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1、SYBR Green I 工 作 原 理未 結(jié) 合 的 SYBR green I 結(jié)合解離曲線識別不同的PCR產(chǎn)物95 15sec; 60 20sec; 95 15sec在 60 95 之 間 的 Ramp time設(shè) 為 19:59 SYBR Green I的 特 點可 以 用 于 不 同 的 模 板使 用 方 便 ， 價 格 相 對 便 宜靈 敏 度 很 高與 非 特 異 性 產(chǎn) 物 結(jié) 合解 離 曲 線選 擇 良 好 的 引 物 和 探 針 并 優(yōu) 化 反 應(yīng) 條 件 TaqMan Probes熒 光 素 淬 滅 劑 與 目 標(biāo) 序 列 互 補FAMTETJOEHEXVIC TAMRA
2、DABCYL TaqMan Probes工 作 原 理探 針 與 目 標(biāo) 序 列 配 對 時 ，發(fā)生 FRET能 量 轉(zhuǎn) 移Taq 游 離 的 探 針熒 光 基 團 淬 滅 劑 延 伸 時 ， Taq酶 水 解 探 針 ， 使 報 告 熒 光 基團 和 淬 滅 熒 光 基 團 分 離 而 發(fā) 出 熒 光 ， 形 成熒 光 信 號 Taq 發(fā) 出 熒 光光 另 一 波 長 的 熒 光 隨 著 擴 增 循 環(huán) 數(shù) 的 增 加 ， TaqMan探 針 釋放 出 來 的 熒 光 基 團 不 斷 積 累 。 因 此 熒 光強 度 與 擴 增 產(chǎn) 物 的 數(shù) 量 呈 正 比 關(guān) 系 TaqMan探 針 應(yīng)
3、 用 基 因 檢 測 、 病 毒 定 量 、細 胞 因 子 基 因 定 量 、 癌 細 胞 基 因 微 突 變檢 測 等 其 結(jié) 果 都 具 有 高 特 異 性 與 高 敏 感 性 但 只 適 合 于 一 個 特 定 的 目 標(biāo) TaqMan MGB探 針 熒 光 素 非 熒 光 淬滅 基 團與 目 標(biāo) 序 列 互 補 MGB(Minor Groove Binder)將 探 針 的 Tm值 提 高 10因 此 ， MGB探 針 可 以 比 普 通 TaqMan探 針 設(shè) 計 得 更 短 ， 既 降 低了 合 成 成 本 ， 也 使 得 探 針 設(shè) 計 的 成 功 率 大 為 提 高 。TaqM
4、an MGB探 針 對 于 富 含 A/T的 模 板 可 以 區(qū) 分 得 更 為 理 想 。 分 子 信 標(biāo) (發(fā) 夾 型 雜 交 探 針 )熒 光 基 團 莖 由 互 補 配 對的 序 列 組 成環(huán) 與 目 標(biāo) 序 列 互 補 (5-7bp)環(huán) （ 15-30bp）FAM Texas Red 分 子 信 標(biāo) 工 作 原 理 探 針 雜 交 到 DNA模 板光發(fā)出熒光熒 光 基 團 DNA 模 板 環(huán)光淬滅 分 子 信 標(biāo) 能 特 異 性 地 檢 測 感 興 趣 的 目 標(biāo) DNA 分 子 信 標(biāo) 可 用 于 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性 的 檢 測 特 別 適 用 于 檢 測 點 突 變 只
5、能 用 于 一 個 特 定 的 目 標(biāo) 設(shè) 計 困 難 價 格 較 高 常 用 的 熱 循 環(huán) 儀 Company PCR system Sample format Max sample numberApplied Biosystems ABI Prism 7700 SDSGeneAmp 5700 SDSABI Prism 7900 HT SDS MicroplateTubesMicroplateTubesMicroplate 969696, 384Bio-Rad www.bio- iCycler iQ MicroplateTubes 9696Cepheid Smart Cycler Tu
6、bes 16Corbett Research Rotor-Gene TubesStrip tubes 3272Roche Molecular Biochemicals LightCycler Capillaries 32 ABI Prism 7700o可 以 在 同 一 反 應(yīng) 體 系 中同 時 對 多 個 靶 基 因 分 子進 行 擴 增o一 次 可 以 測 定 96個 樣 本 ，并 且 速 度 較 快 ， 一 批 樣本 的 完 成 只 需 要 2 3小時o用 于 水 解 探 針 、 雙 鏈 DNA結(jié) 合 染 料 、 分 子 信 標(biāo) 的分 析o但 是 它 不 能 實 時 對 擴 增結(jié) 果 進 行 分 析 ， 而 只 能在 全 部 擴 增 結(jié) 束 后 才 進行 數(shù) 據(jù) 分 析
《熒光定量PCR技術(shù)》PPT課件
