《生物芯片分類及應用.ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《生物芯片分類及應用.ppt（73頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。
1、1,一、概念、分類及應用,2,（一）、 兩 個 概 念,生物芯片 主要指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現對細胞、蛋白質、核酸以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。 基因芯片 技術是通過微陣列技術, 將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。,3,微陣列芯片 （Microarray） 微型實驗室芯片 (Lab-on-a-chip) 液體芯片 (Liquichip),（二）、生物芯片分類及應用,4,Lab-on-
2、a-chip,微型實驗室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟樣品準備/生化反應/結果檢測整合在一張芯片上。,5,6,7,Liquichip,Bead , Capture molecule , Analyte , Reporter molecule是構成liquichip 的4個主要部分。 Bead上帶有兩種熒光，根據這兩種熒光的比例可以 將bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。 Capture molecule : 作用相當于探針，能特異性的與被檢測物結合。 Analyte: 樣品中被檢測的成分。 Reporter molecule: 帶有熒光的報告分子，能特異性
3、的與被檢測物結合。,8,Liquichip,反應的一般步驟： 1.先將capture molecule 結合在bead 上， 2.將這種標記了的bead與樣品反應。Capture molecule 可以與相應的 analyte 特異性的結合， 3.此時再加入熒光標記的，特異結合analyte的reporter molecule。 4.檢測：用liquichip workstation 進行檢測。原理是同時對bead和reporter molecule 上的熒光進行檢測。從而確定被結合的analyte的種類和數量。,,9,Liquichip技術特點描述,1基于bead的這種固相反應技術，具有 靈
4、敏度高、信號強度高、靈活性好、所需樣品量少的特點。 2與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應速度更快，靈活性更好。 3由于檢測方法的特點，在大部分的實驗過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應的動態(tài)平衡。 4有配套的蛋白表達和純化體系。（his-tag）,10,Lquichip應 用 領 域：,蛋白質定量 蛋白質功能研究 蛋白表達譜分析。 蛋白質與蛋白質、蛋白質與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質核酸相互作用分析分析。,11,微陣列芯片,蛋白芯片 基因芯片,12,蛋白芯片(Protein Chips),,高通量微陣列蛋白分析方法,利用抗體抗原結合原理，采用
5、化學發(fā)光或熒光檢測 標記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。,13,蛋白芯片應用,免疫學分析 蛋白與蛋白之間相互作用 DNA與蛋白質分子相互作用,14,基因芯片,基因芯片是通過微陣列技術, 將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。 微陣列技術巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎的基因水平的表達監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達調控有更深入的了解。,15,基因芯片發(fā)展歷史,16,基因芯
6、片,按內涵劃分： cDNA芯片 Oligo芯片:25mer(affymetrix), 70mer(Operon)， 80mer（Clontech）, 按功能劃分： 基因組芯片： 檢測某一基因是否存在，若 存在，拷貝數是多少。探針是DNA. 表達譜芯片：確定基因表達的途徑與表達產 物。探針是RNA或cDNA 測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲 得探針的序列結果。,17,基因芯片應用,基因表達檢測 多態(tài)性分析 遺傳圖譜定位 基因分型 通過雜交反應測定序列,18,基因芯片應用領域,遺傳疾病研究 癌癥 家系遺傳疾病 普通基因突變疾病
7、感染性疾病 藥物篩選 動物植物遺傳篩選育種 個人基因身份證 環(huán)境監(jiān)測,19,（三）、生物芯片應用優(yōu)勢,高通量平行分析樣品 自動化程度高省時省力 所需樣品試劑少保護環(huán)境 成本低,20,生物芯片應用優(yōu)勢,生物信息數據累積 為生物信息公共數據庫添加更多數據 有利于研究基因序列與生物表型之間的關系 有助于理解疾病發(fā)生的機制,21,二、 生物芯片制作技術介紹,22,生物芯片制作方法分類,23,原位合成 (In Situ Synthesis),化學合成 原子印章 原位光刻合成,24,原位光刻合成,美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術，是生產高密度寡核苷酸基因芯片的核心關鍵
8、技術。,25,原位光刻合成原理,Light directed oligonucleotide synthesis. A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites.
9、 The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.,26,預先合成后點樣(off-chip synthesis),接觸式點樣 非接觸式點樣,27,基因芯片點樣的方式,接觸式點樣---適合于DNA芯片的制作 即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上,28,接觸式點樣,Best!,29,ArrayIt ChipMaker Pi
10、ns,帶有細槽的不銹鋼針尖 載樣能力: 200 to 600 nL 點樣體積: 250 pL to 2.5 nL (pin size) 點樣直徑: 100 m to 500 m (pin size),Dipping of pin for sample pickup Touching of slide with pin to leave spot Control print volume with pin size,30,Stealth and Chipmaker Pin (TeleChem),31,Chipmaker 點樣技術,,,32,Stealth Pins,33,34,TeleChem公
11、司點樣針技術 不斷發(fā)展的專利針技術 共有30種針供選擇,與斯坦福大學共同發(fā)展 專利 pin, 帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高 單次帶樣可連續(xù)點樣達200--1500次 特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液 實際點樣直徑75--250um,可根據不同樣品選擇相應pin 相當容易更換pin和pin head以適應不同需要,35,基因芯片點樣的方式,非接觸式點樣---適合于蛋白芯片的制作 它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面,36,非接觸式噴點技術,Thermal,Solenoid 螺線管,Piezoelectric,37,Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結合起來精確控制滴
12、液 Piezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側壁，噴管出現收縮壓迫液體從噴嘴噴出。,38,非接觸式點樣：synQUAD Technology,39,,,,,Aspirate and Print for Making Arrays,40,Characteristics of synQUAD Technology,Wide dispense range Low nanoliter to high microliter Excellent linearity Precise and accurate CVs
13、typically less than 10% Precision less than 5% Non-contact dispense mechanism Easier mechanical alignment (384, 1536,) “On-the-fly” printing possible Capable of dispensing onto membranes or slides Multiple liquid handling modes Aspirate/Dispense Continuous Reagent Dispensing,41,synQUAD vs Piezoelect
14、ric Printing,synQUAD / nQUAD Patented by Cartesian Uses commercially available components Robust and reliable delivery mechanism Low nanoliter to low microliter dispense volume maximum density: 200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubb
15、les Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm2,42,三、生物芯片檢測系統(tǒng),CCD掃描儀 非共聚焦激光掃描儀 激光共聚焦掃描儀,43,數值孔徑與采光效率,NA 0.3 NA 0.8,NA = sin(), where is the angle of the cone,44,激光共聚焦（聚焦）,The fluorescence source is at the objective lens focus Light goes through the pinhole to the detector,45,激光共聚焦（非聚焦）,Fluorescen
16、ce source below focus (e.g. out of focus) Out of focus light is mostly blocked at the pinhole,46,Confocal Artifact RejectionNo Pinhole With Pinhole,Dust artifacts reduced by at least a factor of 10,47,CCD Camera Systems Advantages: Few moving parts Fast scanning of bright samples Disadvantag
17、es: NA limited to about 0.40: Less appropriate for dim samples Optical scatter can limit performance Need to “stitch” together large images Confocal Laser Scanners Advantages Small depth of focus reduces artifacts high light collection efficiency. PMT detectors have the highest sensitivity in the vi
18、sible range,48,DNAscope LM+ 激光共聚焦芯片掃描儀,49,,x,,,,,,,,,,,,,x,y,,z,,,,,,,,,,,,,,,x,,,,,,,MACROscope,Filters,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,50,How the Scan System Works F-theta Telecentric Scan System,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Sample,Scanning Mirror,Laser Scan Lens,,,,,B,A,C,,,,,,,,51,,,,How to scan a whole sampl
19、e,,,,,,,,,,,,,,,,,,Home Sensor,Scanning Mirror,Sample,Laser Scan Lens,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,52,DNAscope LM+ 優(yōu)點 共聚焦面積寬 : 20mm70mm 可以掃描多種介質 (Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes) 背景噪聲低，信噪比高 全自動成像，分析結果 Small footprint (W20cm x L30cm x H20cm),53,,Imaging Arrays Both Dry & Wet,Dry PBS
20、 buffer,Cy3 Cy5,Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats,54,Tube 1,Tube 2,Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes,,55,四、生物芯片技術思路的比較,56,,Comparison of DNA Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip based assays is a
21、 function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 20n o
22、r 80 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,,,,,57,cDNA芯片的缺點,由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。 同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結果的準確性也受到影響。 有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。 PCR產物是結合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性
23、抑制，影響探針和模板的結合能力和穩(wěn)定性，進一步影響cDNA芯片的分辨能力和結果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產物濃度不均一也可能導致錯誤的結論。,58,寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點,探針序列經過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因； 減少二級結構 及其對雜交結果的影響 雜交溫度均一，提高雜交效率； 合成產物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點樣量差異 ； 可以設計檢測不同剪切方式的基因； 無需擴增，防止擴增失敗影響實驗 。,59,預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本cDNA芯片,60,預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本自己合成寡聚核苷酸芯片,61,預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本
24、應用Operon探針寡聚核苷酸芯片,62,Affymetrix技術平臺綜合成本,63,總結,采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實力雄厚的科研實驗室，可以在最短的時間內盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實驗結果，并可在國際權威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關研究領域在國際領域占領一席之地。,64,總結,采用合成后點樣的生物芯片平臺比較適合于目標定位于研發(fā)、生產的實驗室及生物公司。雖然購買芯片點樣掃描系統(tǒng)的經費看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費用要低，研發(fā)的方向可以結合實驗室的研究特點，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信
25、息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產的芯片為材料進行的研究一般為驗證性工作，且因為材料的可靠性低，很難在國際權威雜志上獲得認可。目前開發(fā)生產的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產品。,65,五、生物芯片制作所需耗材,66,Microarraying Accessories（芯片配件）,Pins and Printheads,OmniGrid Slides and Reagents OmniGrid Epoxy(環(huán)氧基修飾) OmniGrid Amine(氨基修飾) OmniGrid Aldehyde(醛基修飾) Complete line of associated reagents,Hybridiza
26、tion Chambers HybChamber HybChamber Mica,67,Slides: Epoxy Aldehyde Amine,Buffers: Spotting Blocking Hybridization,OmniGrid Slides & Reagents芯片研究片基和試劑,68,Substrates,膜： S & S NC膜及Supercharge尼龍膜 玻璃片： S & S FAST CEL 醛基化、氨基化玻片 DAKO玻片 Telechem SuperClean/SuperAmine/SuperAldehyde,69,Hybridization Cassete,1
27、. Telechem,2. Clontech Plastic Hybridization Cassete,,70,Wash Station,71,基因公司芯片系統(tǒng)客戶,72,完善的售后服務體系,基因公司在全國各主要地區(qū)設有7處維修站，其中直接為生物芯片設備提供維護、維修服務的工程師有4人，主要集中在上海和北京。這些工程師都具有多年的生物芯片相關設備的安裝、調試、維護、維修經驗 。 上海晶泰生物技術有限公司作為基因有限公司的全資子公司，該公司的生物芯片實驗室擁有目前國內領先的生物芯片點樣、掃描設備，以及相關的如雜交爐、洗滌工作站等全套的實驗設備。同時，公司目前擁有生物芯片領域的大量專業(yè)技術人才，目前，生物芯片實驗室擁有本科以上20人，碩士5人、博士5人。該公司對外提供涉及生物芯片領域的各項商業(yè)服務：點樣、掃描、芯片設計制作等全方位的服務。,73,謝謝各位老師 ！,
生物芯片分類及應用.ppt
