熒光定量PCR技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用.ppt

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1、熒光定量PCR技術(shù)在 臨床檢測中的應(yīng)用,中山大學(xué) 中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 達(dá)安基因股份有限公司首席科學(xué)家 朱振宇 醫(yī)學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師 Tel：13922430138，02037656430,九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開 1998年 熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測,1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功實(shí)驗(yàn)發(fā)明了PCR 1985 關(guān)于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 發(fā) 表 1989 12月Science雜志將PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。 19

2、93 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry,1995 Perkin Elmer 公司研制出熒光定量PCR技術(shù),循環(huán)次數(shù) DNA的鏈數(shù) 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億,PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系,PCR循環(huán),PCR特點(diǎn)：高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制,靈敏度高 快捷 簡便 對樣品純度要求低 可以相對定量,PCR反應(yīng)的特點(diǎn),Ct值的意義,Ct值與重復(fù)性 同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增,FQ-PCR,Ct值與濃度 不同的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不

3、同,感染性疾病的診斷 母嬰傳播的控制與觀察 遺傳疾病的診斷 腫瘤的診斷 法醫(yī)學(xué)鑒定,熒光定量PCR的臨床應(yīng)用,早期診斷 病情評估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo) 新藥驗(yàn)證,一 感染性疾病 1. 病原體含量與病情之間的關(guān)系 2. 病原體含量與用藥之間的關(guān)系 3. 藥物及療法的研究與開發(fā) 4. 新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn) 5. 新的愈后指標(biāo) 6. 傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防,臨床應(yīng)用,臨床應(yīng)用,二 腫瘤 1. 腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體等 2. 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因,三 遺傳病 1. 等位基因檢測 2. 多基因遺傳

4、病的突變檢測 3. 基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測,熒光定量PCR在病原體檢測中的應(yīng)用,一 肝炎病毒定量檢測 二 性病病原體檢測 三 結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測 四 優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關(guān)項(xiàng)目檢測,臨床應(yīng)用,肝炎病毒定量檢測 HBV HCV,臨床應(yīng)用,（一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn),HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志 HBsAb：保護(hù)性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復(fù)制狀態(tài) HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo) HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好,HBV,HBV,（二） HBV-DNA與“兩

5、對半”,1. “兩對半” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。,3. 血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結(jié)果解釋。,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,3. HBV-DNA定量與預(yù)后

6、a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌變的幾率明顯高于含量低者,1. HBV-DNA定量與HBV復(fù)制水平及傳染性,2. HBV-DNA定量與乙肝藥物療效 a. 專家提出103 copy /ml做為陰性或臨床治愈標(biāo)準(zhǔn) b. HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV感染與干擾素治療,治療前： a: 治療前HBV低水平復(fù)制者對干擾素的反應(yīng)性明 顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。 b: 治療前HBV DNA 含量特別高者大多沒有療效。 c: HBsAg轉(zhuǎn)陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA 含量較低者。,HBV感染與干擾素治療,治療中： a: 病毒復(fù)制水平迅速降低者，有望治

7、愈。 b: 相反，治療期間HBV DNA復(fù)制水平下降較慢， 或下降幅度較小，或者變化不明顯者，大多是 干擾素治療無效。,HBV感染與干擾素治療,治療后： a: 治療結(jié)束后，采用PCR定量法檢測，HBV DNA 103 copy/ml 者，可能不再復(fù)發(fā)。 b: 終止治療后HBV DNA 仍保持較低水平者， 反跳的可能性較大。,Poor Response to IFN Therapy,CHRONIC HEPATITIS B,拉咪呋啶： 有顯著降低高病毒載量作用，近期療效頗有優(yōu)勢，但是長期使用可導(dǎo)致HBV變異，患者易出現(xiàn)耐受性，而且容易出現(xiàn)停藥后反彈。,HBV感染與拉咪呋啶治療,拉米夫定抑制血清HB

8、V DNA,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,4. HBV-DNA定量有助于指導(dǎo)懷孕與孕期，哺乳期檢查,6. 血液制品和獻(xiàn)血員的篩選,病毒特點(diǎn)： 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（一）丙型肝炎病毒特點(diǎn),HCV,感染特點(diǎn)： HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子 免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時(shí)間不一 有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,1. 早期診斷 a. 臨床以 80 copy/ml做為無感染或治愈標(biāo)準(zhǔn)。 b. HCV感染1

9、-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 c. 嚴(yán)格篩選獻(xiàn)血員 ,提高對窗口期感染者的檢出率。 d. 醫(yī)療糾紛中的“舉證倒置”，病人入院前后進(jìn)行HCV-RNA檢測。,HCV,HCV,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,2. HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性。 抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。,3. HCV-RNA是評價(jià)抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。,4. 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時(shí)如果進(jìn)行HCV-RNA 定量檢測可以鑒別活動(dòng)性、復(fù)制程度。,二 常見性傳播疾病病原體,一 淋球菌（NGH） 二 沙眼衣原體（ CT ） 三 解脲脲原體

10、（UU） 四 梅毒螺旋體（TP） 五 單純庖疹病毒（HSV） 六 乳頭瘤病毒（HPV） 七 人類免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型,STD,艾滋病,艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文譯音，全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征”。它可以由人類免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又稱艾滋病病毒引起的疾病。當(dāng)病毒侵入人體后，經(jīng)一段時(shí)間的潛伏期，破壞人體的免疫力，從而發(fā)病，病死率高，是一種嚴(yán)重的傳染病。,艾滋病是一種有明確病原體的可通過人之間一定傳播途徑傳

11、播的慢性傳染病，屬于傳染病防治法中規(guī)定的乙類傳染病,HIV病毒：多亞型和多變異,HIV-1和HIV-2 M組、O組和N組 亞性型：A-K CRF：基因重組亞型，主要是HIV-1型 毒株亞型監(jiān)測的意義 不同亞型與不同傳播途徑的關(guān)系：B主要通過男性同性性行為和靜脈注射吸毒傳播，C主要異性性接觸傳播 流行地理和傳播線路的分析：東南亞區(qū)域的C亞型和B亞型 重組亞型傳播效力變化及對流行的影響：東歐的B/A重組流行、泰國的A/E重組,艾滋病病毒在外界的抵抗力,HIV病毒一旦離開宿主細(xì)胞在外界環(huán)境中生存能力很快消失 HIV對環(huán)境中的物理因素和化學(xué)因素抵抗力均較弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 對H

12、BV有效得消毒和滅活方法均適用于HIV,典型進(jìn)展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90% 快速進(jìn)展者：CD4細(xì)胞2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。 長期存活者（又稱長期不進(jìn)展者）：維持15年以上，而且CD4計(jì)數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,HIV感染的三種結(jié)局,艾滋病的診斷,HIV感染者：確定HIV感染的個(gè)體 抗體檢測：初篩和確認(rèn) 輔助診斷 艾滋病病人：臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)見國家標(biāo)準(zhǔn)HIV/AIDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)和防治原則 GB16000-1995,熒光定量PCR的應(yīng)用為艾滋病的初篩和輔助 檢查提供了有力的工具,NGH,淋球菌感染

13、與致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主。,2. 發(fā)病率最高，在所STD疾病中，高達(dá)60%左右。,3. 發(fā)病趨勢： a. 男性多于女性。 b. 城市走向農(nóng)村， c. 高收入階層向低收入階層擴(kuò)展,4. 人對淋球菌感染無天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母親為淋病患者，嬰兒出生時(shí)易患上淋球菌性結(jié)膜炎,CT,沙眼衣原體感染與致病,1. 嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生。,2. 不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原體。,3. 近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害 性已超過淋球菌而居STD之首。,4. 在我國，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5. 泌尿生殖道感染，妨礙妊娠。,6

14、. 盆腔感染，可致生殖能力損害。,UU,解脲脲原體感染與致病,合成尿素酶，分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原 體感染，居第二位。,3. 流產(chǎn)超過4次以上者，檢出率高達(dá)80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 與男性不育相關(guān)。男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達(dá)66.6。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動(dòng)力下降而升高。,1. 非培養(yǎng)或形態(tài)學(xué)檢查的診斷技術(shù)，快速、特異、敏感。 2. 對無癥狀或癥狀輕者，可以早期確診。 3. 對NGH、CT、UU 等混合感染者，診斷和鑒別診斷。 4. 指導(dǎo)用藥、考核療效。,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,NGH/CT/

15、UU,NGH/CT/UU,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,5. 不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。 6. 流行病學(xué)調(diào)查，為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據(jù)。 7. CT、UU是FDA批準(zhǔn)的PCR檢測試劑盒，可作為首選 方法，在臨床推廣應(yīng)用。,人乳頭瘤病毒感染與致病,1. HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多個(gè)型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等),HPV,人乳頭瘤病毒感染與致病,HPV,4. 高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、 肛門癌、口腔癌等) 5. 免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。 6.

16、 新生兒產(chǎn)道感染。,HPV,1. 對典型病例可以明確診斷。 2. 對臨床表現(xiàn)和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。 3. 對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。 4. 基因分型。 5. 考核療效與預(yù)后。 6. 病毒載量與患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。,HPV,熒光定量PCR檢測HPV的意義,HPV,手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）,為全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有流行的報(bào)道。 1957年在加拿大首次報(bào)告，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時(shí)患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病

17、病原； 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球廣泛流行，無明顯的地域分布。 之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。 發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡 傳染性極高 病程約1周,HFMD的病原,手足口病可由多種腸道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯薩 奇B組病毒, 以CoxA16 和 EV71最為常見 傳播途徑: 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便; 呼吸道傳播: 空氣飛沫; 接觸傳播 皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。 HFMD為全球性傳染病，在全球廣泛分布，無明

18、顯的地域分布, 但 近年EV71在東南亞一帶流行, 引起較多的重癥和死亡病例。 在80年代和90年代，中國手足口病的流行主要以 CoxA16為主，2008年，CoxA16 和EV71 共循環(huán)引起手 足口病爆發(fā), EV71在大部分省市為優(yōu)勢病毒。,人腸道病毒感染的一般致病機(jī)制,致病特點(diǎn),隱性感染多見，很少引起腹瀉，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。 病毒在機(jī)體腸道中增殖，很少引起腸道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染。 不同人腸道病毒可引起相同癥狀，同一種人腸道病毒可引起不同臨床表現(xiàn)。 感染過程中形成病毒血癥。,中國HFMD的流行,1981年，我國在上海首次報(bào)道了HFMD病例 1987年在中國分離到

19、CVA16 1995年以來，我國陸續(xù)在武漢、深圳、上海、重慶、山東和安徽等地的HFMD患者中分離到EV71病毒。 2007年，山東發(fā)生了手足口病爆發(fā)流行，累計(jì)報(bào)告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。實(shí)驗(yàn)室檢測發(fā)現(xiàn)EV71是引起山東臨沂HFMD的主要病原，同時(shí)還檢測到Echo3 和/或 CVA16。 2008年全國出現(xiàn)HFMD爆發(fā)流行,以HEV71為優(yōu)勢,CVA16還有其它EV共循環(huán)引起,加強(qiáng)HFMD病原檢測和監(jiān)測的十分必要,依據(jù)臺(tái)灣1998-2008和中國大陸2007-2008年的經(jīng)驗(yàn) 掌握手足口病病原譜，特別是EV71感染所占的比例，對析 判斷HFMD疫情導(dǎo)致重癥和死亡的比例有重

20、要的科學(xué)參考價(jià)值。,手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測,手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行基因檢測、抗原檢測、血清學(xué)抗體檢測、病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合格的臨床標(biāo)本，或無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。 很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細(xì)胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時(shí)期腸道病毒的流行株也不同。 通常用于腸道病毒分離的細(xì)胞系為RD、HEp-2、Vero等，聯(lián)合使用上述的兩種或更多細(xì)胞有助于分離到更多的腸道病毒。,病毒實(shí)驗(yàn)室檢測類型-病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法,檢測抗體/抗原,檢測病毒,檢測核酸,ELISA/HI/PA,蛋白印跡,病毒分離,ELISA,電鏡,中和試驗(yàn),RT-PCR,實(shí)時(shí)熒光

21、定量PCR,套式PCR,LAMP,免疫熒光,基因芯片,每種方法 各有優(yōu)勢, 依據(jù)病毒 來定檢測策略,New molecular tools for epidemiology studies and diagnosis,三 結(jié)核桿菌與呼吸道病原體檢測,TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumonia SARS：severe acute respiratory syndrome H1N1甲型流感 呼吸道合胞病毒,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（1）,羅伯特科赫（），德國細(xì)菌學(xué)家，結(jié)核桿菌發(fā)現(xiàn)者 結(jié)核病是一個(gè)全球性的問題，近年來

22、在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行，且呈增長的趨勢,TB,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（2）,我國結(jié)核病的疫情僅次于印度而居世界第二位 2000年，全國人口結(jié)核感染率為44.5%，其中1544歲人群占了53 ，每年約有25萬人死于結(jié)核病,結(jié)核桿菌引起的感染,肺部感染：原發(fā)性肺結(jié)核，開放性肺結(jié)核。 肺外感染：腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖結(jié)核、腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎、全身性結(jié)核。,常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色：陽性率低 、費(fèi)時(shí) 2. 細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(3-4W) 3. 血清學(xué)診斷： a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應(yīng)，假陽性 不能早期

23、診斷！容易漏診、誤診！,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強(qiáng) 2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結(jié)核 血液播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核病,TB,3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù),TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,CP、MP感

24、染可致咽炎、支氣管炎和肺炎，潛伏期約2-3周，通常起病較緩慢。持續(xù)性咳嗽。,肺炎衣原體(CP)、肺炎支原體(MP)感染與致病,CP/MP,MP肺炎約占非細(xì)菌性肺炎的1/3以上，或各種原因 引起的肺炎的l0。,MP感染與小兒支氣管哮喘密切相關(guān)。,CP感染與冠心病存在密切的關(guān)系,肺癌、支氣管擴(kuò)張患者中CP感染率相對較高,熒光定量PCR用于非典型性肺炎的診斷,意義：1. 直接檢測病原體，早期、快速、特異診斷非典 型性肺炎。 2. 治療方案與細(xì)菌、病毒感染的治療方案不同 3. 流行病學(xué)調(diào)查。 TB、MP、CP已被許多醫(yī)院尤其是婦幼保健醫(yī)院和兒童醫(yī)院納為肺部感染的常規(guī)檢測項(xiàng)目,MP/CP/SARS,甲型

25、H1N1流感,流行性感冒簡稱流感，是由甲、乙、丙三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感病毒根據(jù)其表面(H和N)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同又可分成許多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶9個(gè)亞型(N1-N9)。,“豬流感”更名為“甲型H1N1流感” 世界衛(wèi)生組織4月30日宣布，從當(dāng)日起，該組織不再使用“豬流感”一詞指代當(dāng)前疫情，而開始使用“A（H1N1）型流感”一詞。與之相對應(yīng)，我國的官方文件從5月1日起相繼用“甲型H1N1流感”代替原來的“人感染豬流感”。 世界衛(wèi)生組織發(fā)言人說，之所以更改叫法，是因?yàn)椤柏i流感”一詞容易誤導(dǎo)消費(fèi)者，美國和墨西哥等國的豬肉

26、及豬肉制品已明顯受到其他國家進(jìn)口禁令影響。 世界衛(wèi)生組織的聲明說，根據(jù)目前掌握的科學(xué)依據(jù)，此次流行的病毒僅在人際間傳播，尚無證據(jù)表明它在豬群內(nèi)傳播，或由豬向人傳播，也無證據(jù)表明人因食用豬肉或相關(guān)產(chǎn)品染病。,病 原 學(xué),甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80 nm120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼, 呈螺旋狀對稱, 直徑為10nm。甲型H1N1流感病毒為單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組約為13.6 kb，由大小不等的8 個(gè)獨(dú)立片段組成。,流行病學(xué)特點(diǎn),傳染源 主要為病豬和攜帶病毒的豬，

27、感染豬流感病毒的人也被證實(shí)可以傳播病毒。感染這種病毒的動(dòng)物均可傳播。 傳播途徑 主要為呼吸道傳播，也可通過接觸感染的豬或其糞便、周圍污染的環(huán)境或氣溶膠等途徑傳播。某些毒株如H1N1可在人與人之間傳播，其傳染途徑與流感類似，通常是通過感染者咳嗽或打噴嚏等。,易感人群 普遍易感?；颊叨鄶?shù)年齡在25歲至45歲之間，目前報(bào)道以青壯年為主，應(yīng)注意老人和兒童。,臨床表現(xiàn),潛伏期一般1至7天左右，較流感、禽流感潛伏期長。 人感染甲型H1N1流感后的早期癥狀與普通人流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會(huì)出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。,部分患者病情可迅速進(jìn)展，來勢兇猛

28、、突然高熱、體溫超過39，甚至繼發(fā)嚴(yán)重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細(xì)胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征、呼吸衰竭及多器官損傷，導(dǎo)致死亡。,實(shí)驗(yàn)室檢查,外周血象：白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞減少，并有血小板降低； 血清學(xué)診斷：可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等； 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：由于PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已用于豬流感病毒基因的檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查等；,4 病毒分離：從患者呼吸道標(biāo)本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織）分離甲型H1N1流感病毒。常

29、用的方法有雞胚接種法和細(xì)胞培養(yǎng)法?，F(xiàn)有的診斷方法中，病毒分離法是較敏感的，但需要2-3周時(shí)間。,人感染豬流感的診斷標(biāo)準(zhǔn),醫(yī)學(xué)觀察病例：曾到過甲型H1N1流感疫區(qū)，或與病豬及甲型H1N1流感患者有密切接觸史，1周內(nèi)出現(xiàn)流感臨床表現(xiàn)者。列為醫(yī)學(xué)觀察病例者，對其進(jìn)行7天醫(yī)學(xué)觀察（根據(jù)病情可以居家或醫(yī)院隔離）。,2 疑似病例：曾到過疫區(qū)，或與病豬及甲型H1N1流感患者有密切接觸史（也可流行病學(xué)史不詳），1周內(nèi)出現(xiàn)流感臨床表現(xiàn)，呼吸道分泌物、咽試子、痰液、血清H亞型病毒抗體陽性或核酸檢測陽性。,臨床診斷病例：被診斷為疑似病例，且與其有共同暴露史的人被診斷為確診病例者。 確診病例：從呼吸道標(biāo)本或血清中分離

30、到特定病毒；RT-PCR對上述標(biāo)本檢測，有甲型H1N1病毒RNA存在，經(jīng)過測序證實(shí)，或兩次血清抗體滴度4倍升高，可確診為人感染甲型H1N1流感。,四 TORCH感染特點(diǎn)與檢測,TOX : Toxoplasma gondii RV: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirus HSV: Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特點(diǎn),1. 母-胎傳播的主要病原體 2. 引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因 3. 自然狀態(tài)下呈隱性感染 4. 懷孕、多次輸血、AIDS等易發(fā)生顯性感染 5. 可致多發(fā)性、全身性感染 6. 只有風(fēng)疹可獲得長久的

31、免疫力，可用疫苗預(yù)防,TORCH,(一) 弓形蟲感染與致病,滋養(yǎng)體如弓形 ，廣泛分布，人獸共患。 寄生在有核細(xì)胞中，貓和貓科動(dòng)物是終宿主 易感者多，免疫者少 我國智力低下兒的弓形蟲感染率28 畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽性率12.25 艾滋病患者約有2080合并弓形蟲感染 ，造成艾滋病死亡的一個(gè)重要并發(fā)病,TORCH TOX,人群自然感染率達(dá)到60-90%，多為隱性感染 免疫功能低下(懷孕、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染 可發(fā)生垂直傳播，是宮內(nèi)感染和胎兒畸形的主要病毒之一 圍生期感染 血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可檢出病毒,(二) 人巨細(xì)胞病毒感染與致病,TORCH-CMV,風(fēng)疹是

32、一種世界性的病毒傳染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有傳染性 人是風(fēng)疹病毒的唯一宿主 風(fēng)疹感染后可獲得持久的免疫力，臨床顯性再感染并不多見。,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,TORCH-RV,先天性風(fēng)疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時(shí)，可致先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS) 三聯(lián)癥：白內(nèi)障、耳聾、心臟病。 妊娠時(shí)體內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素的增加以及細(xì)胞免疫功能的減弱，這種對正常人無害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。,TORCH-RV,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,HSV原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn) HSV-1主要引起口唇皰疹，皰疹性結(jié)膜炎、腦炎，皮膚性皰疹

33、 HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹 (80%) 。 HSV感染后大多數(shù)個(gè)體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復(fù)發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,妊娠期婦女因HSV-1被激活，可通過胎盤感染胎兒，引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。 圍產(chǎn)期感染可引發(fā)新生兒皰疹，死亡率高達(dá)50%以上。 HSV常與HIV-1同時(shí)感染，并能促進(jìn)病情發(fā)展，引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復(fù)制 與宮頸癌關(guān)系密切。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,常規(guī)TORCH檢測方法與不足,組織培養(yǎng)或病原體分離：慢，費(fèi)力，陽性率

34、低。 血清學(xué)診斷： IgG： 人群自然感染率高達(dá)60-90%。 IgG()不能區(qū)別既住感染與現(xiàn)癥感染； 新生兒IgG()不能說明有感染。 IgM： IgM()可能是原發(fā)性感染； IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性： 1. 不能定量分析 2. 抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響 3. 交叉反應(yīng)，假陽性,熒光探針檢測TORCH的優(yōu)勢,原理：直接檢測TORCH病原體的核酸 優(yōu)點(diǎn)：靈敏、快速，特異 意義：早期診斷，婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育 1. 篩選TORCH患者，提高出生人口素質(zhì)。 2. 有利于預(yù)測胎兒宮內(nèi)感染狀況及妊娠結(jié)局。 3. TORCH感染孕婦的治療效果觀察。 4. 器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人

35、監(jiān)控。 5. 建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn),TORCH,TORCH,TORCH檢測核酸與檢測標(biāo)本的比較,檢驗(yàn)報(bào)告單結(jié)果讀取,3.637E+06 檢測下限: 1000拷貝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是標(biāo)本量是可以定量的，如血液、腦脊液等，則檢測結(jié)果報(bào)告為：copy/ml 如果是標(biāo)本量不能定量，如分泌物等，則結(jié)果只能報(bào)告為：copy,1.親子鑒定 2.法醫(yī)物證 3.PCR-RFLP技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用 4.罪犯鑒定,法醫(yī)鑒定,免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷；PCR

36、方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。,疾病的早期診斷,1 乙型肝炎病毒（HBV）; 2. 丙型肝炎病毒（HCV） 3 淋球菌(NGH); 4 人類免疫缺陷病毒（HIV） 5 解脲脲原體(UU) 6 肺炎支原體(MP) 7 單純皰疹I(lǐng)I型 8 人巨細(xì)胞病毒（HCMV） 9 人乳頭瘤病毒（HPV）6、11 10 高危型人乳頭瘤病毒（HPV 8個(gè)型） 11 沙眼衣原體(CT) 12 a-地中海貧血 13 結(jié)核分支桿菌(TB) 14 新型冠狀病毒(SARS),已獲證書,熒光定量PCR技術(shù)中國專利 國家重點(diǎn)新產(chǎn)品 多種熒光PCR試劑盒新藥證書 多項(xiàng)國家、省部級等科技進(jìn)步獎(jiǎng) 三十余項(xiàng)國家、省部級重點(diǎn)科研項(xiàng)目 業(yè)務(wù)遍布全國1026家醫(yī)療衛(wèi)生單位,達(dá)安烙印,