分子診斷學(xué)：第五章 生物芯片技術(shù)

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1、第五章第五章 生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)v了解生物芯片的功能、作用、以及生物芯片技術(shù)的最新進(jìn)展。v熟悉生物芯片的種類、作用以及基因芯片、蛋白芯片的原理及其制備方法。v掌握基因芯片的工作原理、制備方法及其在臨床診斷中的意義。第一節(jié)第一節(jié) 生物芯片概述生物芯片概述 早在八十年代初有人就曾設(shè)想利用計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對(duì)人類基因組大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查，但直到光引導(dǎo)原位合成(light-directed in situ synthesis)高密度探針技術(shù)和激光共聚焦顯微掃描問世之后才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)，并迅速應(yīng)用到分子生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，得到了科學(xué)界的高度重視。生物生物芯芯片生物芯片技術(shù)

2、是一種高通量檢測(cè)技術(shù)。通常我們所說的生物芯片是將含不同生物信息的生物分子集成集成到一塊芯片上,用以同時(shí)分析多種生物分子的信息。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。DNA的一些基本概念的一些基本概念u絕大多數(shù)的生物是用DNA做為遺傳物質(zhì)。u生物的每個(gè)細(xì)胞都包含了完整的DNA信息。u每個(gè)人類細(xì)胞包含了30億個(gè)堿基（A，G，C，T）。u不同物種的DNA序列都不同，每個(gè)生物體之間也有差異。因此，我們可以用DNA檢測(cè)來鑒定和檢測(cè)物種和個(gè)體。人有多少基因?Fruit fly:13,000 genesHuman:28,000 genes.The s

3、urprisingly small number of genes in the human genome(100,000 expected;30,000 identified)was a major surprise from the project.Human Beings are 99.99%the same Millions of differences between of us先天愚型也稱21三體綜合征(47XX+21)或Down綜合征（唐氏綜合征），屬常染色體畸變遺傳病藍(lán)膚癥：藍(lán)色的人，整個(gè)十九世紀(jì)60年代，一個(gè)龐大的“藍(lán)人”家族居住在肯德基州山上，緊挨著克里克聯(lián)盟的印第安人。A

4、n enzyme called“NADH diaphorase,”(輔酶輔酶脫氫酶脫氫酶)。This enzyme repairs hemoglobin that has been damaged by oxidization.Humans in whom this gene is defective cannot make the enzyme,and accumulate damaged hemoglobin,which is blue.As a result,their skin appears blue.什么使他們倆不一樣什么使他們倆不一樣什么使他成這樣什么使他成這樣v速度快、效率高v

5、可同時(shí)對(duì)大量核酸序列進(jìn)行檢測(cè)和分析v操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度更高v總體效率較常規(guī)雜交方法高一、生物芯片的定義一、生物芯片的定義生物芯片是采用類似集成電路制作中的微加工技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的若干不連續(xù)過程如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測(cè)和分析等步驟集成到一塊幾平方厘米大小的芯片上，并使這些分散的過程連續(xù)化與微型化，以此來實(shí)現(xiàn)對(duì)大量生物樣品數(shù)據(jù)的快速、自動(dòng)和并行處理。生物芯片（biochip）采用原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子生物大分子比如核酸片段、多肽等等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜

6、交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。二、生物芯片的特點(diǎn)二、生物芯片的特點(diǎn)v高通量、集成化、并行化和微型化特點(diǎn)特點(diǎn)v高通量：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。v集成化：降低成本，保證質(zhì)量。v高度并行性：提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對(duì)照和閱讀。v微型化：減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率。生物芯片根據(jù)探針不同分為：DNA芯片，蛋白質(zhì)芯片，細(xì)胞芯片，組織芯片。根據(jù)用途不同，可分為：表達(dá)分析芯片，測(cè)序芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室根據(jù)原理和載體不同，可分為：固相芯片和液相芯片v微縮芯

7、片實(shí)驗(yàn)室：是生物芯片發(fā)展的最終目標(biāo)，將各種生物化學(xué)分析操作的整個(gè)過程，從樣品制備、生化反應(yīng)到結(jié)果檢測(cè)，都集成化并縮微到芯片上自動(dòng)完成，以獲得所謂的微型全分析系統(tǒng)生物芯片的應(yīng)用生物芯片的應(yīng)用v分子生物學(xué)、生物進(jìn)化（生物起源及新物種鑒定）v生物醫(yī)學(xué)（新藥的篩選與合成，疾病診斷和治療，如癌癥、早年性癡呆癥等的病因研究）v農(nóng)林科學(xué)（農(nóng)作物育種改良、食品衛(wèi)生監(jiān)督、微生物檢測(cè)）v環(huán)境科學(xué)v生化武器偵檢v司法鑒定等第一節(jié) 基因芯片一、基因芯片的原理二、基因芯片技術(shù)三、基因芯片的應(yīng)用一、基因芯片的原理一、基因芯片的原理v基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段。v原理：將

8、大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行基因的分析。DNA Microarry 原理原理:DNA雜交雜交堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)雜交是雜交是根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理。探針分子固定于支持物上探針分子固定于支持物上固定于支持物上的探針固定于支持物上的探針,與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。固定于支持物上的探針固定于支持物上的探針,與標(biāo)記樣品的堿基不互補(bǔ)與標(biāo)記樣品的堿基不互補(bǔ)則探針與樣品不能進(jìn)行雜交則探針與樣品不能進(jìn)行雜交通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析從而得到基因的表達(dá)水平從

9、而得到基因的表達(dá)水平 正常正常 高表達(dá)高表達(dá) 低表達(dá)低表達(dá)通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基因芯片技術(shù)流程圖基因芯片技術(shù)流程圖 v 基因芯片技術(shù)從本質(zhì)上說與Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾與Southern就專利問題產(chǎn)生沖突），只是探針密度極高而已。不過，為此花費(fèi)了大量的人力物力從事研制工作。當(dāng)然，其結(jié)果也很是誘人。1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探針：高密度的探針序列按照一定的次序固定在支持物上，每個(gè)位點(diǎn)的序列是已知的外觀探針支持物剖面圖平面局部放大硬件：序列合成設(shè)備包括：核酸或多肽合成

10、儀（作預(yù)合成點(diǎn)樣用）、照相平板印刷及半導(dǎo)體制作相應(yīng)設(shè)備（作光引導(dǎo)原位合成）。激光共聚焦顯微掃描設(shè)備：激光共聚焦顯微鏡或相應(yīng)設(shè)備，以采集高密度點(diǎn)陣雜交信號(hào)并進(jìn)行數(shù)字化處理分析。軟件基因序列分析及探針篩選技術(shù)（可能涉及專利等產(chǎn)權(quán)問題）序列合成及定位技術(shù)（光引導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣技術(shù)）雜交信號(hào)的采集和分析技術(shù)（需要處理極大量的雜交信號(hào)并能由此得到所需信息）二、基因芯片技術(shù)二、基因芯片技術(shù)v基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)以及結(jié)果分析。（一）芯片制備 1.合成探針 探針合成是基因芯片制作的首要步驟。基因組探針：從基因組文庫中選擇與待測(cè)靶序列完全匹配或帶有突變 位

11、點(diǎn)的序列，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得cDNA探針：根據(jù)待分析基因表達(dá)的mRNA，從cDNA文庫中通過PCR技術(shù) 擴(kuò)增獲取，擴(kuò)增片段的選擇盡可能靠近c(diǎn)DNA序列的3端，長(zhǎng)度一般在1kb左右寡核苷酸探針：對(duì)于較短的寡核苷酸探針，則可以直接應(yīng)用DNA合成 儀合成2.探針在載體表面的固定（分為兩大類）原位合成：在支持物表面原位合成寡核苷酸探針，適用于寡核苷 酸，有原位光刻合成、壓電打印法和分子印章原位合 成三種途徑合成點(diǎn)樣：將預(yù)先合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的 高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上的技術(shù)，用于大片段 DNA，寡核苷酸，mRNA。固相載體材料固體片狀材料：主要有玻片、硅片和瓷片等；膜

12、性材料：有硝酸纖維素膜、尼龍膜以及聚丙烯膜等?；蛐酒嗖捎幂d玻片或者尼龍膜做載體為使探針能穩(wěn)定固定在片基表面，需對(duì)片基進(jìn)行化學(xué)處理，即活化，主要是涂布多聚賴氨酸或者包被氨基硅烷偶聯(lián)試劑 原位合成有三種途徑：原位合成有三種途徑：原位光刻合成壓電打印法 分子印章原位合成法。DNA固相合成法DNA固相合成法原位光刻合成v原理：v首先使支持物羥基化，光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)。v在合成堿基單體的5羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。v選取適當(dāng)?shù)谋喂饽?mask)使需要聚合的部位透光，受光部位的羥基脫保護(hù)而活化。v因?yàn)楹铣伤玫膯误w分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應(yīng)后仍

13、舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)。v每次通過控制透光與不透光決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。v 圖103原位光刻合成技術(shù)的流程圖 原位光刻合成v優(yōu)點(diǎn)：合成效率高，點(diǎn)陣密度高v缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)率低壓電打印法原理v其裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)并無兩樣，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。v將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計(jì)算機(jī)控制噴墨打印機(jī)將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。沖洗、去保護(hù)、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術(shù)。如此類推，可以合成出長(zhǎng)度為40到50個(gè)堿基的探針。v 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備廉價(jià)，技術(shù)相對(duì)

14、簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)率高v 缺點(diǎn)：點(diǎn)陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染壓電打印原位合成法工作方式 預(yù)合成點(diǎn)樣技術(shù)（Off-chip synthesis)這一方法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA或蛋白固相合成儀進(jìn)行。多聚物合成后再用特殊的點(diǎn)樣裝置或儀器將其以較高密度分布于硝酸纖維膜或經(jīng)過特殊處理的玻璃片上，點(diǎn)陣密度可達(dá)到2500spots/cm2（Yershov et al報(bào)道點(diǎn)陣密度最高可達(dá)20,000-30,000spots/cm2）。二、樣品的制備二、樣品的制備v樣品的制備過程包括：核酸分子的純化、擴(kuò)增和標(biāo)記1樣品的分離純化樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得主要從活組織或血液中獲得

15、DNA或或mRNA，這個(gè)，這個(gè)過程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸過程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。的過程。二、樣品的制備二、樣品的制備v2.擴(kuò)增：測(cè)定過程需要較多的樣本v基因類型分析的樣本是DNA（PCR直接擴(kuò)增）v基因表達(dá)研究的樣本是cDNA（RT-PCR制備）v3.標(biāo)記：v樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，通常為酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和核素標(biāo)記。v帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴(kuò)增的過程，摻入靶分子序列。v也可以在制備引物時(shí)，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。v 樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量

16、影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，反樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。v熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，沒有同位素標(biāo)記的限制，而且可以采用雙色，如對(duì)照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷，因此被廣泛應(yīng)用于基因芯片樣品的標(biāo)記。（三）雜交反應(yīng)v雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng),產(chǎn)生一系列信息的過程，是芯片技術(shù)中除芯片制備外最重要的一步。v原理：液相中探針與DNA片段按堿基配對(duì)規(guī)則形成雙鏈反應(yīng)v 芯片雜交反應(yīng)的條件依據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時(shí)間。依

17、據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時(shí)間。通常采用的條件是：通常采用的條件是：4242，50%50%甲酰胺，甲酰胺，6 6SSCSSC，0.5%SDS0.5%SDS，5 5DenhardtDenhardt試劑。試劑。也可采用也可采用6565，6 6SSCSSC，0.5%SDS0.5%SDS，5 5DenhardtDenhardt試劑或者試劑或者6565，10%SDS10%SDS，7%PEG-8007%PEG-800。雜交過程類似雜交過程類似NorthernNorthern或或SouthernSouthern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干

18、燥與檢測(cè)。干燥與檢測(cè)。v選擇合適的反應(yīng)條件能減少生物分子之間的錯(cuò)配率。v選擇雜交條件時(shí)，必須滿足檢測(cè)時(shí)的靈敏度和特異性。使能檢測(cè)到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交。v溫度、非特異性本底等均會(huì)影響雜交結(jié)果v 最好在封閉循環(huán)條件下雜交（四）信號(hào)檢測(cè)和分析v雜交信號(hào)的檢測(cè)方法很多，如熒光顯影法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維等，其中使用最廣泛的是熒光顯影法。熒光檢測(cè)法的主要過程v主要過程：熒光素標(biāo)記擴(kuò)增過的靶序列或樣品，與芯片上的探針雜交，洗去未雜交分子，熒光顯微鏡對(duì)片基進(jìn)行掃描，采集每點(diǎn)熒光強(qiáng)度并分析比較。v正常的堿基配對(duì)雙鏈比錯(cuò)配雙鏈分子具有較高的穩(wěn)定性，探針與樣品完全配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光

19、信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng)，且熒光信號(hào)的強(qiáng)度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關(guān)系。因此精確測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度就可反映雜交反應(yīng)的特異性和強(qiáng)弱。v分析檢測(cè)熒光強(qiáng)度的主要手段：v激光共聚焦顯微掃描技術(shù)和電荷偶聯(lián)裝置照相機(jī)(charged-coupled device camera,CCD)（四）顯色和分析測(cè)定方法（四）顯色和分析測(cè)定方法熒光法：重復(fù)性好，但靈敏度較低。（正常配對(duì)與錯(cuò)配均能發(fā)出陽性信號(hào)）多色熒光技術(shù)：提高基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和測(cè)量范圍。（把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長(zhǎng)的熒光物來修飾）光纖DNA生物傳感器微陣列(fiber-optic DNA biosensor microarray)：（將生物傳感

20、器與微陣列的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起的方法）操作分析過程非常快速，5min內(nèi)即可完成，且不需要激光共聚焦顯微鏡。基因芯片研制的總體藍(lán)圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測(cè)樣品 的制備探針陣列的準(zhǔn)備檢測(cè)設(shè)備的研制雜交檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析基因芯片的應(yīng)用基因芯片的應(yīng)用Kary B.Mullis,PhDNobel Prize 1993polymerase chain reaction(PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) DNA 擴(kuò)增DNA 擴(kuò)增RT-PCR 測(cè)定基因表達(dá)水平 RNAControlCellsTreatedCells RNA測(cè)數(shù)個(gè)基因PCRElectrophoresiscDNAVE

21、GF實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR (Real Time PCR)測(cè)數(shù)十個(gè)基因測(cè)數(shù)十個(gè)基因 正常正常 高表達(dá)高表達(dá) 低表達(dá)低表達(dá)基因芯片基因芯片同時(shí)檢測(cè)數(shù)千基因的表達(dá)。三、基因芯片的應(yīng)用三、基因芯片的應(yīng)用1.尋找和發(fā)現(xiàn)新基因?qū)ふ液桶l(fā)現(xiàn)新基因?qū)DNAcDNA文庫的克隆擴(kuò)增，以點(diǎn)陣形式排列在載文庫的克隆擴(kuò)增，以點(diǎn)陣形式排列在載體上，用特定的寡核苷酸探針系統(tǒng)與其雜交，體上，用特定的寡核苷酸探針系統(tǒng)與其雜交，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析即可快速地對(duì)文庫中代表對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析即可快速地對(duì)文庫中代表不同基因的不同基因的cDNAcDNA克隆予以鑒定和分類。通過相克隆予以鑒定和分類。通過相應(yīng)的公式計(jì)算出克隆的相似系數(shù)，并進(jìn)行比應(yīng)

22、的公式計(jì)算出克隆的相似系數(shù)，并進(jìn)行比較，不但可以得到各基因的表達(dá)豐度，而且可較，不但可以得到各基因的表達(dá)豐度，而且可以發(fā)現(xiàn)新的基因。以發(fā)現(xiàn)新的基因。三、基因芯片的應(yīng)用三、基因芯片的應(yīng)用2.基因表達(dá)分析基因表達(dá)分析 對(duì)基因功能的研究對(duì)基因功能的研究將大量的功能基因制成表達(dá)譜芯片，用不同的熒光染料將大量的功能基因制成表達(dá)譜芯片，用不同的熒光染料標(biāo)記不同組織或細(xì)胞的標(biāo)記不同組織或細(xì)胞的mRNAmRNA與芯片上的基因雜交、掃與芯片上的基因雜交、掃描，可得到基因在不同組織或細(xì)胞的表達(dá)譜。再通過描，可得到基因在不同組織或細(xì)胞的表達(dá)譜。再通過計(jì)算機(jī)分析這些基因在不同組織中表達(dá)的差異，可直計(jì)算機(jī)分析這些基因在

23、不同組織中表達(dá)的差異，可直接快速地同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬的基因，這是進(jìn)行基因功接快速地同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬的基因，這是進(jìn)行基因功能研究的重要而高效的手段。能研究的重要而高效的手段。2、基因表達(dá)分析、基因表達(dá)分析三、基因芯片的應(yīng)用三、基因芯片的應(yīng)用3.DNA序列測(cè)定與序列間比較序列測(cè)定與序列間比較（1）DNA序列測(cè)定序列測(cè)定 雜交測(cè)序技術(shù)雜交測(cè)序技術(shù)(sequencing by hybridization,SBH)(sequencing by hybridization,SBH)鄰堆雜交技術(shù)鄰堆雜交技術(shù)(contiguous stacking hybridization,CSH)(contiguous s

24、tacking hybridization,CSH)原理原理:將未知序列的靶將未知序列的靶DNADNA與大量含不同序列的寡核苷酸集合雜與大量含不同序列的寡核苷酸集合雜交形成完整的雙鏈體，根據(jù)堿基配對(duì)的原理確定其互補(bǔ)的靶核交形成完整的雙鏈體，根據(jù)堿基配對(duì)的原理確定其互補(bǔ)的靶核酸序列。對(duì)雜交部位進(jìn)行鑒定和分析并經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理，拼酸序列。對(duì)雜交部位進(jìn)行鑒定和分析并經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理，拼接出正確的靶接出正確的靶DNADNA序列。序列。DNA測(cè)序測(cè)序。如使用美國(guó)Affymetrix公司1998年生產(chǎn)出的帶有13.5萬個(gè)基因探針的芯片就可以使人類DNA解碼速度提高了25倍。三、基因芯片的應(yīng)用三、基因芯片的

25、應(yīng)用v（2）序列比較研究 v在遺傳分析和基因組分析中，常常需要進(jìn)行大規(guī)模的序列比較，確定序列之間的相似性。v原理：一特定DNA在芯片上的雜交特征可與一已知序列的DNA片段相比較，一個(gè)最高得分的特定DNA清單(LIST)與已知序列的清單比較用來判斷其相似性。v序列分析可加快人們對(duì)于不同物種的相關(guān)序列的比較研究，可用于人類基因組多樣性和進(jìn)化研究計(jì)劃。三、基因芯片的應(yīng)用三、基因芯片的應(yīng)用4.突變體和多態(tài)性的檢測(cè)突變體和多態(tài)性的檢測(cè)利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)(ASOs)微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。微陣列建立了簡(jiǎn)

26、單快速的基因多態(tài)性分析方法。（apo(a)(TTTTA)napo(a)(TTTTA)n）5.在疾病診斷的應(yīng)用在疾病診斷的應(yīng)用（1）感染性疾病的診斷 性傳播疾病、肝炎等。（2）遺傳性疾病的診斷 地中海貧血、婚前檢查等。（3）耐藥性檢測(cè) 結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片等。5、疾病診斷、疾病診斷其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是快速簡(jiǎn)便；三是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病?；虮磉_(dá)水平的異?？梢鸺膊腫瘤細(xì)胞多種致癌基因表達(dá)升高v腫瘤細(xì)胞多種腫瘤抑制基因表達(dá)降低v常染色體顯性遺傳性多囊腎 Polycystic Kidney Disease vPKD1 和 PKD2 先天異常v多在40歲以后發(fā)病v

27、半數(shù)出現(xiàn)腎衰遺傳病遺傳病 遲發(fā)型遲發(fā)型基因突變基因突變癌癥抑制基因癌癥抑制基因BRCA1 和和 BRCA2 突變可引起乳腺癌突變可引起乳腺癌檢測(cè)檢測(cè)BRCA1 和和 BRCA2 突變及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌突變及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌癌癥有多基因突變癌癥有多基因突變突變的基因突變的基因P53P19p16子宮內(nèi)膜癌的基因表達(dá)上調(diào)的基因。子宮內(nèi)膜癌的基因表達(dá)下調(diào)的基因。Which treatment?What are my chances?Which class ofcancer?Is it benign?基因在癌癥研究中的應(yīng)用基因在癌癥研究中的應(yīng)用 Understanding Cancer 6、藥物篩選和新藥開發(fā)、

28、藥物篩選和新藥開發(fā) 由于所有藥物都是直接或間接地通過修飾、改變?nèi)祟惢虻谋磉_(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效，而芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達(dá)或蛋白質(zhì)狀況的能力，在藥物篩選方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)點(diǎn)為：其優(yōu)點(diǎn)為：在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前，藥物基因組學(xué)可以通過化合物對(duì)基因多態(tài)性的影響挑選先導(dǎo)物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導(dǎo)致的失敗幾率。在期臨床試驗(yàn)中，個(gè)體基因型可以預(yù)見基因多態(tài)性造成的藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異。由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上，因此在期臨床試驗(yàn)中，由個(gè)體基因型可以預(yù)見基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來指導(dǎo)期臨床試驗(yàn)。一旦發(fā)現(xiàn)一種可以導(dǎo)致藥物作用差異的蛋白，其他與之相關(guān)的蛋白可作為

29、潛在的藥物作用靶。7、環(huán)境保護(hù)、環(huán)境保護(hù) 在環(huán)境保護(hù)上，基因芯片可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害，同時(shí)也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。8 8、司法、司法 通過DNA指紋對(duì)比來鑒定罪犯，未來可以建立全國(guó)甚至全世界的DNA指紋庫，到那時(shí)以直接在犯罪現(xiàn)場(chǎng)對(duì)可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲(chǔ)的DNA“指紋”進(jìn)行比較，以盡快、準(zhǔn)確的破案。9、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 基因芯片技術(shù)可以用來篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，也可以用于基

30、因掃描及基因文庫作圖、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。10.指導(dǎo)個(gè)體化用藥指導(dǎo)個(gè)體化用藥Individualized Chemotherapy種族、個(gè)體等因素都會(huì)導(dǎo)致遺傳背景的差異，臨床上，同樣劑量的藥物對(duì)于不同患者在藥物療效與副作用方面會(huì)有很大差異，如果利用基因芯片技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行診斷再開處方，就可以對(duì)患者實(shí)施個(gè)體化治療。疾病一般不是由單個(gè)基因引起的，在治療中很多同種疾病的具體病因是因人而異的，所以用藥也因人而異。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白芯片蛋白芯片一、蛋白芯片的原理與分類二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測(cè)的基本流程三、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用 蛋白質(zhì)芯片（protein chip），又稱蛋白質(zhì)微陣列(protein micro

31、array)，是用于蛋白質(zhì)功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機(jī)械點(diǎn)樣或共價(jià)結(jié)合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。2、蛋白質(zhì)芯片原理蛋白質(zhì)芯片原理蛋白芯片是指將大量蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)組)按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面行成微陣列，然后與要檢測(cè)的組織或細(xì)胞等進(jìn)行“雜交”，再通過自動(dòng)化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的“雜交”是指蛋白與蛋白之間如(抗體與抗原)在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別。蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome)是指一個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功

32、能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生生物活性的蛋白質(zhì)加工、修飾加工、修飾基因的轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄 表達(dá)表達(dá) 蛋白質(zhì)前體蛋白質(zhì)前體蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome)(proteome)是指一個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為三個(gè)領(lǐng)域:蛋白質(zhì)的大規(guī)模的分離與鑒定，以及它們的表達(dá)后修飾;蛋白水平的差異顯示在疾病中的運(yùn)用;運(yùn)用當(dāng)前的一切手段研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系。蛋白質(zhì)組與基因組的相比蛋白質(zhì)組與基因組的相比:對(duì)

33、一個(gè)機(jī)體而言，基因的數(shù)目是恒定的，而蛋白質(zhì)的種類和數(shù)目在同一個(gè)機(jī)體的不同細(xì)胞中各不相同不相同，即使同一細(xì)胞在不同的時(shí)期，不同條件下，其蛋白質(zhì)表達(dá)也不同 。mRNA水平(包括mRNA 的種類和含量)并不能完全反映出蛋白并不能完全反映出蛋白質(zhì)質(zhì)的表達(dá)。另外從研究手段方面來說，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比基因技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜和困難，不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質(zhì)組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴(kuò)增目的片段，這樣對(duì)于那些含量很低但對(duì)細(xì)胞功能起重要作用的蛋白質(zhì)很難進(jìn)行大規(guī)模的研究。2 蛋白質(zhì)芯片的特點(diǎn)蛋白質(zhì)芯片的特點(diǎn):蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的研究方法，能在一次實(shí)驗(yàn)中提供相當(dāng)大的信息量，使我們能夠

34、全面、準(zhǔn)確的研究蛋白表達(dá)譜。蛋白質(zhì)組芯片的靈敏度高，它可以檢測(cè)出蛋白樣品中微量蛋白的存在，檢測(cè)水平已達(dá)ng 級(jí)。蛋白質(zhì)芯片具有高度的準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類按工作原理分為探針型和凝膠電泳型芯片探針型類似于DNA芯片，即在固相支持物表面高密度排列的探針蛋白質(zhì)點(diǎn)陣，可特異捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測(cè)器對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。微型化凝膠電泳板：在電場(chǎng)作用下，樣品中的蛋白質(zhì)通過芯片上的孔道分離開來，經(jīng)噴霧直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，以確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量及種類。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按點(diǎn)樣蛋白質(zhì)有無活性功能分為無活性和有活性的芯片。v無活性的芯片是將已經(jīng)合成好的蛋白

35、質(zhì)點(diǎn)在芯片上v有活性的芯片則是指點(diǎn)在芯片上的樣品是活的生物體（如細(xì)菌），在芯片上原位表達(dá)蛋白質(zhì)?；钚孕酒梢蕴峁┠M的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，對(duì)于分析蛋白質(zhì)功能有利。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按作用分為蛋白質(zhì)表達(dá)芯片(Protein expression chip,PEC)和蛋白質(zhì)功能芯片(Protein function chip,PFC)vPEC能通過觀察在不同條件下蛋白質(zhì)表達(dá)以及表達(dá)的水平而獲得此基因表達(dá)的詳細(xì)信息v而PFC則能分析眾多蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按樣品結(jié)合方式分為化學(xué)型和生物化學(xué)型。v化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片是通過介質(zhì)的疏水力、靜電力、共價(jià)鍵等，利用反相層析、離子

36、交換層析、金屬螯合層析等結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)，然后經(jīng)特定的洗脫液除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，而保留感興趣的蛋白質(zhì)，這種芯片特異性較差。v生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片則是指把生物活性分子（如抗體、受體、配體等）通過生化反應(yīng)結(jié)合到芯片表面，用于捕獲樣品中的靶蛋白。v由于生物化學(xué)型芯片具有高度的特異性及生物活性分子的多樣性，其應(yīng)用范圍和前景明顯優(yōu)于化學(xué)型蛋白芯片。二、蛋白質(zhì)芯片的制作和檢測(cè)基本流程二、蛋白質(zhì)芯片的制作和檢測(cè)基本流程v1.制備抗體文庫 利用噬菌體展示等技術(shù)制備v2.選擇固相載體片基 常用的載體片基材質(zhì)有硅、云母、各種膜片等。特定處理后承載吸附有關(guān)的生物活性分子。v3.制備探針蛋白質(zhì)及點(diǎn)樣v4.制備待檢樣品、

37、標(biāo)記及與芯片進(jìn)行抗原抗體反應(yīng) v5.蛋白質(zhì)的檢測(cè) v基質(zhì)輔助的激光解吸附電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)v表面加強(qiáng)激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)v基質(zhì)輔助的激光解吸附電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)v原理：利用激光脈沖輻射使芯池中的待分析樣品解離形成荷電離子，由于具有不同質(zhì)荷比，這些離子在儀器場(chǎng)中飛行的時(shí)間長(zhǎng)短不一，由此繪制出一張質(zhì)譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理得到模擬譜圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。v特點(diǎn)：快速、敏感，特異性高，同時(shí)不會(huì)破壞所測(cè)定的蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測(cè)的基本流程二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測(cè)的基本流程FBMSCFBVEGFIL6MIP-

38、1b IGF-1HGFosteoprotegrinPosNeg蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片Antibody-based protein array由于蛋白數(shù)目極其龐大(200000),利用蛋白質(zhì)芯片建立蛋白高通量檢測(cè)技術(shù)去研究在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律,其將會(huì)使生命科學(xué)的研究進(jìn)行另一次飛躍。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):v高效率:同時(shí)檢測(cè)成千個(gè)蛋白v敏感性高缺點(diǎn):v制作復(fù)雜,成本較高 v現(xiàn)行沒有令人滿意蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)三、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用三、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用1.在基礎(chǔ)研究中的作用在基礎(chǔ)研究中的作用抗原抗原-抗體相互作用、蛋白質(zhì)抗體相互作用、蛋白質(zhì)-

39、蛋白質(zhì)相互作用、酶蛋白質(zhì)相互作用、酶-底物底物相互作用、配體相互作用、配體-受體相互作用、高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)篩受體相互作用、高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)篩選及檢測(cè)翻譯后修飾等選及檢測(cè)翻譯后修飾等 2.在臨床研究中的作用在臨床研究中的作用u發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物作為臨床診斷的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物作為臨床診斷的指標(biāo)u（正常人群和疾病人群蛋白表達(dá)譜的比較）（正常人群和疾病人群蛋白表達(dá)譜的比較）u對(duì)疾病病理分子機(jī)制的研究對(duì)疾病病理分子機(jī)制的研究u篩選藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新藥物，研究藥理學(xué)篩選藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新藥物，研究藥理學(xué)三、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用三、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用v芯片實(shí)驗(yàn)室是將樣品制備、生化反應(yīng)和檢測(cè)分析的全過程集約化

40、，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)（micro total analysis system,-TAS）,或稱“縮微芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-a-chip）。芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室一、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)一、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)分析全過程自動(dòng)化分析速度快所需樣品少極高的樣品并行處理能力體積小便于攜帶縮微芯片實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用新進(jìn)展vAffymitrix公司和賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院和密歇根大學(xué)的科學(xué)家們利用在微縮芯片上刻出的加熱器、泵、閥門、微量分析器、電化學(xué)檢測(cè)器以及其他光電子檢測(cè)器等，已經(jīng)先后制作出了結(jié)構(gòu)不同的微縮芯片實(shí)驗(yàn)室樣機(jī)，向人們展示了制作微縮芯片實(shí)驗(yàn)室的可能性。v在意大利，研究人

41、員利用微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)開發(fā)出一種芯片實(shí)驗(yàn)室原型，這種芯片有非常優(yōu)秀的特性，是分析DNA的理想工具v在瑞典，研究人員開發(fā)出一種納米實(shí)驗(yàn)室，能在1小時(shí)內(nèi)同時(shí)處理480種蛋白質(zhì)樣本，如縮氨酸圖、DNA排序等。v芯片實(shí)驗(yàn)室的另一應(yīng)用是制成一次性的用品，如檢驗(yàn)卡等，可以用于醫(yī)院，也可以作為消費(fèi)者用品，用途很廣泛，市場(chǎng)潛力巨大。芯片序列捕獲技術(shù)v芯片序列捕獲技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)雜交原理發(fā)展的。v即根據(jù)目標(biāo)基因組序列，設(shè)計(jì)與之完全互補(bǔ)的探針，將這些探針固定在某些支持物上（用于分離），然后打斷基因組DNA，加上接頭（用于測(cè)序）后與探針雜交，洗脫未雜交上的DNA，回收目標(biāo)DNA片段，可以直接建庫進(jìn)行DNA測(cè)

42、序。芯片序列捕獲技術(shù)v根據(jù)雜交狀態(tài)不同，芯片序列捕獲可以分為固相雜交法和液相雜交法。v固相雜交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上。v固相捕獲系統(tǒng)的試驗(yàn)流程：v1.選定目標(biāo)DNA區(qū)域，在修飾了的玻璃片基上原位合成一系列與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的探針，固定在芯片上。v2.基因組DNA片段化處理，構(gòu)建文庫。v3.DNA片段與芯片上的探針雜交。v4.清洗芯片，去除未結(jié)合序列，然后將富集后的DNA片段洗脫下來。v5.PCR擴(kuò)增捕獲的DNA片段，檢測(cè)達(dá)到質(zhì)控要求后進(jìn)行高通量測(cè)序。芯片序列捕獲技術(shù)（流程圖）芯片序列捕獲技術(shù)v液相雜交與固相雜交最大的差異在于雜交反應(yīng)的環(huán)境不同。v液相雜交是在溶液中，目標(biāo)DNA片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過生物素親和素的反應(yīng)使目標(biāo)DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上。v洗去非目標(biāo)DNA，洗脫后，富集的DNA用于測(cè)序。v液相雜交與固相雜交相比有兩大優(yōu)勢(shì)：v第一、雜交效率更高；v第二、易于操作，時(shí)間短，便于自動(dòng)化操作。芯片序列捕獲技術(shù)v主要優(yōu)點(diǎn)：v1.高效、定向地捕獲目標(biāo)區(qū)域v2.具有高均一性、高覆蓋率v3.具有高度靈活性v4.省時(shí)、省力、省成本