《瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)》PPT課件

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1、實(shí) 驗(yàn) 二 馬 立 克 氏 病瓊 脂 擴(kuò) 散 實(shí) 驗(yàn) 雞 馬 立 克 氏 病 是 由雞 馬 立 克 氏 病 病 毒（ MDV） 引 起 的 雞 的 一 種腫 瘤 性 傳 染 病 。 臨 床 上 以消 瘦 、 麻 痹 、 皮 膚 和 內(nèi) 臟出 現(xiàn) 腫 瘤 為 主 要 特 征 。 可造 成 嚴(yán) 重 的 經(jīng) 濟(jì) 損 失 ， 是世 界 養(yǎng) 雞 業(yè) 的 主 要 疾病 之 一 。 雞 馬 立 克 氏 病 引 起 的 劈 叉 姿 勢(shì) 流 行 病 學(xué) 臨 床 癥 狀 病 理 組 織 學(xué) 檢 查 病 毒 分 離 鑒 定 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) : 瓊 脂 擴(kuò) 散 實(shí) 驗(yàn) (OIE推 薦 的 替 代 試 驗(yàn) 方 法

2、)馬 立 克 氏 病 診 斷 主 要 根 據(jù) 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 實(shí) 驗(yàn)AGP可 用 于 20日 齡 以 上 馬 立 克 氏 病 雞 羽 髓抗 原 檢 測(cè) 和 1月 齡 以 上 雞 血 清 抗 體 檢 測(cè) 。 目 的 要 求 了 解 瓊 脂 擴(kuò) 散 試 驗(yàn) 進(jìn) 行 疾 病 診 斷 的 操 作 和 結(jié) 果 判 定 方 法 儀 器 與 材 料 器 材 ： 瓊 脂 打 孔 器 、 微 量 移 液 器 或 帶 膠 乳 頭 滴 管 、 平 皿 等 。 試 劑 ： 馬 立 克 氏 病 標(biāo) 準(zhǔn) 抗 原 、 標(biāo) 準(zhǔn) 陽(yáng) 性 血 清 和 標(biāo) 準(zhǔn) 陰 性 血 清 。 實(shí) 驗(yàn) 類 型 單 向 單 擴(kuò) 散 、 單

3、 向 雙 擴(kuò) 散 、 雙 向 單 擴(kuò) 散 、 雙 向 雙 擴(kuò) 散 利 用 可 溶 性 抗 原 和 抗 體 在 半 固 體 凝 膠 中 進(jìn) 行 相 向 擴(kuò) 散 反 應(yīng) ，當(dāng) 抗 原 抗 體 分 子 相 遇 并 達(dá) 到 適 當(dāng) 比 例 時(shí) ， 就 會(huì) 互 相 結(jié) 合 、 凝 集 ，在 兩 孔 之 間 比 例 最 合 適 的 位 置 上 出 現(xiàn) 白 色 沉 淀 帶 ， 從 而 判 定 相 應(yīng)的 抗 體 和 抗 原 。 可 用 于 20日 齡 以 上 馬 立 克 氏 病 雞 羽 髓 抗 原 檢 測(cè) 和 1月 齡 以 上雞 血 清 抗 體 檢 測(cè) 。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 實(shí) 驗(yàn) 原 理 A. 瓊 脂 糖 的

4、 疏 散 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 有 利 于 大 分 子 的 自 由 遷 移 ；B. 合 適 比 例 的 抗 原 抗 體 結(jié) 合 后 聚 集 形 成 沉 淀 ；C. 沉 淀 的 產(chǎn) 生 阻 止 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 的 自 由 運(yùn) 動(dòng) ；D. 沉 淀 帶 一 經(jīng) 形 成 ， 就 像 一 道 特 異 性 的 屏 障 一 樣 ， 繼 續(xù) 擴(kuò) 散 而來(lái) 的 相 同 的 抗 原 抗 體 ， 只 能 是 沉 淀 帶 加 濃 加 厚 ， 而 不 能 再 向外 擴(kuò) 散 ， 但 對(duì) 其 他 抗 原 抗 體 系 統(tǒng) 則 無(wú) 屏 障 作 用 。 沉 淀 線 的 特 征 與 位 置 ： 1 抗 原 、 抗 體 的 特

5、 異 性 和 濃 度 2 抗 原 、 抗 體 分 子 的 大 小 3 擴(kuò) 散 率 實(shí) 驗(yàn) 原 理 a.如 抗 原 抗 體 的 濃 度 基 本 平 衡 時(shí) ， 此 沉 淀 帶 的 位 置 主 要 決 定 于 兩 者 的 擴(kuò) 散 系 數(shù) 。b.如 果 抗 原 過(guò) 多 ， 則 沉 淀 帶 向 抗 體 偏 移 ， 反 之 亦 然 。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 實(shí) 驗(yàn) 原 理 抗 原 分 子 量 抗 體 分 子 量 抗 原 分 子 量 =抗 體 分 子 量抗 原 分 子 量 抗 體 分 子 量c. 1%瓊 脂 粉 封 底 1 萬(wàn) 硫 柳 汞 水 浴 加 熱 融 化實(shí) 驗(yàn) 步 驟 瓊 脂 平 板 制 備 雞 群 馬

6、 立 克 氏 病 感 染 情 況 的 監(jiān) 測(cè) 通 常 采 用 瓊 脂 擴(kuò) 散 試 驗(yàn) ，檢 測(cè) 對(duì) 象 包 括 ： 血 清 中 馬 立 克 氏 病 病 毒 特 異 抗 體 或 感 染 雞 羽 髓中 馬 立 克 氏 病 病 毒 抗 原 。 其 操 作 方 法 如 下 ：1 瓊 脂 糖 平 板 制 備 用 0.01M pH7.4的 PBS配 制 1 瓊 脂 糖 溶液 ， 水 浴 加 溫 充 分 溶 化 后 ， 加 入 培 養(yǎng) 皿 ， 制 成 厚 度 約 2 3mm厚的 瓊 脂 糖 凝 膠 板 ； 置 于 室 溫 下 冷 卻 凝 固 后 ， 用 7孔 （ 梅 花 孔 ） 打孔 器 準(zhǔn) 確 打 孔 ，

7、 加 熱 封 底 。 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 2 檢 測(cè) 血 清 抗 體 時(shí) ， 中 央 孔 內(nèi) 滴 加 馬 立 克 氏 病 病 毒 標(biāo) 準(zhǔn) 瓊 擴(kuò) 抗原 ， 周 邊 孔 滴 加 待 檢 血 清 ， 但 至 少 一 孔 加 陽(yáng) 性 血 清 ， 抗 原 和 血清 的 加 入 量 以 加 滿 而 不 溢 出 為 度 。 樣 品 加 畢 后 ， 將 瓊 脂 平 皿 加蓋 后 平 放 于 加 蓋 的 濕 盒 內(nèi) ， 37 溫 箱 中 孵 育 8 24h， 觀 察 并 記錄 結(jié) 果 。 測(cè) 定 抗 體 效 價(jià) 時(shí) 可 倍 比 稀 釋 血 清 ， 以 出 現(xiàn) 沉 淀 帶 的 血清 最 大 稀 釋 度 為 抗 體

8、效 價(jià) 。 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 3 檢 測(cè) 抗 原 時(shí) ， 中 央 孔 加 馬 立 克 氏 病 標(biāo) 準(zhǔn) 陽(yáng) 性 血 清 ， 周 邊 1、 4孔 加 馬 立 克 氏 病 標(biāo) 準(zhǔn) 瓊 擴(kuò) 抗 原 ， 周 邊 2、 3、 5、 6孔 加 待 檢 羽 髓浸 液 ， 即 在 試 管 內(nèi) 加 入 1 2滴 PBS然 后 將 羽 髓 在 其 中 擠 壓 而 成 。加 樣 后 將 瓊 脂 平 皿 置 濕 盒 內(nèi) ， 于 37 溫 箱 孵 育 ， 8 24h內(nèi) 觀 察結(jié) 果 。 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 1、 切 勿 劇 烈 振 蕩 融 化 后 的 瓊 脂 糖 ， 防 止 氣 泡 的 出 現(xiàn) 。2、 反 應(yīng) 時(shí) 間 要 適

9、宜 ， 時(shí) 間 過(guò) 長(zhǎng) ， 沉 淀 線 可 解 離 而 導(dǎo) 致 假 陰 性 、 不 出 現(xiàn) 或 不 清 楚 。 3、 加 樣 時(shí) ， 注 意 不 要 產(chǎn) 生 氣 泡 ， 以 加 滿 為 度 。 4、 每 加 完 不 同 的 樣 后 要 更 換 槍 頭 ， 以 免 造 成 污 染 。 注 意 事 項(xiàng) 實(shí) 驗(yàn) 步 驟抗 原 檢 測(cè)Ab+Ag+ 32Ag+6 5檢 測(cè) 羽 髓 抗 原 2， 3， 5， 6孔 分 別加 入 倍 比 稀 釋 的 待 檢 羽 髓 浸 液 Ag+ 4 3216 5檢 測(cè) 待 檢 血 清15孔 分 別 加 入 倍 比 稀 釋 的 待 測(cè) 效價(jià) 的 血 清 ， 6孔 加 PBS

10、抗 體 檢 測(cè) 當(dāng) 被 檢 樣 品 孔 與 中 心 孔 之 間 形 成 清 晰 的 沉 淀 線 ， 并 與 周 邊 已知 抗 原 孔 的 沉 淀 線 互 相 融 合 時(shí) 判 為 陽(yáng) 性 ； 不 出 現(xiàn) 沉 淀 線 者 判 為陰 性 結(jié) 果 判 定 已 知 抗 原 與 陽(yáng) 性 血 清 之 間 所 產(chǎn) 生 的 沉 淀 線 末 端 彎 向被 檢 樣 品 孔 內(nèi) 側(cè) 時(shí) ， 則 該 被 檢 樣 品 判 為 弱 陽(yáng) 性 。 結(jié) 果 判 定 Ag+Ab+ 待 檢 血 清 被 檢 材 料 可 能 出 現(xiàn) 兩 條 以 上 沉 淀 線 ， 其 中 一 條 與 已 知 抗 原 和陽(yáng) 性 血 清 的 沉 淀 線 融

11、 合 者 判 為 陽(yáng) 性 。 當(dāng) 抗 原 存 在 多 種 成 分 時(shí) ， 將呈 現(xiàn) 多 條 沉 淀 線 以 至 交 叉 反 應(yīng) 線 ， 因 此 可 用 來(lái) 檢 查 抗 原 和 免 疫 血清 的 特 異 性 、 純 度 或 濃 度 ， 比 較 抗 原 之 間 的 異 同 點(diǎn) ， 因 而 應(yīng) 用 范圍 較 廣 。 標(biāo) 準(zhǔn) 瓊 擴(kuò) 抗 原 待 檢 羽 髓 浸 液 結(jié) 果 判 定 此 沉 淀 帶 的 基 本 形 式 分 為 3種 。 試 分 析 在 抗 原 和 抗 體 分 子 量 相 同 時(shí) ， 以 下 六 種 情 況 中 抗 原 和抗 體 的 濃 度 差 異 以 及 在 凝 膠 中 的 擴(kuò) 散 率 大 小 （ 用 、 、 表 示 ） A B C D E F AgAb