王鏡巖 生物化學(xué) 經(jīng)典課件 18基因工程 考研必備 學(xué)生物化學(xué)必備模版課件

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1、第39章基因工程及蛋白質(zhì)工程一、DNA克隆的基本原理 基因克隆的技術(shù)路線大致包括以下幾個(gè)程序：分離制備待克隆的DNA片段(目的DNA)；在體外連接目的DNA片段和載體；重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；重組子的擴(kuò)增。(一)DNA限制酶與連接酶 類型限制酶為多亞基雙功能酶，S亞基為識(shí)別亞基，識(shí)別位點(diǎn)為兩部分序列，中間有一定長(zhǎng)度的任意堿基對(duì)，M亞基有甲基化酶活性，R亞基為切割亞基，可在識(shí)別位點(diǎn)1kb以上處隨機(jī)切割。類型限制酶有兩個(gè)相同的亞基組成，識(shí)別位點(diǎn)為46bp的回文序列，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，或靠近識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端，可以產(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱

2、作同尾酶。類型限制酶是分子生物學(xué)中最重要的工具酶。類型限制酶為兩個(gè)亞基的雙功能酶，M亞基為識(shí)別亞基，R亞基為切割亞基，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游2426bp處，特異性不強(qiáng)。EcoRI與與DNA的復(fù)合體的復(fù)合體限制性內(nèi)切酶切割DNA形成對(duì)應(yīng)的粘性末端外源DNA可以被插入質(zhì)粒載體接頭用于建立克隆片斷的末端 使用相同的粘性末端進(jìn)行重組，會(huì)有較多的載體自身環(huán)化，或目的基因串聯(lián)，目的基因的定向連接常使用兩種限制酶，產(chǎn)生兩種不同的粘性末端?？梢栽谳d體和目的基因的兩端連接接頭（引入限制酶切點(diǎn)），或銜接物（含有粘性末端），再連接載體和目的基因。T4連接酶催化的反應(yīng) 大腸桿菌的連接酶只能連接粘性末端，T4連接酶可以

3、連接平頭末端，其條件是：提高T4連接酶的濃度；提高DNA片段的濃度；降低ATP濃度；加入多胺類如亞精胺；加入濃縮劑如乙二醇。(二)分子克隆的載體與宿主系統(tǒng) 1.分子克隆的載體的基本條件 （1）能自主復(fù)制；（2）具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，并在位點(diǎn)中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能；（3）具有12個(gè)篩選標(biāo)記；（4）克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入其他生物細(xì)胞；（5）易于操作，轉(zhuǎn)化效率高?，F(xiàn)用的載體都是通過改造構(gòu)建而成的。宿主細(xì)胞的基本條件是：易于接受外源DNA；自身無限制酶和重組能力；易于生長(zhǎng)和篩選；符合安全標(biāo)準(zhǔn)。20世紀(jì)70年代早期主要利用天然

4、質(zhì)粒，1977年Bolivar等構(gòu)建成功pBR322,1982年Viera和 Messsing構(gòu)建成功pUC系列質(zhì)粒，隨后有不少穿梭質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒等問世。2.pBR3222.pBR322 pBR322是由幾個(gè)質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的克隆載體，分子的長(zhǎng)度為4363bp。具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗藥性標(biāo)記。pBR322共有24種限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，其中7種酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,Xma,Nru I)的識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種酶(ClaI,Hind)的識(shí)別位點(diǎn)存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)子內(nèi)部。所以在這9個(gè)限制性位點(diǎn)上插入外源DNA通常都

5、會(huì)導(dǎo)致抗四環(huán)素基因(tetr)的失活。3種酶(scaI,PvuI,PstI)在氨芐青霉素抗性基因(ampr)內(nèi)具單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這3個(gè)位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。若將外源基因插入tetr基因，將構(gòu)成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對(duì)四環(huán)素和氨芐青霉素均敏感的受體菌，則在含氨芐青霉素的平面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的平面培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的菌落均含有外源基因。適合于藍(lán)白選擇2.pUC載體系列 是由大腸桿菌pBR322質(zhì)粒與M13噬菌體改建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體，含有來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)以及大腸桿菌半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼肽鏈的

6、基因，在lacZ基因中有一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段。當(dāng)外源的DNA片段插入到這些克隆位點(diǎn)使互補(bǔ)鏈破壞時(shí)，形成的是無活性的-半乳糖苷酶，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，在Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)-IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)培養(yǎng)基上形成白色菌落，而沒有外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后，在Xgal-IPTG培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。pUC質(zhì)粒載體比pBR322具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量，而且由于rop基因的缺失(其基因產(chǎn)物ROP蛋白，控制質(zhì)粒復(fù)制)，使得其拷貝數(shù)大增，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝，因此由pUC質(zhì)粒重組體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，可獲得高產(chǎn)量的克隆DNA分子。p

7、UC18和pUC19的唯一差別是多克隆位點(diǎn)的方向相反。Xgal可被-半乳糖苷酶水解生成深蘭色的5-溴-4-靛蘭，IPTG可誘導(dǎo)-半乳糖苷酶-鏈的合成。3.噬菌體 噬菌體的基因組是長(zhǎng)度約為50kb的線性雙蓮DNA分子。在其兩端，各有一條由12個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入寄主細(xì)胞后，線性DNA分子通過粘性末端的堿基配對(duì)而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段為cos位點(diǎn)?，F(xiàn)用的噬菌體載體都是在野生型基礎(chǔ)上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：插入型載體，具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)，如gt10、gt11；替換型載體，具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的

8、DNA區(qū)段可被外源插入的DNA片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型載體只能插入較小的外源DNA片段(10kb)，而替換型載體能插入較大的外源DNA片段(20-24kb左右)。當(dāng)重組體DNA分子大于噬菌體基因組105%或小于75%時(shí)，重組噬菌體的活力會(huì)大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重組體DNA分子長(zhǎng)度應(yīng)控制在包裝限度范圍內(nèi)。噬菌體重組體分子不具有抗生素抗性選擇標(biāo)記，主要是依據(jù)噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征和Xgal-IPTG顯色反應(yīng)來篩選重組子。cI基因的存在將使噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)，因此在培養(yǎng)基上形成的是混濁型的噬菌斑。cI基因失活或缺失的噬菌體在培養(yǎng)基上形成清亮

9、型噬菌斑。根據(jù)這個(gè)形態(tài)學(xué)特征可篩選重組體分子。許多載體，如charon2、gt11含有編碼半乳糖苷酶基因lacZ(其中引入多克隆位點(diǎn))。由這種載體感染的大腸桿菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色噬菌斑。當(dāng)外源DNA片段插入到這些克隆位點(diǎn)時(shí)，寄主細(xì)胞就會(huì)在Xgal-IPTG培養(yǎng)基上形成無色噬菌斑，如果在替換型載體的可替換區(qū)段含有l(wèi)acZ基因序列，也會(huì)出現(xiàn)同樣結(jié)果。4.Cosmid質(zhì)粒 黏粒載體本身長(zhǎng)4-6kb，具有質(zhì)粒和噬菌體兩種載體的性質(zhì)，能像質(zhì)粒一樣復(fù)制及轉(zhuǎn)化細(xì)菌，在細(xì)菌中其增殖與質(zhì)粒復(fù)制一樣，產(chǎn)生的重組子是菌落而不是噬菌斑，同時(shí)也具有噬菌體的cos位點(diǎn)，能與

10、噬菌體一樣在體外被包裝成病毒顆粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因組文庫(kù)要比在噬菌體中困難得多，只有在靶基因過大，不能作為單個(gè)DNA區(qū)段在噬菌體載體中克隆增殖，或者要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時(shí)，才使用黏粒載體。用于克隆大片段DNA的 Cosmid質(zhì)粒5.酵母人工染色體載體定向克隆:兩個(gè)粘性末端的序列不同，僅按照一個(gè)方向插入質(zhì)粒。(三)外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞 外源基因?qū)朐思?xì)胞的常用方法有：1.轉(zhuǎn)染，即用冰冷的CaCl2處理后瞬間加熱，將含有外源DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞。2.轉(zhuǎn)化，即用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞。3.電穿孔法，即用脈沖高壓電瞬間擊穿細(xì)胞

11、膜，將含有外源DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。4.噬菌體的體外包裝，將含有外源DNA的噬菌體DNA與外殼蛋白在體外包裝成噬菌體，可以大幅度提高轉(zhuǎn)化率，包裝蛋白有商品出售。外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的常用方法有：1.磷酸鈣共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚陽(yáng)離子促進(jìn)吸收法；3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；4.電穿孔法；5.病毒轉(zhuǎn)染法；6.顯微注射法。外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞的常用方法有：用蝸牛消化酶消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體，再用CaCl2和聚乙二醇處理，促進(jìn)重組DNA的吸收。外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法有：1.用纖維素酶消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體，再用CaCl2和聚乙二醇處理，促進(jìn)重組DNA的吸收，也可使用電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

12、染法。2.將外源DNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA，借助土壤農(nóng)桿菌將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞。3.基因槍微彈射擊法。4.顯微注射法。雙抗生素篩選（四）陽(yáng)性克隆的篩選（四）陽(yáng)性克隆的篩選1.初篩選初篩選目的基因插目的基因插入氨芐青霉入氨芐青霉素抗性基因素抗性基因含氨芐青霉含氨芐青霉素和四環(huán)素素和四環(huán)素含四環(huán)素含四環(huán)素含四環(huán)素含四環(huán)素藍(lán)白選擇也是初步篩選的常用方法2.2.快速裂解菌落鑒定分子大小快速裂解菌落鑒定分子大小 從平板中直接挑取菌落裂解后，不需要內(nèi)切酶消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，與載體DNA比較遷移率，初步判斷是否有插入片段存在，本方法適用于插入片段較大的重組子初步篩選。3.3.內(nèi)切酶圖譜鑒定內(nèi)切酶

13、圖譜鑒定 對(duì)于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶(1種或2種)切割重組子釋放出插入片段，對(duì)于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測(cè)插入片段和載體的大小。4.Southern4.Southern印跡雜交印跡雜交 為了進(jìn)一步確定DNA插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子，凝膠電泳分離后，通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片段作為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。5.PCR5.PCR篩選重組子篩選重組子 一些載體

14、的外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的序列，用相應(yīng)的引物對(duì)小量抽提的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA順序分析。對(duì)于原核或真核系統(tǒng)表達(dá)型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關(guān)鍵的，故有必要對(duì)重組子進(jìn)行序列測(cè)定，DNA序列分析現(xiàn)多采用自動(dòng)測(cè)序儀完成。6.6.菌落菌落(或噬菌斑或噬菌斑)原位雜交原位雜交 菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)是先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜上，或先轉(zhuǎn)移瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，用核素標(biāo)記的特異DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽(yáng)性克隆菌落。本方法能進(jìn)行大規(guī)模操作，一次可篩選5105-5106個(gè)菌落或噬菌斑，對(duì)于從基因文庫(kù)中

15、挑選目的重組子，是一項(xiàng)首選的方法。二、基因的分離、合成和測(cè)序（一）目的基因的來源（一）目的基因的來源1.1.基因組基因組DNADNA的非特異性斷裂的非特異性斷裂 超聲波處理基因組DNA可得到300bp左右的隨機(jī)片段，高速組織搗碎器，控制一定的條件也能得到不同大小的DNA片段，如將高分子量DNA 1500r/m搗碎30分鐘，可得到大約8kb的DNA片段。由機(jī)械處理產(chǎn)生的DNA片段末端不一，斷點(diǎn)隨機(jī)，條件難以掌握，所以目前較少使用這種方法。2.2.染色體染色體DNADNA的限制性內(nèi)切酶酶解的限制性內(nèi)切酶酶解 型限制性內(nèi)切酶可專一識(shí)別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插

16、入片段用同一種內(nèi)切酶消化，可以直接進(jìn)行連接。內(nèi)切酶識(shí)別的DNA順序長(zhǎng)短與降解后DNA產(chǎn)生的片段大小有直接關(guān)系。若識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿性對(duì)，則該順序在DNA鏈上出現(xiàn)的機(jī)率為44，即在堿基隨機(jī)排列的前提下，每256個(gè)堿基對(duì)就有一個(gè)切點(diǎn)。對(duì)于識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶，其順序出現(xiàn)的頻率為46(4096)，可獲得較大的DNA片段，也可用于DNA文庫(kù)的建立。3.3.通過通過mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA 真核生物基因組DNA中重復(fù)順序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比較困難。用mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到相應(yīng)的雙鏈cDNA，再進(jìn)行克隆，獲得較完整的連續(xù)編碼順序，容易在宿主細(xì)胞中表達(dá)。除建立

17、cDNA文庫(kù)以外，對(duì)于一些高豐度表達(dá)、容易純化的蛋白質(zhì)，可以直接通過該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再分離該蛋白質(zhì)的特異mRNA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因克隆，從而直接獲得該特定基因的克隆，這是用染色體DNA難以達(dá)到的克隆效果。4.4.人工體外合成人工體外合成DNADNA片段片段 隨著體外合成DNA的技術(shù)日漸完善，合成DNA的長(zhǎng)度不斷加長(zhǎng)。一些小分子生物活性多肽，可以通過人工合成編碼順序插入載體后，轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。分子較大的基因，可以通過分段合成，然后連接組裝成完整的基因。目前已經(jīng)合成了人胰島素A、B鏈基因和干擾素基因，并成功表達(dá)，制備成商業(yè)產(chǎn)品。5.5.聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反

18、應(yīng)(PCR)(PCR)擴(kuò)增特定基因片段擴(kuò)增特定基因片段 對(duì)于有部分了解或完全清楚的基因，可以通過PCR反應(yīng)，直接從染色體DNA或cDNA上高效快速地?cái)U(kuò)增出目的基因片段，然后進(jìn)行克隆操作。唯一的要求是，對(duì)基因片段兩側(cè)的序列了解清楚。(二)基因組文庫(kù)的構(gòu)建 克隆數(shù)目的估算公式為:N=ln(1-p)/ln(1-f)P:任意基因存在于文庫(kù)中的概率f:克隆DNA(bp)占基因組(bp)的分?jǐn)?shù) 如基因組(bp):3109 克隆DNA(bp):2 104 基因在文庫(kù)中的概率為99%,則:N=ln(1-0.99)/ln1-（2 104/3109）=6.9 105(三)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 真核mRNA的分離逆轉(zhuǎn)

19、錄合成cDNA(三)克隆基因的分離與鑒定 用克隆雜交對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選用已知氨基酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針篩選文庫(kù)克隆基因 差別雜交：若A組細(xì)胞用生長(zhǎng)因子處理，B組細(xì)胞不作處理，將其中的一組mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫(kù)，與另一組的mRNA雜交，或?qū)山M的mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行分子雜交，不能形成雜交雙鏈的是二者差異表達(dá)的基因。扣除雜交：比差別雜交省時(shí)、省力、靈敏度高，基本原理如圖所示。用Southern雜交法鑒定克隆基因(四)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因（五）篩選目的基因的其他方法 1.蛋白質(zhì)組學(xué)：通過雙向電泳，聚焦層析-電泳等方法對(duì)比相關(guān)樣本，確定目標(biāo)蛋白，經(jīng)測(cè)序用遺傳密碼推測(cè)基因的部分序

20、列，用PCR等方法獲取目的基因；2.基因芯片：分析相關(guān)樣本的mRNA，確定目標(biāo)基因；3.mRNA差異顯示：提取欲對(duì)比的兩個(gè)樣本的mRNA，分別用5T11-MN或5-T12MN(M代表除T以外的任意核苷酸，N代表任意核苷酸)共12種不同的下游引物合成cDNA的第一鏈，所得24種cDNA的第一鏈均用通用引物合成第二鏈，并引入放射性同位素標(biāo)記，將相對(duì)應(yīng)的12對(duì)cDNA分別用測(cè)序膠電泳分離，放射自顯影，對(duì)比二者的條帶，找出差異，回收特異性差別條帶，擴(kuò)增，測(cè)序，或合成探針篩選基因。4.表達(dá)序列庫(kù)：將基因克隆到表達(dá)載體，表達(dá)后用免疫學(xué)方法、產(chǎn)物功能測(cè)定、產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)研究等方法鑒定特定的基因。5.基因定位誘變

21、 6.篩選的目的基因通常要進(jìn)行序列測(cè)定三、克隆基因的表達(dá)(一)基因表達(dá)的控制元件 在典型的表達(dá)載體中，真核編碼序列被插入啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，插入位點(diǎn)的下游應(yīng)當(dāng)有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA應(yīng)包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)。（二）RNA的表達(dá) 表達(dá)載體攜帶能夠被噬菌體SP6的RNA聚合酶辨認(rèn)的啟動(dòng)子。SP6 RNA聚合酶可以在體外高效率地轉(zhuǎn)錄,將任何目的DNA插入SP6啟動(dòng)子下游的多接頭克隆位點(diǎn)，可以連續(xù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，轉(zhuǎn)錄起始前，環(huán)狀的表達(dá)載體會(huì)在插入位點(diǎn)或其附近被單一位點(diǎn)裂解而線性化，因此，轉(zhuǎn)錄會(huì)在固定的位點(diǎn)終止。融合lac和trp的啟動(dòng)子，可被IPTG誘導(dǎo)，是最常用的原核啟動(dòng)子。1.表達(dá)非

22、融合蛋白 用原核生物對(duì)真核基因進(jìn)行非融合表達(dá)，容易得到較大的表達(dá)量，但表達(dá)產(chǎn)物不易形成正確的折疊，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含體，裂解包含體時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)變性，需要復(fù)性，才能得到有活性的蛋白質(zhì)。（三）蛋白質(zhì)的表達(dá)2.表達(dá)融合蛋白 融合蛋白的N末端由原核DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼，含原核細(xì)胞多肽的融合蛋白可避免細(xì)菌蛋白酶的破壞。表達(dá)融合型蛋白時(shí)，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時(shí)，其閱讀框架與融合的DNA片段的閱讀框架要一致，翻譯時(shí)，才不至于產(chǎn)生移碼突變。3.表達(dá)分泌蛋白 表達(dá)分泌蛋白是防止宿主菌對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解，減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷及恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物天然構(gòu)象的最有力

23、措施。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，人們研究比較多的主要是大腸桿菌。大腸桿菌主要由四部分組成：胞質(zhì)、內(nèi)膜、外膜及內(nèi)外膜之間的周間質(zhì)。一般情況下，所謂“分泌”是指蛋白質(zhì)從胞質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入周間質(zhì)這一過程。而蛋白質(zhì)從胞質(zhì)跨過內(nèi)、外膜進(jìn)入培養(yǎng)液的情況較為少見，被稱為“外排”以區(qū)別于“分泌”。工程菌必須在有足夠量的繁殖以后，再表達(dá)目的基因，否則，沒有足夠的菌量，就得不到足夠的表達(dá)產(chǎn)物。通常在細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，再加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，X-gal是常有的誘導(dǎo)物。5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷典型的穿梭質(zhì)粒，分別含有酵母和細(xì)菌的起始位點(diǎn)。4.外源基因在酵母中的克隆和表達(dá) 在酵母中表達(dá)

24、真核基因，表達(dá)產(chǎn)物容易形成正確的折疊和糖基化，但不容易形成較大的表達(dá)量。通常將目的基因插入穿梭載體，在大腸桿菌中擴(kuò)增后，再轉(zhuǎn)入酵母菌進(jìn)行表達(dá)。用酵母菌表達(dá)的不少蛋白質(zhì)已經(jīng)作為基因工程產(chǎn)品，產(chǎn)生了很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。整合載體（yeast integrating plasmid)無酵母的復(fù)制起點(diǎn)，必須整合到染色體中才能穩(wěn)定存在。附加體質(zhì)粒（yeast episomal plasmid)有酵母的復(fù)制起點(diǎn)，在酵母細(xì)胞中以高拷貝存在。復(fù)制質(zhì)粒（yeast replicating plasmid)有酵母的自主復(fù)制序列（autonomous replicating sequence,ARS)，在酵母細(xì)

25、胞中以中等拷貝存在。含著絲粒（CEN)的質(zhì)粒（yeast centromere-containing plasmid)含有ARS和CEN，在酵母細(xì)胞中以單拷貝穩(wěn)定存在。酵母人工染色體（yeast artificial chromosome)含有ARS和CEN和TEL端粒(telomere)，能以微型染色體存在，可以克隆超過100kb的DNA片斷。酵母的表達(dá)載體必須含有可以被RNA聚合酶識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子，如可誘導(dǎo)型的GAL（半乳糖激酶）、PHO5（堿性磷酸酯酶），組成型的ADH1（醇脫氫酶）、PGK（磷酸甘油激酶）、GPD（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）等的啟動(dòng)子。外源基因在植物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)胭脂堿

26、合成酶-新霉素抗性基因T-DNA左端邊緣T-DNA右端邊緣編碼多種轉(zhuǎn)移和整合作用相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)使用共整合載體時(shí)，常用三個(gè)菌株配合：具有輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌；具有攜帶目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌；具有onc-Ti質(zhì)粒衍生的受體載體的根瘤土壤桿菌菌株。植物細(xì)胞有全能性，轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或組織容易培養(yǎng)成植株，但將基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞較困難，被轉(zhuǎn)入的基因有時(shí)不能表達(dá)，或表達(dá)量不足以引起性狀變化，有時(shí)會(huì)抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因作物已有大規(guī)模種植，以抗性基因?yàn)橹鳎灿心唾A藏和改善品質(zhì)的成功范例。乙酰丁香酮乙酰丁香酮*冠癭堿冠癭堿*外源基因在動(dòng)物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)T抗原基因外殼蛋白基因猿猴細(xì)胞為SV40的受納細(xì)胞，

27、嚙齒類細(xì)胞為非受納細(xì)胞，人體細(xì)胞為半受納細(xì)胞 構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，將原病毒DNA插入大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322，然后用抗性基因如新霉素抗性基因(neo)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等取代病毒的gag(group specific antigen，種群特異性抗原)、pol（polymerase，聚合酶）和env（envelope，被膜）基因的全部或大部。負(fù)鏈引物結(jié)合位點(diǎn)(negative strand primer binding site)包裝位點(diǎn)綠色熒光蛋白（green flourescent pyotein,GFP)為報(bào)告基因 Per基因被

28、置于GFP的上游，Per基因編碼的蛋白質(zhì)與果蠅的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)有關(guān)，圖中所示果蠅頭部的綠色熒光分散存在，并隨晝夜節(jié)律變化，說明單個(gè)細(xì)胞有自己獨(dú)立的生物鐘。雙雜交系統(tǒng)確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，將目標(biāo)蛋白Y與TA融合表達(dá)，若Y與X可以相互作用，則DB和TA靠近，可以啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。四、蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程可用于按事先的設(shè)計(jì)改造蛋白質(zhì)，首先要充分研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，提出改造方案，再用定點(diǎn)突變的方法改造該蛋白質(zhì)的基因，用改造后的基因表達(dá)蛋白質(zhì)，研究其性能，必要時(shí)提出進(jìn)一步的改造方案，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的改造。蛋白質(zhì)工程已有一些成功的范例，如改造水蛭素的47位（Asn to Lys)提

29、高了抗凝血效率；改造生長(zhǎng)激素提高了其特異性；融合t-PA的識(shí)別控制序列和u-PA（尿激酶型纖溶酶原激活劑）的蛋白酶序列，可以提高其溶血栓能力和導(dǎo)向性。但由于問題的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)工程的研究大多數(shù)屬于方法學(xué)研究。增加dNTP濃度等方法可以提高PCR的差錯(cuò)率DNase部分水解，得到平末端或接近平末端的雙鏈片段。圖中未能表示。擴(kuò)增重組合基因，進(jìn)行表達(dá)和選擇人類疾病的基因治療人類疾病的基因治療逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因治療 基因治療的基本條件：病因明確的單基因病；僅限于體細(xì)胞治療；可提取病人的靶細(xì)胞，基因操作后再回輸病人體內(nèi)；治療效果要大于對(duì)病人的危害；要用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)充分證明其療效和安全性?；蛑委煹牟呗裕夯?/p>

30、矯正；基因置換；基因增補(bǔ)；基因失活?；蛑委煹耐緩剑洪g接體內(nèi)療法（多用逆轉(zhuǎn)錄病毒）；直接體內(nèi)療法（多用腺病毒）?；蛑委熋媾R的困難：多數(shù)疾病的分子機(jī)制不明；基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制不明；治療方案多采用間接體內(nèi)療法，細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的變化，回輸體內(nèi)的去向不夠明確；外源基因隨機(jī)整合的潛在危險(xiǎn)值得關(guān)注。腺病毒介導(dǎo)的基因治療轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多用于基礎(chǔ)研究和基因治療的研究，已取得一些成就，擔(dān)仍有不少問題需要解決。動(dòng)物生物反應(yīng)器的研究已有一定成就，但在生產(chǎn)上應(yīng)用也不少問題需要解決?；疽?.掌握DNA克隆的基本原理。（重點(diǎn)）2.熟悉基因的分離、合成和測(cè)序的基本方法。（難點(diǎn)）3.熟悉克隆基因表達(dá)的主要方式。（難點(diǎn)）4.熟悉蛋白質(zhì)工程的基本原理。（難點(diǎn)）5.熟悉基因工程的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景。（重點(diǎn)）