生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第21章 基因工程(用）

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1、 第第 21 21 章章 基基 因因 工工 程程genetic engineering第一節(jié)第一節(jié) 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆的載體基因克隆的載體第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的一般過程基因克隆的一般過程第四節(jié)第四節(jié) 克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá)第五節(jié)第五節(jié) 基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用( (簡介簡介) )本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容將編碼將編碼 基因工程概述基因工程概述 基因工程誕生的歷史背景：基因工程誕生的歷史背景：1. 19441. 1944年年 Oswald T.AveryOswald T.Avery等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化證明等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化證明

2、了了DNA是遺傳信息攜帶者。是遺傳信息攜帶者。2. 19532. 1953年年 James WatsonJames Watson和和Francis Crick Francis Crick 兩人提兩人提 出了出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自 我復(fù)制的機制。我復(fù)制的機制。3. 1961-19653. 1961-1965年年, ,科學(xué)家破譯了生物界全部科學(xué)家破譯了生物界全部6464個遺個遺 傳密碼傳密碼, ,發(fā)表了劃時代的遺傳密碼字典，提出了發(fā)表了劃時代的遺傳密碼字典，提出了 遺傳信息由遺傳信息由DNARNA蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。4

3、. 19704. 1970年年發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，豐富了中心法則，為發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，豐富了中心法則，為 cDNA的制備奠定了基礎(chǔ)。的制備奠定了基礎(chǔ)。5.5. 染色體外染色體外DNA-質(zhì)粒的深入研究，為第一批質(zhì)粒的深入研究，為第一批重組重組DNA載體提供了材料。載體提供了材料。6. 1968-19706. 1968-1970年年，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和純化，為，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和純化，為DNADNA的體外重組提供了有力的工具。的體外重組提供了有力的工具。1978年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎Hamilton O. SmithR.Yuan7. 19727. 1972年年，Berg.DBerg.D等人首次

4、用限制性內(nèi)切酶等人首次用限制性內(nèi)切酶 EcoRI切割噬菌體和切割噬菌體和SV40病毒病毒DNA分子，將這分子，將這 兩種不同來源的兩種不同來源的DNA片段成功地在體外連接成片段成功地在體外連接成 雜合雜合DNA分子。分子。1972年重組出第一個人工年重組出第一個人工DNA分子（分子（SV40-），使），使其在大腸桿菌中成功表達(dá)，其在大腸桿菌中成功表達(dá)，被譽為被譽為“重組重組DNA技術(shù)之技術(shù)之父父”，榮獲，榮獲1980年諾貝爾年諾貝爾化學(xué)獎化學(xué)獎 P. Berg8. 8. 19731973年年用重組用重組DNA技術(shù)改變生物學(xué)性狀的技術(shù)改變生物學(xué)性狀的 嘗試在由嘗試在由Cohen等人完成。從此等人

5、完成。從此, ,這項技術(shù)這項技術(shù) 為生物學(xué)帶來了一場深刻的革命，這類技為生物學(xué)帶來了一場深刻的革命，這類技 術(shù)本身也迅速地發(fā)展起來術(shù)本身也迅速地發(fā)展起來, ,并廣泛地滲透到并廣泛地滲透到 各個學(xué)科的研究領(lǐng)域。各個學(xué)科的研究領(lǐng)域。 1973 1973年，年，Stanley Cohen Stanley Cohen 等等將體外獲得的重組基因（將體外獲得的重組基因（四環(huán)四環(huán)素抗性素抗性和和新霉素抗性新霉素抗性）導(dǎo)入大）導(dǎo)入大腸桿菌并成功擴增。腸桿菌并成功擴增。 宣告宣告基因工程基因工程誕生誕生S. Cohen轉(zhuǎn)基因動物和植物轉(zhuǎn)基因動物和植物19941994年能比普通西紅柿保鮮時間更長的轉(zhuǎn)基因西紅年能比

6、普通西紅柿保鮮時間更長的轉(zhuǎn)基因西紅柿投放市場柿投放市場19961996年轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆相繼投入商品生產(chǎn)年轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆相繼投入商品生產(chǎn)到到19961996年全世界已有年全世界已有250250萬公頃土地種植轉(zhuǎn)基因植物萬公頃土地種植轉(zhuǎn)基因植物 抗蟲害的玉米抗蟲害的玉米轉(zhuǎn)基因鮭魚轉(zhuǎn)基因鮭魚 在在自然界，自然界，生物體生物體中的中的DNA序列可發(fā)生多序列可發(fā)生多種形式的種形式的重新組合重新組合。這。這些重新組合導(dǎo)致基因的些重新組合導(dǎo)致基因的新的連鎖關(guān)系新的連鎖關(guān)系或基因內(nèi)或基因內(nèi)可變量的最小單位新的可變量的最小單位新的連鎖關(guān)系的形成，稱為連鎖關(guān)系的形成，稱為基因重組基因重組?；蛑亟M基

7、因重組genetic recombination 將一種生物的將一種生物的基因基因與與載體分子載體分子在體外進(jìn)行在體外進(jìn)行拼接重組，轉(zhuǎn)入另一生拼接重組，轉(zhuǎn)入另一生物體細(xì)胞內(nèi)使之?dāng)U增物體細(xì)胞內(nèi)使之?dāng)U增(或或)并表達(dá)新的性狀。并表達(dá)新的性狀。又稱又稱DNA重組技術(shù)或基重組技術(shù)或基因克隆或分子克隆。因克隆或分子克隆?；蚬こ袒蚬こ蘥enetic engineering目的基因、目的基因、載體載體、受體細(xì)胞受體細(xì)胞是重組技術(shù)的三大基本元件。是重組技術(shù)的三大基本元件。基因工程基因工程genetic engineering包括兩大部分包括兩大部分上游技術(shù)上游技術(shù): 外源基因的克隆、重組、表達(dá)的設(shè)計外源基

8、因的克隆、重組、表達(dá)的設(shè)計 與構(gòu)建（即狹義的重組與構(gòu)建（即狹義的重組DNA技術(shù)）技術(shù)）下游技術(shù)下游技術(shù): 含外源基因的重組菌或細(xì)胞的大規(guī)模含外源基因的重組菌或細(xì)胞的大規(guī)模 培養(yǎng)以及外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純培養(yǎng)以及外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純 化工藝?；に嚒?基因工程的基因工程的目的目的* * ： 1 1、擴增獲得某一感興趣的基因或、擴增獲得某一感興趣的基因或DNA序列序列 2 2、獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物、獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物( (蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)) ) 操作操作特點特點* *： 分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)基因工程的概念基因工程的概念* ： 將一種生物的基因與載體分子在

9、體外進(jìn)行將一種生物的基因與載體分子在體外進(jìn)行拼接重組后，轉(zhuǎn)入另一生物體（受體）細(xì)胞內(nèi)拼接重組后，轉(zhuǎn)入另一生物體（受體）細(xì)胞內(nèi)使之?dāng)U增使之?dāng)U增(或或)表達(dá)的工作過程。表達(dá)的工作過程。n 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶n T4DNA連接酶連接酶n 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶n DNA聚合酶聚合酶n 堿性磷酸酶堿性磷酸酶n 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶必備必備! ! 第一節(jié)第一節(jié) 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶* * （restriction endonuclease） 一類能一類能識別識別雙鏈雙鏈DNADNA分子內(nèi)部的分子內(nèi)部的特異序列特異序

10、列，并在并在識別位點或其周圍識別位點或其周圍產(chǎn)生產(chǎn)生切割切割作用的作用的核酸水解酶核酸水解酶。 存在于多種存在于多種細(xì)菌細(xì)菌中，與相伴的中，與相伴的甲基化酶甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的共同構(gòu)成細(xì)菌的“限制限制- -修飾修飾”系統(tǒng)系統(tǒng)，因而保護(hù)了細(xì)菌自身的，因而保護(hù)了細(xì)菌自身的DNADNA，分解外來，分解外來的的DNA,DNA,維持細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳。維持細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳。（一）概（一）概 念念基因工程的手術(shù)刀基因工程的手術(shù)刀 ( (二二) ) 分類分類 I類限制性核酸內(nèi)切酶：類限制性核酸內(nèi)切酶：分子量大，識別位點復(fù)雜，特異性差分子量大，識別位點復(fù)雜，特異性差類限制性核酸內(nèi)切酶類限制性核酸內(nèi)

11、切酶* ：分子量小，分子量小，識別位點與切識別位點與切割位點特異、固定，切割作用發(fā)生在識別位點或周圍。割位點特異、固定，切割作用發(fā)生在識別位點或周圍。是是重組重組DNA技術(shù)必備酶技術(shù)必備酶。類限制性核酸內(nèi)切酶類限制性核酸內(nèi)切酶 ：分子量大，分子量大，特異性差特異性差根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)、所需因子及切割根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)、所需因子及切割DNA方式的不同方式的不同可分為可分為 I、II、III類類類類限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶* *: :是識別是識別DNA的特的特異序列異序列, , 并在識別位點內(nèi)切割雙鏈并在識別位點內(nèi)切割雙鏈DNA的一的一類內(nèi)切酶。類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

12、 GBam H第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。(三三) 命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶（四）（四）類酶識別序列特點類酶識別序列特點回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCC

13、TAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口(鈍性末端鈍性末端)(粘性末端粘性末端)（五）切割方式：垂直切割（五）切割方式：垂直切割平端切口平端切口 錯位切割錯位切割粘端切口粘端切口 5 GAATT C3 3 C TTAAG5EcoR I5 G AATTC3 3 CTTAA G 55 5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端3 3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端5 C TGCAG3 3 GACGT C5Pst I5 CTGCA G3 3 G ACGTC 5來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同

14、功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為稱為同尾酶同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為這兩個相同的粘性末端稱為配配伍末端伍末端(compatible end)(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶二、二、DNA連接酶（

15、連接酶（DNA ligase） 一種封閉一種封閉DNA鏈上缺口的酶，催化鏈上缺口的酶，催化DNA中相鄰的中相鄰的55磷酸基和磷酸基和33羥基末端形成磷酸二酯鍵。羥基末端形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌大腸桿菌DNA連接連接酶：酶：連接雙鏈連接雙鏈DNA 上的單鏈間隙。上的單鏈間隙。T4連接酶：連接酶：連接連接雙鏈雙鏈DNA分子的粘性分子的粘性末端或平末端。末端或平末端。 重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活活 性性 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNA T4 DNA連接酶連接酶 催化催化DNA 5 -磷酸與磷酸與3 3 - -羥基羥基 形成磷酸二酯鍵形成磷酸

16、二酯鍵 DNA聚合酶聚合酶 以以DNA為模板合成為模板合成DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 以以RNA為模板合成為模板合成DNA 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 催化催化3-3-端合成同聚物端合成同聚物 第二節(jié)第二節(jié) 基基 因因 克克 隆隆 的的 載載 體體一、載體一、載體* *：是將外源是將外源DNA(目的目的DNA)片斷引片斷引入宿主細(xì)胞的運載工具，其化學(xué)本質(zhì)為入宿主細(xì)胞的運載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA 。 二、常用載體二、常用載體* *： 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 噬菌體噬菌體DNA 病毒病毒DNA天然天然質(zhì)粒、噬菌體、病毒質(zhì)粒、噬菌體、病毒需經(jīng)人工改造才可用作載體需經(jīng)人

17、工改造才可用作載體 能穩(wěn)定自主復(fù)制，有較高拷貝數(shù)；能穩(wěn)定自主復(fù)制，有較高拷貝數(shù)； 具有多個限制性內(nèi)切具有多個限制性內(nèi)切酶的酶的單一位點，稱為多克隆單一位點，稱為多克隆位點，易于外源位點，易于外源DNA插入點，插入點， 具有某些易檢測的遺傳標(biāo)記物，用于重組體的篩具有某些易檢測的遺傳標(biāo)記物，用于重組體的篩選和鑒定；選和鑒定； 分子量小，允許插入外源分子量小，允許插入外源DNA的容量較大。的容量較大。三、載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)三、載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)* 克隆載體克隆載體(cloning vector)(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列序列被擴增被擴增而特意而特意設(shè)計的載體稱為設(shè)

18、計的載體稱為克隆載體克隆載體。 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector)(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可序列可轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯成成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。四、基因載體的分類四、基因載體的分類（一）（一） 質(zhì)粒質(zhì)粒 ( (plasmid) )： 是存在于是存在于細(xì)菌細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀狀DNA分子。分子。 基因工程質(zhì)粒有三個要素基因工程質(zhì)粒有三個要素:多克隆位點多克隆位點選擇性基因選擇性基因復(fù)制起點復(fù)制起點 具有具有能夠能夠啟動啟動DNA復(fù)制的

19、復(fù)制的復(fù)制起點；復(fù)制起點； 具有具有能夠能夠插入插入外源性目的外源性目的DNA的的多克隆位點；多克隆位點； 具有具有能夠能夠提供選擇特性提供選擇特性的的選選擇性基因擇性基因，如抗生素基因如抗生素基因( (能夠能夠編碼分解抗生素的蛋白質(zhì)編碼分解抗生素的蛋白質(zhì)) )，使，使得宿主細(xì)胞能夠在特殊環(huán)境下得宿主細(xì)胞能夠在特殊環(huán)境下生存。生存。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： 優(yōu)點：優(yōu)點： 分子量小分子量小 易提取，易提取， 有耐藥性標(biāo)志有耐藥性標(biāo)志 易導(dǎo)入宿主易導(dǎo)入宿主缺點：缺點： 插入的外源基因不超過插入的外源基因不超過10kbpBR32質(zhì)粒、質(zhì)粒、pUC系列等系列等 pBR32222質(zhì)粒質(zhì)粒1.43

20、63 bp1.4363 bp2.2.含一個復(fù)制點含一個復(fù)制點3.3.含一個含一個抗氨卞青霉素抗氨卞青霉素標(biāo)標(biāo) 記記( (ampampR R) )4.4.一個一個抗四環(huán)素標(biāo)記抗四環(huán)素標(biāo)記 ( (tettetR R) )5.5.ampampR R和和tettetR R基因內(nèi)各有一些基因內(nèi)各有一些 限制酶的酶切位點，供外源限制酶的酶切位點，供外源 基因插入基因插入6.6.當(dāng)外源基因插入抗藥基因位當(dāng)外源基因插入抗藥基因位 點時，相應(yīng)的基因失活點時，相應(yīng)的基因失活pUC系列質(zhì)粒系列質(zhì)粒 由由pBR322322和和M1313噬菌體構(gòu)建噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；而成的雙鏈質(zhì)粒載體；1 1、2674bp2

21、674bp；2 2、有、有ampr和與和與M1313噬菌體噬菌體 相同的多克隆位點相同的多克隆位點3 3、有一個來自大腸桿菌的、有一個來自大腸桿菌的 LacZ操縱子的操縱子的DNA片斷片斷, , 編碼半乳糖苷酶編碼半乳糖苷酶常用的種類：常用的種類：噬菌體噬菌體DNADNA； M13噬菌體噬菌體DNA （二（二) ) 噬菌體噬菌體(phage)(phage) 噬菌體是一類感染細(xì)菌的病毒，噬菌體是一類感染細(xì)菌的病毒，感染時通過尾管將基因組感染時通過尾管將基因組DNA注入細(xì)菌。注入細(xì)菌。 噬菌體（噬菌體（lambdla bacteriophage）n組成特點：組成特點： 雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA

22、分子，全長分子，全長50kb50kb； 含含6565個基因；個基因； 在其分子兩端各含有在其分子兩端各含有1212個堿基的互補單鏈，是天個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為然的粘性末端，被稱為COSCOS位點。位點。 當(dāng)噬菌體侵入宿主細(xì)胞，兩個粘性末端互補結(jié)合，當(dāng)噬菌體侵入宿主細(xì)胞，兩個粘性末端互補結(jié)合，形成環(huán)狀分子。形成環(huán)狀分子。DNADNA在體外可包裝成病毒顆粒，并在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。高效感染大腸桿菌。 生長方式有生長方式有: :裂解生長裂解生長( (最終裂解宿主菌最終裂解宿主菌) ) 溶源生長溶源生長( (最終不裂解宿主菌最終不裂解宿主菌) )裂解裂解生長途

23、徑生長途徑噬菌體感染宿噬菌體感染宿主有主有兩種結(jié)局兩種結(jié)局：溶源生長途徑溶源生長途徑噬菌體噬菌體（phage）是感染細(xì)菌、真菌、放是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物線菌或螺旋體等微生物的的細(xì)菌病毒細(xì)菌病毒的總稱的總稱 經(jīng)改造的經(jīng)改造的噬菌體衍生載體可分兩類噬菌體衍生載體可分兩類: : 插入型載體插入型載體: :將外來序列插入中間區(qū)域?qū)⑼鈦硇蛄胁迦胫虚g區(qū)域 置換型載體置換型載體: :外來序列取代中間區(qū)域外來序列取代中間區(qū)域（三）病毒載體（三）病毒載體: : 去除致病性去除致病性, ,保留感染性保留感染性, ,能把基因引入到真能把基因引入到真核細(xì)胞中，并在其中被表達(dá)。目前常用的病毒核細(xì)胞中，

24、并在其中被表達(dá)。目前常用的病毒載體有載體有: : 猿猴空泡病毒載體猿猴空泡病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺病毒載體腺病毒載體 腺相關(guān)病毒載體腺相關(guān)病毒載體 第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的一般過程基因克隆的一般過程目的基因的獲取目的基因的獲取克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接重組重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌(細(xì)胞細(xì)胞)重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的擴增克隆基因的擴增(表達(dá)表達(dá))基因克隆的一般過程基因克隆的一般過程* 一、目的基因的獲?。ǚ郑┮弧⒛康幕虻墨@?。ǚ郑┠康幕蚰康幕?是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表是指所要研究或應(yīng)用

25、的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。達(dá)的基因。目的基因來源目的基因來源 1. 1. 化學(xué)合成法化學(xué)合成法2. 2. 基因組基因組DNA文庫文庫 ( (genomic DNA library) )3. 3. cDNA文庫文庫 (cDNA library) )4. 4. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)( ( PCR )1.1.化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。 一般用于小分子基因的合成一般用于小分子基因的合成; ;分段合成后分段合成后再連接再連接基因組基因組DNA文庫（文庫（genomic D

26、NA librarygenomic DNA library）將某一基因組將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體斷后，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組帶的所有基因組DNA的集合的集合稱為稱為G文庫文庫2.2.從基因組從基因組DNA文庫中獲得目的基因文庫中獲得目的基因組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫: :： 存在于

27、轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基隆載體所攜帶的所有基因組因組DNA的集合。的集合。 以某種真核細(xì)胞的全部以某種真核細(xì)胞的全部mRNA為模為模板，利用板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的互補的DNA（cDNA）再復(fù)制成雙鏈再復(fù)制成雙鏈cDNAcDNA, ,與適與適當(dāng)?shù)妮d體連接后當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因全部表達(dá)基因的種群，稱為的種群，稱為C-C-文庫文庫(cDNA(cDNA library)library)。C-C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。文庫具有組織細(xì)胞特異性。3.3.從從cDNA文庫中獲得目的基因文庫中獲得目的基因組

28、織或培養(yǎng)細(xì)胞組織或培養(yǎng)細(xì)胞載載 體體mRNAcDNAcDNA與載體連接與載體連接導(dǎo)入大腸桿菌導(dǎo)入大腸桿菌鑒定鑒定cDNA文庫的克隆數(shù)與特征文庫的克隆數(shù)與特征 在在模板模板DNA、引物、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、聚合酶、Mg 2+2+等條件下，體外經(jīng)等條件下，體外經(jīng)變性變性、退退火火及及延伸延伸3 3個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2525 3030次次），擴增目的基因。），擴增目的基因。 4. 4. 利用利用PCRPCR合成合成目的基因目的基因 如已知目的基因兩端的序列，則可采如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，在體外）技術(shù)，在體

29、外合成目的基因。合成目的基因。DNADNA模板模板變性變性 模板與引物模板與引物退火退火primers 引物引物延伸延伸Taq 酶酶dNTPS二、克隆載體的選擇與制備（二、克隆載體的選擇與制備（分分） 根據(jù)目的與需要選擇合適的載體根據(jù)目的與需要選擇合適的載體三、選用合適限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割（三、選用合適限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割（切切） 切割后的結(jié)果：粘切割后的結(jié)果：粘粘粘 平平平平 粘粘平平選擇載體的依據(jù)：選擇載體的依據(jù)：1. 克隆的目的克隆的目的2. 內(nèi)切酶位點是否合適內(nèi)切酶位點是否合適3. 相應(yīng)的宿主細(xì)胞相應(yīng)的宿主細(xì)胞有眾多人工構(gòu)建的載體可選有眾多人工構(gòu)建的載體可選 四、四、 目的基因與載體的

30、連接（目的基因與載體的連接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4種連接方式）種連接方式） 1) 1) 粘性末端連接粘性末端連接* * 2 2） 平頭末端連接平頭末端連接 3 3） 人工接頭法人工接頭法 4 4） 同源多聚尾連接法同源多聚尾連接法1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式方式：(1)(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接 (2)(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接 配伍末端連接配伍末端連接 非配伍末端連接非配伍末端連接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割

31、切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自連目的基因自連載體自連載體自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTC

32、GGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。2. 2. 平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平 端粘端補齊或切平形成的平端端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶

33、15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連3. 3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在在末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase(terminal transferase) )的的作用下，在作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5 -核酸外切酶

34、核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R 受體菌條件受體菌條件 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷 處于

35、感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)五、重組五、重組DNADNA的導(dǎo)入的導(dǎo)入( (轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)) )感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation） 將以將以質(zhì)粒質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入細(xì)菌的過程。作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入細(xì)菌的過程。轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfection） 將重組將重組DNA體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。感染（感染（infectio

36、n） 噬菌體和真核細(xì)胞病毒為載體的重組噬菌體和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖的過程。感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖的過程。 由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程也由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程也稱為稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。）。重組重組DNA導(dǎo)入的方法導(dǎo)入的方法: 化學(xué)法化學(xué)法: 氯化鈣轉(zhuǎn)化法氯化鈣轉(zhuǎn)化法 DNA-磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法物理法物理法: 電穿孔法電穿孔法 顯微注射法顯微注射法 生物法

37、生物法: 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒細(xì)細(xì) 菌菌(CaCl2處理）處理）細(xì)細(xì) 菌菌(CaCl2處理）處理）質(zhì)粒導(dǎo)入未成功質(zhì)粒導(dǎo)入未成功質(zhì)粒導(dǎo)入成功質(zhì)粒導(dǎo)入成功 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程中過程中, ,首先要將首先要將對數(shù)生長期對數(shù)生長期的細(xì)菌用的細(xì)菌用冷冷(4)(4)CaClCaCl2 2處理處理, ,改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌處于容易吸收外源菌處于容易吸收外源DNADNA的狀態(tài)的狀態(tài)感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。然后然后, ,在在4242進(jìn)行熱沖擊進(jìn)行熱沖擊(90(90秒秒),),將將質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)菌內(nèi). .但不是所有的細(xì)菌中都能同時成功地導(dǎo)入但不是所有的細(xì)菌中都能同時成功地導(dǎo)入質(zhì)粒質(zhì)粒.

38、.因此產(chǎn)生兩種狀態(tài)的細(xì)菌：因此產(chǎn)生兩種狀態(tài)的細(xì)菌：含有質(zhì)粒含有質(zhì)粒的細(xì)的細(xì)菌和菌和不含有質(zhì)粒不含有質(zhì)粒的細(xì)菌。的細(xì)菌。六、重組體的篩選六、重組體的篩選( (篩篩) ) 1. 1. 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法針對表型改變的篩選方法針對表型改變的篩選方法 (1)(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇 (2) (2) 標(biāo)志補救標(biāo)志補救(marker rescue)(marker rescue)2. 2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法針對表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計的方法針對表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計的方法 如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等3. 3. 分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法直接檢測目的基因直接檢測目的基因

39、 如如: :核酸分子雜交、核酸分子雜交、DNADNA測序、測序、PCRPCR等等( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇 互補互補( -complementation)載體載體lacZ編碼編碼 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N端端片段片段宿主菌宿主菌lacZ編碼編碼 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端片段片段均均無無活活性性 宿主菌與載體共表達(dá)兩個片段，在宿主細(xì)胞內(nèi)形成具有宿主菌與載體共表達(dá)兩個片段，在宿主細(xì)胞內(nèi)形成具有 - -半半 乳糖苷酶活性乳糖苷酶活性的蛋白。的蛋白。 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可使可使特異性作用物（特異性作用物（X-gal）變成）變成藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物遺

40、傳標(biāo)志補救遺傳標(biāo)志補救(marker rescue)空載空載 + 宿主菌宿主菌 + X-gal + IPTG重組體重組體 + 宿主菌宿主菌 + X-gal + IPTG藍(lán)白斑藍(lán)白斑實驗實驗 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶不表達(dá)不表達(dá) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶特異作用特異作用5-嗅嗅-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -半乳糖苷半乳糖苷 （X-gal，無色），無色）（在含（在含X-gal培養(yǎng)基中）培養(yǎng)基中）ClBrClBrONNO藍(lán)色菌落藍(lán)色菌落白色菌落 互補的檢測互補的檢測標(biāo)志補救標(biāo)志補救原原位位雜雜交交Southern印跡印跡重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病

41、毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交重組重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 小小 結(jié)結(jié)* *分分分離目的基因、選擇載體分離目的基因、選擇載體 切切限制酶切割目的基因與載體限制酶切割目的基因與載體接接連接酶連接連接酶連接成重組體成重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組體轉(zhuǎn)入受體菌或細(xì)胞重組體轉(zhuǎn)入受體菌或細(xì)胞 篩篩篩選

42、含有重組體的受體菌篩選含有重組體的受體菌 擴擴擴增（表達(dá)）目的基因擴增（表達(dá)）目的基因 基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。 得到了克隆的基因或得到了克隆的基因或cDNA后，按照正確的方后，按照正確的方向插入表達(dá)載體，連在啟動子的后面，導(dǎo)入相應(yīng)向插入表達(dá)載體，連在啟動子的后面，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，即可進(jìn)行表達(dá)。的宿主細(xì)胞，即可進(jìn)行表達(dá)。 在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)方式不盡相同。在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)方式不盡相同。第四節(jié)第四節(jié) 克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá)一、原核表達(dá)體系一、原核表

43、達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志 強啟動子強啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點E.coli表達(dá)體系的不足表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 很難表達(dá)大量可溶性蛋白很難表達(dá)大量可溶性蛋白二、真核表達(dá)體系二、真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、哺乳類動物細(xì)胞酵母、昆蟲、哺乳類動物細(xì)胞優(yōu)點：優(yōu)點： 具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復(fù)性具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復(fù)性 可表達(dá)克隆可表達(dá)克隆cDNA及真核基因組及真核基因

44、組DNA 可適當(dāng)表達(dá)修飾蛋白質(zhì)可適當(dāng)表達(dá)修飾蛋白質(zhì) 表達(dá)分泌型蛋白，有利于下游操作表達(dá)分泌型蛋白，有利于下游操作 蛋白質(zhì)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞影響不大蛋白質(zhì)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞影響不大缺點：缺點：操作技術(shù)難、費時、不經(jīng)濟(jì)。操作技術(shù)難、費時、不經(jīng)濟(jì)。 （基因轉(zhuǎn)移困難，整合位置和拷貝數(shù)難控（基因轉(zhuǎn)移困難，整合位置和拷貝數(shù)難控 制，表達(dá)水平低）制，表達(dá)水平低）基因克隆的基本步驟基因克隆的基本步驟粘性末端粘性末端質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接( (連接連接) )連接后的重組連接后的重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子分子重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒目的基因目的

45、基因大腸桿菌大腸桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)( (轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化) )染色體染色體真好玩!篩篩(篩選篩選)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培養(yǎng)基含抗生素的培養(yǎng)基還活著還活著!玩完啦玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌大量生長大量生長提取大量提取大量質(zhì)粒質(zhì)粒酶酶切切鑒定鑒定 您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！n分分離目的基因和載體離目的基因和載體DNA。n用合適的酶用合適的酶切切割上述兩者，割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。產(chǎn)生匹配的末端。n連連接接酶將目的基因裝入載體。酶將目的基因裝入載體。n轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，如入宿主細(xì)胞，如: :細(xì)菌。細(xì)菌。n篩篩選陽性克隆。選陽性克隆。n擴擴增（表達(dá)）目

46、的基因增（表達(dá)）目的基因（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克?。ㄒ唬┘膊』虻陌l(fā)現(xiàn)與克隆（二）生物制藥（二）生物制藥（三）基因診斷（三）基因診斷（四）基因治療：遺傳病與腫瘤（四）基因治療：遺傳病與腫瘤（五）遺傳病的預(yù)防（五）遺傳病的預(yù)防基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用( (簡介簡介) )胰島素從豬、牛等動物的胰胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。格之高可想而知。將合成的胰島素將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，基因?qū)氪竽c桿菌，每每2000L2000L培養(yǎng)

47、液就能培養(yǎng)液就能產(chǎn)生產(chǎn)生100g100g胰島素！使胰島素！使其價格降低了其價格降低了30%-30%-50%!50%!例：轉(zhuǎn)基因小鼠的制備例：轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 重組基因重組基因DNA 顯微注射顯微注射 （體外）小鼠受精卵（體外）小鼠受精卵 回植假孕母鼠回植假孕母鼠 仔鼠的鑒定仔鼠的鑒定 動物模型：轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型：轉(zhuǎn)基因小鼠 ( (每個鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳每個鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳) ) 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因

48、子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化刺激細(xì)胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂預(yù)防霍亂