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1、 生 物 反 應 器 的 比 擬 放 大 2 “ 發(fā)酵放大是一門藝術，而不是一門 科學” A.E.Humphrey 3 Contents： 1、 生物反應器比擬放大的概念 2、生物反應器比擬放大的方法 3、生物反應器比擬放大需要考慮的因素 4、小結 4 生物反應器的放大是指在反應器的 設計與操作 上 ， 將 小型反應器的 最優(yōu)反應結果 轉移至工業(yè)規(guī)模反應器中 重現的過程 。 生物工程產品的研究開發(fā)的三個階段： （ 1） 實驗室階段 （ 2） 中試 （ 3） 工廠化生產 1.1 比擬放大的定義
2、 1、 生物反應器比擬放大的概念 5 第一階段 實驗室規(guī)模，進行菌種的篩選和培養(yǎng)基的研究 6 第二階段 中試工廠規(guī)模，確定菌種培養(yǎng)的最佳操作條件 7 第三階段 工廠大規(guī)模生產 8 表 1 小型和大型生物反應器設計的不同點 項 目 實驗用反應器 生產用反應器 功率消耗 不必考慮 需認真對待 反應器內空間 控制檢測裝置占去一定空間 無此影響 混合特性 可不必考慮 需認真對待 換熱系統(tǒng) 較易解決 較難解決 9 核心問題： 生物反應器中有三種重要的過程： （ 1） 熱力學過程 ， （ 2） 微觀動力學過程 ， （ 3） 傳遞過程 。
3、 而 核心問題 是傳遞過程 。 因為規(guī)模的放大對 傳遞過程的影響最大 。 放大目的： 維持中試所得到的最佳的細胞生長速率 ， 產物的 生成速率 。 產品的 質量高 ， 成本低 。 必須使菌體在大 中小型反應器中所處的外界環(huán)境完全或基本一致 。 1.2 放大的核心問題和目的 10 1.3 比擬放大的準則 （ 1）恒定單位體積功率 由 Pg/V恒定而確定攪拌轉速。 （ Pg指通 氣時的攪拌功率） 對黏度較高的非牛頓型流體或高細胞密 度培養(yǎng)，應用 Pg/V恒定 原則進行放大的效果 十分良好。 11 這個方法抓住了傳氧這一關鍵因素，目前應
4、用很多。具體應用中要注意幾個問題。 1.小試中要測得準確的 kLa值，選擇合適的計 算公式。 2.注意各計算 kLa公式在放大中參數的變化及 適用范圍。 3.按照計算 P0/Pg選擇通氣比，計算 V， 從而 計算 kLa 。 （ P0指不通氣時的攪拌功率） （ 2）恒定傳氧系數 (kLa) 12 剪切力與攪拌槳葉端的線速度成正 比 ， 從斷裂菌絲溢出核酸類物質的數 量與葉尖的線速度相關。在恒定體積 功率放大時一般維持 nd不變 （ n為攪拌 槳轉速、 d為攪拌槳直徑，一般攪拌葉 輪直徑與罐直徑之比為 0.330.45） （ 3）
5、恒定剪切力恒定葉端速度 13 （ 4）恒定混合時間（ tM ） 混合時間（ tM ）： 把少許具有與攪拌反應器內 的液體相同物性的液體注入攪拌反應器內，兩者達 到分子水平的均勻混合所需要的時間。 低黏度液體在小攪拌反應器內的混合時間很短。 反應器愈大，混合時間就愈長。實際上按等混合時 間放大是很難做到的，因為要做到這一點，放大后 反應器的攪拌槳轉速需要比小反應器攪拌槳轉速提 高很多。但作為一個校對的指標，對某些體系確實 必要。 14 1.4 比擬放大一般流程 生物反應器的比擬放大是為了到達預期 經濟目標，因此要 綜合考慮，抓住關鍵的因 數 。比擬放大的一
6、般流程為： （ 1） 幾何相似 放大確定放大的尺寸 ； （ 2） 按 公式計算 放大的其它參數 ； （ 3） 根據具體情況進行 適度調整 。 15 理論放大法 建立反應系統(tǒng)的動量、質量和能量平衡方程，求解 半理論放大法 對難于求解的動量橫算方程簡化 因次分析法 將動量、質量、熱量衡數以及有關的邊界條件、初始條 件以無因次形式寫出用于放大過程。 （由于對事物的機理缺乏透徹的了解，難以建立精確模型。） 以 kLa或 Kd相等為基準放大 經驗放大 以 P0/VL相等為基準放大
7、 以攪拌葉尖線速度相等為基準放大 以培養(yǎng)液溶氧濃度為基準放大 2、生物反應器比擬放大的方法 16 2.1 理論放大方法 所謂理論放大法，就是 建立及求解反應系統(tǒng)的動量， 質量和能量平衡方程 。由于發(fā)酵過程的復雜，有關反 應的酶未全部明白，以及攪拌功率在傳氧和剪切力之 間較難平衡，所以這種放大方法是十分復雜的，很難 在實際中應用，目前主要應用在最簡單的系統(tǒng)（發(fā)酵 液為靜止或流動的滯留系統(tǒng)如某些固定化生物反應器 的放大）。但此方法是以最系統(tǒng)，最科學的理論為依 據的方法，還是具有重要指導意義的。 17 如對于常見的機械攪拌通氣發(fā)酵罐，想要應用
8、理論放大方法就必須了解： 1. 必須了解三維熱傳遞方程，且邊界條件十分復雜； 2. 傳遞過程之間必須是偶聯的，即從動量衡算方程求解 的流動分量必須用于質量和熱量平衡方程的求解； 3. 動量衡算往往假定反應系統(tǒng)為均相液體，但對通氣生 物發(fā)酵，培養(yǎng)液中存在大量氣泡較難分析。 18 對于許多通氣發(fā)酵生 產，其產物相對濃度受單 位體積發(fā)酵液攪拌功率或 體積容氧系數的影響，不 論細菌還是酵母其目的產 物與 P/V或 Kla關系右如圖， 通常反應器放大應選用曲 線近乎水平的范圍。 19 局限性： 總之，對于發(fā)酵反
9、應器的理論放大，主要問題 是目前仍無法求解生物反應系統(tǒng)中的動量衡算 方程。所以，理論放大方法只能用于最簡單的 系統(tǒng)，例如發(fā)酵液是靜止的或流動屬于滯留的 系統(tǒng)，如某些固定化生物反應器的放大，以便 建立簡單的動量，質量和能量平衡方程。 20 2.2 半理論放大方法 由上可知，理論放大方法難于求解動量衡算方 程。為解決此矛盾，可對動量方程進行簡化， 對攪拌槽反應器或鼓泡塔， 只考慮液流主體的 流動，而忽略局部 （如攪拌葉輪或罐壁附近） 的復雜流動 。 21 簡單液體在穩(wěn)態(tài)條件下，質量衡算方 程為： 22 局限性 半理論放大方法是生物反應器設計與放大最普 遍的實驗研究方法。但是，液流
10、主體模型通常 只能在小型實驗規(guī)模的發(fā)酵反應器（ 530L） 中獲得，并非是在大規(guī)模的生產系統(tǒng)中得到的 真實結果，故使用此法進行放大有一定風險， 必須通過實際發(fā)酵過程進行檢驗校正。 23 2.3 因次分析放大法 所謂因次分析放大法就是在放大過程中，維持生物發(fā) 酵系統(tǒng)參數構成的無因次數群（稱為 準數 ）恒定不變， 把反應系統(tǒng)的動量，質量，熱量衡算以及有關的邊界 條件，初始條件以無因次形式構建方程用于放大過程。 盡管因次分析放大法的應用有嚴格的限制，但此法還 是十分有用的。 對因次分析放大法，準數的合理構建是關鍵，生化過 程常用參變量分為 4大類： (1)幾何參數 D,H,d（ 2）物
11、理化學參數 ,,(3)過程變量 N,P,V（ 4）氣體常數 g,R。另外準數需要經驗和直覺的結合，參數不能選 太多若選用到了無關或影響甚微的參數，參數過多就 無法放大了，若缺了重要參數，系統(tǒng)就無法用數學模 型正確表達。故必須對系統(tǒng)進行分析，確定起主導作 用的機理，忽略無關參數，這點很重要。 24 生物反應器的因次分析放大過程 25 局限性 應用因次分析放大法進行反應器放大，從原理 上講，準數一經獲得，進行生物反應器的放大 就簡單了，只要對小型實驗室反應裝置與大型 生產系統(tǒng)的同一準數取相等數值就可以了。但 實際上卻并不那樣簡單，雖然均相系統(tǒng)的流動 問題較易解決，但對于有傳質和傳熱同時進行
12、 的系統(tǒng)或非均質流動系統(tǒng)，問題就復雜了 。 26 2.4 經驗放大法 除上面介紹的 3種生物反應器的放大方法 之外，還有經驗放大法，這也是最常用的放大 方法。根據不完全的調查結果，生物發(fā)酵工廠 中好氧生物發(fā)酵反應器應用的各種經驗方法的 比例，如表 3所示 。 27 表 2 通氣發(fā)酵罐放大方法的比例 放大準則 所占比例 維持 p0/VL不變 30 維持 KLa不變 30 維持攪拌器葉端線速度不變 20 維持培養(yǎng)液氧濃度不變 20 注： P0：發(fā)酵罐中不通氣的攪拌功率， kw； VL：發(fā)酵罐中反應溶液的體積， m3； kla：發(fā)酵罐中體積溶氧系數，
13、 1/s或 1/h。 28 經驗放大法的分類： 以 kLa或 Kd相等為基準放大 以 P0/VL相等為基準放大 以攪拌葉尖線速度相等為基準放大 以混合時間相等為基準放大 29 許多 好氧發(fā)酵 ，特別是生物細胞濃度較高 時耗氧很快，故溶氧速率是否能滿足生物細 胞的代謝與生長就成為生物發(fā)酵生產的限制 因素。生物發(fā)酵的耗氧速率可通過實驗測定。 實踐證明， 高好氧發(fā)酵應用等 kLa的原則 進 行反應器放大通?？色@得良好結果。 2.4.1 以 kLa為基準的比擬放大法 30 以 kLa為基準的比擬放大法 適用條件： 高濃度細胞培養(yǎng)； 消耗氧氣的速度很快； 氧氣的
14、傳遞速率成為發(fā)酵關鍵因素 。 31 在耗氧發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液中的溶解度很低，生 物反應很容易因反應器溶氧能力的限制受到影響，以 反應器 KLa的相同作為放大準則，可以收到較好的效果。 以 KLa值相同 放大時，一 定要選一個 合適的 KLa值， 可根據微生 物發(fā)酵產物 的產率與 KLa 大小的關系 32 2.4.2 以 Po/VL相等為準則的比擬放大 這種方法適用對于 以溶氧速率 控制發(fā)酵反應 的生物發(fā)酵，粘度較高的 非牛頓型流體或高 細胞密度 的培養(yǎng) P0/VL 常數 1. 對于不通氣的攪拌反應器 2. 對于通氣攪拌反應器，可取單位體積液 體分配的通氣攪拌功率相
15、同的準則進行放大 33 對于通氣式機械攪拌生物反應器，可取單位 體積液體分配的通氣攪拌功率相同的準則進行放大，即： ,3 5 3i L iP n D V D ()21 321 2 Dnn D () 32 21 1 DPP D 對于通氣式機械攪拌生物反應器，可取單位體 積液體分配的通氣攪拌功率相同的準則進行放大 ..( ) ( )2 1 G0 7 5 0 0 81 21 2G QDnn DQ ..( ) ( )2 21 1 G2 7 7 0 2 42 gg 1G QDPP DQ 對于不通氣時的機械攪拌生物反應器，軸功率 計算： 34 2.4.3 以攪拌葉尖線速度
16、相等為基準放大 實踐表明，應用絲狀菌進行發(fā)酵，因這類微生 物細胞受攪拌剪切的影響較明顯，而 攪拌葉尖 線速度是決定攪拌剪切強度的關鍵。若僅僅維 持 kLa相等而不考慮攪拌剪切的影響，可能導 致放大設計失誤。 在 Po/VL相等的條件下， Di/D越?。崔D速越 高），攪拌剪切越強烈，這有利于菌絲團的分 散和氣泡的破裂細碎，從而有利于溶氧傳質和 胞內代謝產物的向外擴散，因此通常有利于代 謝產物抑制發(fā)酵的生物反應系統(tǒng)。 35 例如 ： 在使用放線菌發(fā) 酵生產新生霉素 時，在維持 Po/VL 不變的條件下， 使用較小的攪拌 葉輪可獲得較高 產量的抗生素， 如圖所示。 36 總結：
17、 所以，對于此類發(fā)酵系統(tǒng)，攪拌葉輪尖端 線速度也是發(fā)酵反應器放大設計的重要因素， 可作為放大基準。但必須明確，若攪拌葉輪直 徑（ Di/D）過小，則攪拌泵送能力下降，混合 時間加長，這會影響反應溶液混合的均勻性。 通常，對大多數的生物發(fā)酵，攪拌葉尖線速度 宜取 2.55m/s；對于球狀或短桿狀微生物可 適當增大，但最高也不宜超過 10m/s。 37 2.4.4 以混合時間相等為基準放大 （ 1） 混合時間：發(fā)酵罐內放入某種指示劑使發(fā) 酵液和指示劑達到分子水平均勻混合所需要的 時間 。 （ 2） 對于不同反應器型式和反應介質 ， 其混合 時間有不同的關聯式 ， 進行設計和放大時應作
18、 出合理的選擇 。 （ 3） 不適用于大型發(fā)酵罐 ， 因為如果按此原則 Di/D（ 攪拌葉輪 ） 會變大 ， 即轉速變小 。 這 樣溶氧效率低而且剪切力變大 ， 但可作為一個 標準進行校準 。 38 (1)幾何相似放大 按反應器的各個部件的幾何尺寸比例進行放大。放 大倍數實際上就是反應器的增加倍數。 12 12 HH DD 常數 3 22 11 VD m VD 1 1 3 2 H m H 1 1 3 2 D m D 2.4.5 其他放大方法 39 （ 2） 通風量的放大 按單位體積液體通風量 Q/V 相等； 大型反應器液柱高，空氣在液體中所走的路程和
19、氣液接觸時間均長于小型反應器。因此大型反應器的 有較高的空氣利用率，放大時大型反應器的 Q/V 比小 型設備的 Q/V 小。 按通風截面空氣線速度 Vs相等； 放大反應器空截面的空氣線速度 Vs 的大小表征 了液體的通風強度。對于空氣利用率較好的反應器， 大罐的 Vs 應適當大于小罐的。 按通風準數相等放大； 按體積溶氧系數相等放大。 40 （ 3）攪拌功率放大 攪拌功率是影響溶氧最主要的因素，因而 在機械攪拌生化反應器中，攪拌功率的放大是 整個放大中最主要的內容。 對于一定性質的液體，由于攪拌功率的 大小取決于攪拌轉速 n 和攪拌器直徑 Di ，因
20、此攪拌功率的放大實際上是 n 和 Di 的放大。 若集合相似，則 Di 一定，放大問題就只是選 擇攪拌轉速 n 的問題。 41 表 3 放大方法的比較 方 法 放大后的攪拌轉速 /（ r/min） 等體積功率（非通氣） 107 等體積功率（通氣） 85 等傳質系數 79 等葉端速度 50 等混合時間 100 按照上述不同放大準則所得出的結論，并以 攪拌轉速 進行比較。 42 總結： 從表 3可以看出，采用不同的放大準則， 其結果相差很大。這表明，若僅考慮將某一參
21、數作為放大準則進行放大，則有一定片面性。 這是因為各個參數之間相互聯系，而這 種聯系又不都是簡單的比例關系，因此要求放 大過程中要保證所有因素都不變是不可能的。 對于經驗放大法，根據統(tǒng)計，在實際放 大過程中應用最多的是 以 kLa或 P0/VL相等為基 準的放大。 43 3、生物反應器比擬放大需要考慮 的因素 物理因素 氧傳質系數（ KLa） 單位體積的攪拌功率 剪切應力 化學因素 過程因素 種子的級數 滅菌條件 44 3.1 物理因素 3.1.1 氧傳質系數（ KLa） KLa能用于表征氧的傳質能力。 KLa受罐的大小，
22、攪拌器的擋數和形狀，轉速， 擋板，通氣速率，罐壓等的影響。 KLa在發(fā)酵過程中隨發(fā)酵液黏度的改變而變化， 特別是絲狀菌的發(fā)酵，為非牛頓型流體特性， 應在線過程監(jiān)測。 45 3.1.2單位體積的攪拌功率 單位體積的攪拌功率常被用于發(fā)酵過程的 放大。此法的好處是容易從小型發(fā)酵罐中獲得。 一些重要的因素，如黏度，已包含在攪拌功率 的實驗數值內。如現成的電機功率不足，采用 稀配方或減小發(fā)酵罐的裝量也是一個方法。 46 3.1.3 剪切應力 在大型發(fā)酵罐中培養(yǎng)絲狀菌（如真菌或放線 菌），其菌絲常被攪拌葉打斷。剪切應力與攪 拌葉尖的線速度成正比，從斷裂菌絲溢出核酸 類物質的數量與
23、葉尖的線速度相關。 培養(yǎng)對剪切應力敏感的微生物，應降低攪拌速 率，相應增加攪拌器的直徑和采用多擋攪拌器， 以提高發(fā)酵液的溶氧。 47 圓盤彎葉 圓盤平直葉 圓盤箭葉 凹葉圓盤 圓盤平直葉具有很大的 循環(huán)輸送量和功率輸出， 適用于各種流體。 在混合要求特別高，溶 氧速率相對要求略低時， 可用圓盤彎葉。 圓盤箭葉軸向流動較強 烈，輸出功率較低。 凹葉圓盤能耗低，縮短 混合時間。 48 3.2 化學因素 主要包括培養(yǎng)基的組成、濃度、氧化還原電 位、 pH、氣體 CO2、 O2等。 在小型發(fā)酵罐中優(yōu)化的培養(yǎng)基成分放大到生產 罐中不一定合適。特別是影響產物合
24、成的主要 因素在生產過程中需要監(jiān)測，并通過補料控制 在適當的水平。 49 研究表明，通過通氣和攪拌控制氧化還原 電位，從 10L放大到 100L和 1000L中試罐（甚 至是幾何形狀不同的攪拌罐）是最為成功的方 法。不過，此法對其他品種的發(fā)酵是否適用還 有待證實。 50 3.3 過程因素 隨著發(fā)酵罐的容量增大，所需種子罐的級 數增加，且各級的種子培養(yǎng)基也不同，需滿足 生產菌不同生長階段的需求。原材料的批與批 之間的質量差異有時也會影響產量。實地（罐 內）或連續(xù)（罐外）滅菌的方法對培養(yǎng)基的破 壞是不同的，其結果也會影響產物的合成。 51 3.3.1 種子的級數
25、 隨著過程的放大，各級種子的質量也很重 要，可以遵循以下的原則： 種子接種到生產罐后，其停滯（適應）期應盡 可能縮短； 應有足夠量的種子； 細胞的生長形態(tài)適合。 52 3.3.2 滅菌條件 對實罐滅菌來說，大型發(fā)酵罐所需的滅菌 時間要長很多，這樣常導致培養(yǎng)基的焦糖化和 重要成分的破壞。這些降解產物往往會影響菌 的生長和產物的合成。因此，糖需要和其他培 養(yǎng)基分開滅菌。 53 4、小結 生物反應器的比擬放大不是簡單的按比 例放大，而是建立在幾何相似、培養(yǎng)條件相同 和微生物在反應器中充分分散等基本假設之上 的。由于生物反應器的類型很多，所適用的體 系也各異，
26、因此 生物反應器 的比擬放大是比 較復雜的。 到目前為止，生化放大過程一直是 一個難題。 54 發(fā)酵過程監(jiān)控的主要指標 1. 物理指標： T、 P、攪拌轉速、功耗、泡沫、氣體流 速、黏度等。 2. 化學指標： pH、氧化還原電位、溶解氧、氣體 COO、 糖含量、化合物含量等。 3. 生物指標：菌體濁度、 ATP、各種酶活力、中間代 謝產物等。 隨著規(guī)模的放大，以上各種指標可能均在變化，故在小試中應先找到影響菌的生產性能的 關鍵因素。 55 比擬放大過程中，雖然要考慮的因素有很多，但 經分析歸納，其有影響的主要變量不過 D、 N、 P0三 種，為了全力找出放大過程中的關鍵因素，就應該抓 住主要變量這個環(huán)節(jié)。 其他因素包括：拌渦輪數目、渦輪間距離、罐的 其他尺寸以及空氣的空罐流速，空氣在發(fā)酵醪中的阻 留率也應該考慮。 56 總之，生物反應器的比擬放大需要盡可能 模擬重要的培養(yǎng)條件，對過程進行縮小研究有 助于揭示生產中存在的問題。然后，針對關鍵 問題再進行試驗研究，有時還需要從菌種選育 著手去克服比擬放大中出現的問題。 57
生物反應器的比擬放大.ppt
