A. 在連接酶作用下，載體可與目的在連接酶作用下，載體可與目的DNADNA連接構(gòu)成重組體連接構(gòu)成重組體B.B. 載體是將目的載體是將目的DNADNA引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載蛋白引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載蛋白C.C. 載體是將目的載體是將目的DNADNA引入宿主細(xì)胞的引入宿主細(xì)胞的DNADNA分子分子D.D. 常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等 E.E. 載體可將目的載體可將目的DNADNA運(yùn)載入宿主細(xì)胞內(nèi)而本身

46、不進(jìn)入細(xì)胞運(yùn)載入宿主細(xì)胞內(nèi)而本身不進(jìn)入細(xì)胞6.6. DNADNA重組應(yīng)包括下列過程重組應(yīng)包括下列過程 A.A. 分離并獲得目的基因和載體分離并獲得目的基因和載體B. B. 連接目的基因和載體構(gòu)成重組體連接目的基因和載體構(gòu)成重組體C.C. 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)D.D. 從轉(zhuǎn)化菌落中篩選并鑒定含陽性重組體的菌落從轉(zhuǎn)化菌落中篩選并鑒定含陽性重組體的菌落E. E. 以上都包括以上都包括7.7. 目的目的DNADNA可來自可來自A.A. 直接從組織中提取直接從組織中提取 B. B. 基因文庫基因文庫 C.C. cDNAcDNA文庫文庫 D. PCRD. PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 E. DNAE. DNA合成儀合成合成儀合成8.8. 目的目的DNADNA與載體的連接方法可有與載體的連接方法可有A.A. 粘性末端連接粘性末端連接 B. B. 平頭末端連接平頭末端連接C.C. 同源多聚尾連接同源多聚尾連接 D. D. 人工接頭法人工接頭法E. E. 載體分子的自身環(huán)化連接載體分子的自身環(huán)化連接