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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,*,PCR的發(fā)明、原理及應(yīng)用,PCR的發(fā)明,Kary B.Mullis，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA 的想法,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)于1953年發(fā)現(xiàn),第一個(gè)細(xì)胞內(nèi)用來復(fù)制DNA所需的聚合酶于1956年分離成功,自1970年代起，由于發(fā)現(xiàn)選擇性切割DNA分子的限制性內(nèi)切酶及接合酶，可將DNA分子加以重組，因此引發(fā)了基因工程的
2、開展,1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念；,1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)；,198,4,年1,1,月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長(zhǎng)度的,第一個(gè),PCR片斷；,1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒；,1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào),4,683,202,），這回Mullis是第一發(fā)明人。,1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法；
3、,1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，這是86年春天Mullis建議做的；,1988年，第一臺(tái)PCR儀問世；,1991年，Hoffman LaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。,PCR的原理,PCR,由變性,-,退火,-,延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,1.模板,DNA,的變性：即在高溫（93左右）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；,2.模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；,3.,引物的延伸：在,TaqDN
4、A,聚合酶的最適溫度（72）下，以dNTP為原料，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，從引物的53方向延伸，合成DNA新鏈。重復(fù)循環(huán)變性,-,退火,-,延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。,PCR反應(yīng)五要素：,即參加PCR反應(yīng)的五種主要物質(zhì)：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。,（一）Mg2+:終濃度為1.52.0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200 mol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq DNA聚合酶竟?fàn)嶮g2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。,（二）dNTP
5、：dNTP具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.07.5，一般存儲(chǔ)濃度為 10mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20200mol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。,（三）Taq DNA聚合酶：能耐95高溫而不失活，其最適pH值為8.38.5，最適溫度為7075，一般用72。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按53方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0.55個(gè)單位/100l。,（四）模板：PCR對(duì)模板D
6、NA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。,（五）引物：引物濃度一般為0.10.5mol/L，濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長(zhǎng)度一般1530個(gè)堿基，引物過長(zhǎng)或過短都會(huì)降低特異性。其3末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸）。引物G C約占4555%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。,P
7、CR常見問題,1、模板原因,純度：含有抑制物,濃度：含量低or太高,2、引物原因,引物錯(cuò)誤,引物設(shè)計(jì)不好,引物合成、純化不好,3、PCR條件原因,退火溫度,延伸時(shí)間,循環(huán)次數(shù),4、非特異性擴(kuò)增或拖尾,引物特異性差,模板和引物濃度過高,酶量過多,Mg2+濃度偏高,退火溫度偏低,循環(huán)次數(shù)過多,PCR的應(yīng)用,基因、DNA片段的克隆,人工基因構(gòu)建,DNA序列測(cè)定,基因定點(diǎn)突變,基因型（突變）檢測(cè),SNP分析，遺傳背景分析,生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究,疾病基因檢測(cè)/遺傳病的產(chǎn)前診斷,致病病原體的檢測(cè),腫瘤治療中癌基因的檢測(cè),DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證,其他:動(dòng)、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)）,PCR技術(shù),巢式PCR和半巢式PCR(nested primer PCR),多重PCR(multiple PCR),不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR),錨定PCR （anchored PCR),反向PCR（inverted PCR),彩色PCR（color complementation asay),原位PCR（in situ PCR）,差異顯示PCR（differential display PCR）,重組PCR（recombinant PCR）,增敏PCR,定量PCR（quantified PCR）,熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),
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