單子葉植物CRISPR載體的構建資料

《單子葉植物CRISPR載體的構建資料》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《單子葉植物CRISPR載體的構建資料（19頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、目錄 摘 要 1.. 引言 1... 1.材料與方法 4... 1.1實驗材料 4... 菌株 4... 體質粒載 4.. 酶和試劑 4.. 酶 4.. 抗生素 5.. 生化試劑 5.. 1.2儀器設備 5... 1.3實驗方法 5... 酶切 5... 片段補平 6.. 大片段去磷酸化 乙醇沉淀純化 DNA 7.. 膠回收 7.. 連接 高保真酶 PCR 反應 檢測PCR反應 8. 技術 反應 7. 1 . 3 . 1 0大腸桿菌轉化 質粒提取 9.. 2. 結果與分析 1..2. 2.1pWBV

2、ec8+Ga-b載體的酶切 1.2 2.2載體去磷酸化 1..2 2.3載體補平 1..2. 2.4Cas9質粒的酶切 13 2.5含有Cas9元件片段的補平 13 2.6Cas9元件片段與載體的連接 1.3 2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR質粒檢測 1 3 2.8入門載體的構建 1..4 3. 討論 1..5. 參考文獻 1..7. 致謝 1..8.. 集胞藻 6803 基因的克隆及植物轉化載體的構建 摘 要： 關鍵詞 ：Gateway 技術 Key words: Gateway technology 引言 藍藻是地球上最原始、最古老

3、的一群植物，分布很廣，主要生活在 淡水中，海水中也有。藍藻它是在地球上幾乎還是絕對無氧的還原環(huán)境 下，第一個利用太陽能將二氧化碳制造成有機物并釋放出游離氧氣的先 驅生物，它對地球上的其他自養(yǎng)生物和異養(yǎng)生物的產(chǎn)生和演化，乃至人 類的起源有著無可替代的重大意義。藍藻藻體有單細胞體、群體和少數(shù) 絲狀體，為原核生物，細胞壁在電鏡下分為四層，原生質體由中心質和 周質組成，中心質含有 DNA ，無核仁和核膜結構，稱為原核。周質中有 很多扁平膜狀的光合作用片層，呈條狀有規(guī)律的排列，分布在其表面的 色素有葉綠素a、藻藍蛋白、藻紅蛋白及一些黃色色素。藍藻的光合作用 產(chǎn)物為藍藻淀粉和藍藻顆粒體。周質中還有氣泡。

4、藍藻約有 150 屬， 1500 種，分布很廣，從兩極到赤道，從高山到海洋，到處都有它們的蹤 跡。根據(jù)其植物體的形態(tài)不同而分為三個綱： 1、色球藻綱：包括所有 單細胞體和單細胞群體種類。 2、藻殖段綱：包括所有不分枝或假分枝絲 狀體種類及絲狀群體種類。 3、真枝藻綱：包括所有具真分枝的絲狀體種類。 基因組編輯就是指定點改造基因組，得到預期的生物體基因組序列 從而發(fā)生遺傳改變的技術，主要是進行 DNA 序列的敲除、插入、定點突 變和組合編輯等，從而實現(xiàn)基因功能與調(diào)控元件的系統(tǒng)研究 ［1］。從基因組 的角度出發(fā)對植物基因進行人工改造從而培育優(yōu)良品種具有非常重要的 意義。由于外源 DNA 與

5、基因組靶基因發(fā)生同源重組效率很低，因此對 植物基因組進行人工改造就顯得異常困難。近年來，人們借用人工改造 核酸酶來提高同源重組的效率，從而實現(xiàn)了對基因組的精確、定向的人 工改造。目前應用于基因組編輯主要包括巨核酶技術 (Meganucleases、) 鋅 指核酸酶 (ZFN) 、以及 TALEN 核酸酶，它們已在植物基因工程中已經(jīng)得 到了成功的應用。然而傳統(tǒng)基因組編輯技術存在明顯不足，例如， ZFN 和 TALEN 對于每一個新的 ZFN 或 TALEN 嵌合蛋白質都需要被改造才能 識別靶序列，這就使兩種基因組編輯系統(tǒng)廣泛應用受阻。然而最近發(fā)現(xiàn) 的 CRISPR 系統(tǒng)介導的基因組編輯技術只需

6、要一小段引導 RNA 就能夠識 別特定的 DNA ［2］。而且一個新的位點只需要一個新的引導 RNA ，極大的 簡化了基因組編輯的過程，擴大了靶位點的選擇。 CRISPR 系統(tǒng)也可以應 用于靶向基因突變和基因修正，并且該系統(tǒng)也容易設計，可以實現(xiàn)大片 段 DNA 缺失以及用于復合基因編輯。 CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR-associated protei ns系統(tǒng)是細菌與古生菌中用來抵御外源病毒或質 粒DNA入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。對于一個典型的 CRISPR位點而言通

7、常包含若干長度為20-50bp的保守性的正向重復序列和被其間隔開的短的 非重復序列，以及位于重復上游的引導序列［3］。CRISPR系統(tǒng)存在三種類 型，尤其以2型CRISPR系統(tǒng)研究較多，在2型CRISPR系統(tǒng)中存在 Cas9核酸酶，又稱 CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Cas9核酸酶具有改造crRNA和 破壞雙鏈DNA的雙重功能⑺。位于sgRNA5端的20個左右的堿基決定 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應用時Cas9核酸酶特異性切割的部位，主要負責決 定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，因此，只要改變這段引導 RNA序列即可 使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同時引用多個引導 RNA也可同時

8、 進行基因組上多個不同位點的編輯，從而實現(xiàn)復合基因的編輯。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的植物基因的定點突變原理為：首先， Cas9蛋 白與sgRNA形成復合體。其次，上述復合體切割與 sgRNA的spacer互 補的基因組 DNA 序列，隨后造成雙鏈 DNA 的損傷。最后通過體內(nèi)的 NHEJ或HR修復機制將引入基因突變 ⑷。 受序列的限制以往的CRISPR載體往往是兩個載體，也即表達 sgRNA和Cas9元件位于不同的載體，共轉化效率較低，為了克服這一困 難，我們采用酶切連接和 Gateway技術構建便式表達載體。我們已經(jīng)了 解sgRNA 5端的20個左右的堿基決定CRISPR/Cas

9、9系統(tǒng)的特異性，但是 20個左右的堿基片段鏈接不方便，使用起來操作不方便效率偏低。本研 究利用Gateway技術和改進后的定點突變技術將基因特異的靶序列構建 到通用載體中得到表達特異基因 sgRNA 的入門載體，將其與目標載體同 源重組即可得到特異的基因表達載體。 1. 材料與方法 1.1 實驗材料 菌株 大腸桿菌 DB3.1 和 Trans1-T1 感受態(tài)細胞均有周口師范學院植物遺傳 與分子育種重點實驗室提供。 質粒載體 入門載體： pDONR207 周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室提 供 表達載體：周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室提供 酶和試劑 酶 KO

10、D plus DNA 聚合酶(Toyobo) T4 DNA 連接酶(New England Biolabs) 熱敏磷酸化酶 (New England Biolabs) 抗生素 Gentamycin(Sigma) Spectinomycin(Sigma) 實驗試劑 瓊 脂 、 TAE 緩 沖 液 、 Goldwiew 試 劑 、 6x 上 樣 緩 沖 液 (loadingbuffer )、DNA分子大小標準參照物、無水乙醇、 75%乙醇、 異丙醇、 75%甘油、蒸餾水、 LB 培養(yǎng)基各組成成分、高純度質粒小量快 速提取試劑盒購自艾德萊生物科技公司。 1.2 儀器設備 普通 PC

11、R 儀、超凈工作臺、精密電子天平、 100mL 的容量瓶、培養(yǎng) 皿、移液槍、-20 C冰箱、-70C冰箱、37C搖床、37 T培養(yǎng)箱、恒溫水浴 鍋、電泳儀、制膠板、一次性手套、微波爐、水平電泳槽、凝膠成像分 析系統(tǒng)、離心機等。 1.3 實驗方法 集胞藻基因組的提取 本次實驗進行 KODPCR 擴增所需的模板 (目的基因 )為集胞藻的整個 基因組，提取的方法為周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室人 員自己探索的方法，先將集胞藻離心收集于離心管中，加入提取液、溶 菌酶、 0.2mm 的玻璃珠后，輕輕震蕩破碎集胞藻細胞，然后純化 DNA， 即得到集胞藻的整個基因組。 集胞藻 6803C

12、CM 途徑基因的 KODPCR 擴增 KODPCR反應體系：總體系為50卩1 均為周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室購買，呈干粉狀 態(tài)，先經(jīng)過高速離心，再稀釋100倍。 KODPCR的溫度設置： 先經(jīng)過95C預變性8分鐘，然后是95C變性30s, 58C退火30s, 72C延伸1min，進行35個循環(huán)后，再經(jīng)過 72C終變性5min, 16C保 存，即完成整個循環(huán)。 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖 0.2g TAE緩沖液 20mL Gold wiew 0.6 卩1 ⑴準備。本實驗需制備1%的瓊脂糖膠液，稱取 0.2g瓊脂糖溶于 20mL的電泳緩沖液TAE

13、中。 (2) 熔解。微波爐加熱使瓊脂糖充分熔解。 (3) 加入Goldwiew。由于溴化乙錠毒性較大，故本實驗加入核酸染 色劑Goldwiew，需戴上一次性手套。 (4) 灌膠。 本實驗選擇的是小型制膠板，緩慢地將瓊脂糖膠液注入 1 個帶有“梳子”的膠床中，至膠完全凝固，約 20 分鐘左右。 (5) 放膠。 代膠凝固之后，輕輕拔出梳子，將制膠板放在電泳槽內(nèi)， 加樣孔一側靠近陰極 (黑色電極 )，注入適量的電泳緩沖液。 (6) 點樣。 取適量KODPCR擴增產(chǎn)物及DNA分子大小標準參照物， 加入 6x 上樣緩沖液，混勻，采用移液器進行點樣：使吸管與加樣孔垂 直，吸管尖端剛好在加樣孔

14、開口之下，緩慢將 DNA羊品加入加樣孔中。 (7) 電泳。 加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源，黑色連陰極，紅色 連陽極，電壓為130V，電流為135mA。 (8) 拍照、保存。 跑膠 30min 后，切斷電源，取出凝膠，用凝膠成像 分析系統(tǒng)拍照保存。 產(chǎn)物純化：硅膠膜吸附法 緩沖液 EB 需事先預熱 吸附柱先加入平衡液進行平衡 (1) 300卩溶膠液、100卩異丙醇與PCR產(chǎn)物混合 (2) 混合液轉移至吸附柱，室溫放置 1min， 3000 rpm 1min ， 12000 rpm 1min (3) 將吸附柱內(nèi)下層液體倒掉，加入 600 ^WB (洗脫液)，12000 rpm

15、 1min (4) 重復 3。 (5) 將洗脫液倒掉以后， 12000 rpm 2min (6) 把吸附柱放入新的1.5EP管，加入50卩緩沖液EB, 37C烘箱放置 5min， 12000 rpm 1min 技術 反應 以構建入門載體目的，5.2卩反應體系，配比如下，25C,水浴1-3h。 轉化普通大腸桿菌Trans-5阿爾法感受態(tài)細胞。 PCR純化產(chǎn)物 4卩1 PDONR207 0.7 卩1 BP重組酶 0.5卩1 1.3.6 Trans-5阿爾法感受態(tài)大腸桿菌轉化 (1) -80C冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細胞，將溶未溶時轉化效率最后。 ⑵加入BP反應產(chǎn)物，10卩混勻

16、，冰浴30min。 (3) 將感受態(tài)細胞在42 C水浴鍋中熱激90s,此過程要迅速。 (4) 取出后迅速轉移到冰山，冷卻 2min。 (5) 無菌條件下，感受態(tài)中加入 50 ylLB培養(yǎng)液(不含抗生素)混勻后于37C 恒溫箱 150 rPm 搖床 45min。 (6) 在無菌條件下，均勻涂到含有 Gen 抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基上，待平 板上的菌液完全吸收后，倒置平板 37 E培養(yǎng)過夜。 (7) 挑單克隆。挑取大腸桿菌 8處單菌落于8個50mL離心管中，加入LB 培養(yǎng)液。 (8) 37r恒溫箱150 rpm搖床3h。 1.3.7 菌液 PCR 反應 驗證入門載體是否轉到大腸桿

17、菌內(nèi)，PCR反應體系(15卩)1。 2>Mix 7.5 卩1 Primer1 0.5 卩1 Primer2 0.5 卩1 菌液 1 I ddH2O 5.5 il PCR反應的條件： 95T預變性 8min, 95C變性 30s, 58T退火30s, 72E延伸1min,擴增 35個循環(huán)，72E終變性5min, 16°C保存。 瓊脂糖凝膠電泳 過程同 保菌 75%的甘油與菌液 1:1 混勻后，放入 -80 液氮中。 質粒提取 質粒 DNA 提取使用的是購自艾德萊生物科技公司的高純度質粒小量 快速提取試劑盒，操作步驟如下： (1) 搖菌：從 LB 固體培養(yǎng)基平板上挑

18、取大腸桿菌的單菌落，接種至 5ml 含有相應抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，將其放置在搖床上， 230rpm 震 蕩培養(yǎng)約 8h。 (2) 集菌：取過夜培養(yǎng)的菌液，裝入 2ml 離心管中， 12000rpm 于室溫 1min 沉淀菌體，棄上清，反復進行 2-3 次。 (3) 重懸：加入250卩l(xiāng) Buffer P,充分混懸震蕩，使菌體徹底懸浮。 ⑷裂解：加入250卩IBuffer P2，上下溫和翻轉6-8次，使細菌完全裂 解，室溫放置時間不能超過 5min。 (5)中和：加入350卩IBuffer P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，出現(xiàn)均 勻白色絮狀沉淀，冰上放置 5min,13000r

19、pm 離心 10min。 ⑹柱平衡：向插入套管的吸附柱柱內(nèi)加入 100卩I Buffer PE, 13000rpm 離心 30s, 棄去套管中的廢液。 (7) 將中和后離心的質粒粗提物上清小心吸出并轉移至平衡過的吸附 柱內(nèi)，13000rpm離心1min，棄上清。 (8) 清洗：向離心柱內(nèi)加入 600卩漂洗液 WB(已加乙醇)，13000rpm離 心1min，棄上清。 (9) 再清洗：再次向吸附柱內(nèi)加入 600 ^漂洗液 WB，13000rpm離心 1min，棄上清。將吸附柱放回套管，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗 液。 (10) 收吸附柱：取出吸附柱，放入一個干凈的 1

20、.5ml 離心管內(nèi)。 (11) 洗脫DNA:在吸附膜的中間部位加入 70卩IEB(已70C加熱),70C 烘箱放置 5-10min, 13000rpm,離心 1min。 (12) 再次洗脫DNA :在吸附膜的中間部位加入 70卩I EB(已70C加 熱),13000rpm,離心1min，將最終獲得的質粒 DNA溶液置于-20C備 用。 瓊脂糖凝膠電泳 過程同 和 1.3.12 LR 反應 ，以構建表達載體目的，4.7卩1反應體系，配比如下，25C ,水浴1- 3h。轉化普通大腸桿菌Trans-5阿爾法感受態(tài)細胞 入門載體 3卩1 LR重組酶 0.5^1 載體 仁卩1 1.

21、3.13 Trans-5阿爾法感受態(tài) 大腸桿菌轉化 過程同 1.3.14 菌液PCR反應 過程同 1.3.15 瓊脂糖凝膠電泳 過程同 、 、 保菌 過程同 7 質粒提取 過程同 農(nóng)桿菌轉化 (1) 從-80C冰箱取出農(nóng)桿菌感受態(tài)，在冰上融化后加入 10卩質粒。 (2) 混勻后冰浴 30min。 (3) 液氮中速凍 90s (4) 水浴鍋37C保溫2min后，在超凈工作臺上加入 500^LB培養(yǎng)液, 28°C、180rpm搖菌培養(yǎng) 2-4 h。 (5) 在超凈工作臺上，取適量的菌液涂在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上， 28C倒置黑暗培養(yǎng)，2-3天后可以看到轉

22、化出的農(nóng)桿菌單菌落。 瞬時轉化擬南芥 (1) 挑農(nóng)桿菌單菌落于 LB 培 養(yǎng)基 中，28 C搖菌。 (2) OD600=1—1.5 (3) 離心 3000rpm 15min (4) 棄上清，用重懸液懸起 OD600=0.6—0.8 (5) 避光 1 —3 h ⑹侵染前加入0.03%silwet— 77,混勻。 (7) 將擬南芥花浸泡入菌液中 8s。 (8) 拿出甩干，保鮮膜包好，避光或弱光培養(yǎng) 12 h。 (9) 正常培養(yǎng)， 1 0天之后再次侵染。 (10) 收種子，在含有抗性培 養(yǎng)基 上進行篩選。 2. 結果與分析 2.1pWBVec8+Ga-b載體的酶切 根據(jù)

23、pWBVec8+Ga-b載體圖譜可知，pWBVec8+Ga-b載體含有Xba1 專一酶切位點，酶切獲取 13.2 kb DNA片段，進行電泳檢測并回收（圖 1）。 pWBVec8+Ga-b 13.224 kb M Xbal 圖1 載體pWBVec8+Ga-b的酶切回收。 A，載體pWBVec8+Ga-b示意圖；B，載體pWBVec8+Ga-b的酶切回收后電泳檢測。 2.2載體去磷酸化 Xba1對pWBVec8+Ga-b載體酶切后會產(chǎn)生5,突出粘性末端，為了防 止載體自連現(xiàn)象的發(fā)生，利用熱敏磷酸化酶進行去磷酸化處理。去磷酸 化后利用乙醇沉淀法進行純化。 2.3載體補平

24、Xba1酶切后產(chǎn)生5,突出粘性末端，對DNA片段的連接需要堿基完 全互補配對，對于同源性低的兩片段連接率就低甚至不發(fā)生連接，為了 方便連接需要對目的DNA片段在Klenow酶的作用下以dNTP為原料根 據(jù)堿基互補配對原則進行補平，最終形成平末端。 2.4Cas9質粒的酶切 Cas9質粒中有一下元件依次為， 35S啟動子、NLS核定位信號序 列、flag標簽序列、基因編碼序列和終止序列，并且在 35S啟動子和最后 的終止子兩側分別存在 EcoRI和Hind3雙酶切位點。利用 EcoRI和 Hind3雙酶切后5.5kb DNA片段即是含有上述元件的片段，我們采用 EcoRI和Hind3

25、雙酶切回收該片段（圖2）。 圖2 Cas9質粒的酶切電泳檢測圖 2.5含有Cas9元件片段的補平 為了方便載體的連接，在 Klenow酶的作用下以dNTP為原料根據(jù)堿 基互補配對原則對上一步回收的酶切產(chǎn)物進行補平，最終形成平末端。 2.6Cas9元件片段與載體的連接 插入片段Cas9與目的載體pWBVec8+Ga-b進行連接，將連接后的載 體轉化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)細胞，均勻涂布到含有壯觀霉素的 LB固體 培養(yǎng)基平板上，挑取單克隆搖菌并提取質粒即為目標載體，并標記為 pWBVec8+Ga-b-CRISPR。 2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR 質粒檢測 經(jīng)分析

26、目標載體 pWBVec8+Ga-b-CRISPR含有兩處Xba1的酶切位 點，如果進行Xba1酶切又可以得到5.5K的片段和13.2K的片段。經(jīng)過 檢測我們得到正確的重新的到插入片段 Cas9和目的載體pWBVec8+Ga- 后根據(jù)目標載體pWBVec8+Ga-b-CRISPR的結構特點進行Xba1單酶 切，電泳檢測以驗證所構建的載體是否正確（圖3）。 Xbav M Xbal 圖 3 pWBVec8+Ga-b-CRISPR 質粒檢測。 A，載體 pWBVec8+Ga-b-CRISPR 示意圖；B，載體 pWBVec8+Ga-b-CRISPR 的酶切后電泳檢 測。 2

27、.8入門載體的構建 首先對0SU6啟動子利用PCR技術進行擴增并電泳檢測（圖4A），選 擇pDONR207作為供體利用Gateway技術進行構建。將得到的入門載體 轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，均勻涂布到含有慶大霉素的 LB固 體培養(yǎng)基平板上，挑取單克隆搖菌，利用載體上重組位點兩側的序列設 計引物（pDONR-F/ pDONR-R）進行菌液PCR檢測，正確的克隆應該能得 到約700bp的條帶，檢測正確的克隆提取質粒備用（圖4B）。 75 2 1 圖4入門載體的構建。 A, 0SU6啟動子PCR擴增電泳檢測圖；B,入門載體電泳檢測圖; 3. 討論 本實驗對 CRIS

28、PR/Cas9 系統(tǒng)進行了定向改造一方面提高了轉化效 率，另一方面為以后對基因組進行人工改造提供簡單便捷的途徑。在實 驗過程中我們不僅采用傳統(tǒng)的酶切、連接構建載體，也提出利用 Gateway 技術進行構建載體。 Gateway 技術是基于噬菌體的位點特異重組反應，在 目的片段添加重組位點，將 PCR 產(chǎn)物與含重組位點的供體載體混合進行 BP反應獲得入門載體(entry cione),入門載體可以和不同用途的目標載體 進行LR反應獲得相應的表達載體，無需相應的核酸內(nèi)切酶和 DNA連接 酶。如果已經(jīng)成功的構建一個入門載體,就可以反復的使用它,將特異 的目標基因重組到定向改造過的表達載體上。當目的

29、基因在表達載體間 簡捷快速穿行時，保證了重組 DNA 片段正確的閱讀框和方向，因而不影 響不同的表達克隆的測序結果。這在使用每一種新的表達系統(tǒng)時，更多 節(jié)省了時間。實驗驗中對比得知，傳統(tǒng)的酶切 - 連接技術要求嚴格，容易 出錯，酶切位點不易找到，成功率不高，而 Gateway 技術這種方法不僅 簡單而且成本較低，成功率高，適合實驗室普遍推廣應用。 本實驗將表達 sgRNA 和 Cas9 元件整合到同一載體中，以提高轉化 效率。同時也利用改造后的定點突變技術對含有 OsU6 啟動子和 sgRNA 的入門載體進行改造，引入位點特異的 20bp 的序列，方便 sgRNA 元件 序列的替換。定點突變

30、技術采用聚合酶鏈式反應 (PCR)等方法向基因組或 是質粒中引入具有表征方向的變化，包括堿基的添加、刪除、點突變 等，定點突變能迅速、高效的提高 DNA 所表達的目的蛋白的性狀及表 征，是基因研究工作中一種非常有用的手段，其中，體外定點突變技術 是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是實驗室中改 造/ 優(yōu)化基因常用的手段 [5]。 對于本實驗研究的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)而言，再某些程度上優(yōu)于其他 基因組編輯技術，但是也存在自身的不足，例如，在不同的生物中也表 現(xiàn)出不同程度的脫靶效應是目前研究領域需要解決的一大難題。據(jù)相關 實驗研究表明： Spacer 序列的堿基組成、長

31、度、錯配位點的位置、數(shù)目 和分布特點以及 Cas9 核酸酶和 sgRNA 的濃度等數(shù)個因素均有可能影響 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性 [6-9] 。現(xiàn)階段主要通過盡可能的選擇特異性較 高的 Spacer 序列的位置、對 Cas9 基因進行密碼子優(yōu)化以及選擇合適的 sgRNA（包括計算機建模和控制sgRNA的表達量）來降低脫靶效應。 最近， CRISPR-Cas9 介導的基因組編輯技術發(fā)展極為迅速，已經(jīng)在 動物建模、作物育種、基因治療、藥物開發(fā)和工業(yè)生物工程等不同的領 域中得到了廣泛的應用 [10]。目前， CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功的在擬南 芥[11] 、煙草[12]、水稻

32、[13] 、小麥[14] 、玉米[15] 、等生物中實現(xiàn)了定點基因組 編輯。針對世界上的耕地面積和可利用資源的存在狀況，培養(yǎng)高產(chǎn)優(yōu)質 的農(nóng)作物就顯得至關重要。因此，采用最新的生物技術來進行修飾植物 內(nèi)源基因以此來提高作物的產(chǎn)量并改良作物的品質創(chuàng)造新的途徑 [16]。 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中也存在很多有待解決的問題： 1、怎樣才能攻破 PAM 序列的限制 2、如何設立對 Cas9 脫靶效應的全面評價體系 3、如 何構造在不同的物種中通用的 Cas9 與 sgRNA 導入與表達系統(tǒng) 4、如何 更高效的激活同源重組修復等 [10]。然而基于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的快速發(fā) 展以及隨

33、著相關基礎科學研究的深入， CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將在基因組水 平的基因的改造、表觀遺傳的調(diào)控以及在轉錄調(diào)控等不同的層次上得到 更為寬廣的發(fā)展與應用。 本實驗就為不同物種構建不同轉基因表達載體從而發(fā)生定點突變提 供高效，經(jīng)濟，簡單的提供可能。 參考文獻 [1] 謝科， 饒力群． 基因組編輯技術在植物中的研究進展與應用前景 [J]. 中國生 物工程雜志 , 2013 ，33(6):99-104. [2] Gaj,T.Gersbach,C.A.,andBarbas,C.F.,III(2013).ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for ge

34、nome engineering.Trends Biotechnol.31,397 - 405. [3] Mojica F J, Diez-Villasenor C, Soria E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Mol Mi-crobiol, 2000, 36(1):244- 246. [4] Wieden heft B, Sternberg SH, Doudn

35、a JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature,2012,482(7385):331-8. [5] 張浩. 定點突變技術的研究進展 [J] ． 免疫學雜志， 2000，16(4):109-110. [6] Mali P,Aach J,Stranges PB,et al.CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome en

36、gineering. Nat Biotechnol,2013,31(9):833-8 [7] Fu Y, Foden J A, Khayter C, et al. High-frequency off- target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nat Biotechnol,2013,31(9):822-6 [8] Hsu PD,Scott D A,Weinstein JA, et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.N

37、at Biotechnol, 2013,31(9):827-32 [9] Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol,2013,31(9):839-43 [10] 鄭小梅 , 張曉立 . CRISPR-Cas9 介導的基因組編輯技術的研究進展 [J]. 生物技 術進展， 2015,5 (1):1-9. [11]

38、Li JF, Norville JE, Aach J, et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol,2013,31(8):688-91. [12] Nekrasov V,Staskawicz B,Weigel D,et al. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana bent

39、hamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol,2013, 31(8): 691-3. [13] Miao J, Guo D, Zhang J, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res, 2013, 23(10):1233-6. [14] Shan Q, Wang Y, Li J, et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013,31(8): 686-8. 生命科學 , [15] Liang Z,Zhang K,Chen K, et al.Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system.J Genet Genomics, 2014,41(2):63-68. [16] 瞿禮嘉 , 郭冬姝 . CRISPR/Cas 系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應用 [J]. 2015,27(1):64-70.