動物胚胎移植技術(shù)及體外受精.ppt

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第四章動物胚胎工程技術(shù)及體外受精 現(xiàn)代生物技術(shù) 家畜育種領(lǐng)域 繁殖生物技術(shù) 分子生物技術(shù) 人工受精技術(shù) 胚胎工程技術(shù) 超數(shù)排卵和胚胎移植 胚胎性別鑒定 體外受精 胚胎分割 克隆技術(shù) 第一節(jié)胚胎工程技術(shù)胚胎移植胚胎融合胚胎分割胚胎的冷凍保存早期胚胎培養(yǎng)胚細(xì)胞核移植 一 胚胎移植 受精卵移植把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮中沖洗出來 移植到另一頭雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi) 使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的技術(shù) 供體提供胚胎的動物受體接受和孕育胚胎的動物 1 胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ) 成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡 在外源激素作用下 每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)數(shù)十個每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育早期胚胎處于游離狀態(tài)胚胎發(fā)育不存在免疫問題胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系胚胎的遺傳性不受受體的影響 2 胚胎移植的基本原則 胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性動物生理上的一致性 受體和供體在發(fā)情時間上的同期性動物解剖位置上的一致性 空間環(huán)境的一致性胚胎的發(fā)育期限 必須處于周期黃體期內(nèi)胚胎的質(zhì)量 胚胎必須是正常的 并在處理過程中不受不良因素的影響 3 胚胎移植 供受體的選擇與管理供體的超數(shù)排卵處理和配種受體的同期發(fā)情處理胚胎回收胚胎檢查胚胎移植 1 供受體的選擇與管理 供體的選擇遺傳價值 生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母畜健康狀況 身體健康 營養(yǎng)水平中等以上的未孕動物繁殖性能 達(dá)到配種年齡以上繁殖機(jī)能正常的母畜 受體的選擇身體健康 身體狀況中上的適繁未孕個體 無生殖道疾病和難產(chǎn)病史繁殖狀況正常 有正常的發(fā)情周期母性良好 泌乳性能 護(hù)仔性能供 受的管理防疫 記錄飼養(yǎng)管理等 2 超數(shù)排卵 超排 以各種外源性促性腺激素誘發(fā)動物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受精能力的卵子 孕母馬促性腺激素 促卵泡素 前列腺素 促排卵類藥物 孕激素超數(shù)排卵處理的時期應(yīng)選擇在發(fā)情周期的后期 即黃體消退時期 個體對超排處理的反應(yīng)效果難以預(yù)測 產(chǎn)生不良的后果 胚胎死亡卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過程發(fā)生改變生殖道機(jī)能產(chǎn)生影響 3 同期發(fā)情 synchronizationofeatrus 采用激素或類激素的藥物處理 使這一群母畜在特定時間內(nèi)集中發(fā)情和排卵 即將母畜的黃體期延長或縮短 使母畜擺脫內(nèi) 外孕激素對卵巢的控制 在同一時間內(nèi)引起全部母畜的卵泡發(fā)育 從而達(dá)到同期發(fā)情的目的 延長黃體期 孕激素控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)縮短黃體期 前列腺素加速黃體退化 使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制促進(jìn)卵泡發(fā)育 排卵 促性腺激素 4 胚胎回收 利用沖胚液從供體的生殖道中沖洗出來 提供移植或其它胚胎工程用 手術(shù)法非手術(shù)法 5 胚胎檢查 胚胎早期發(fā)育 胚胎質(zhì)量評價 透明帶的形態(tài)和完整性胚胎的發(fā)育與胚齡是否一致胚胎的形態(tài)與勻稱性 胚內(nèi)細(xì)胞大小的變化細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色 胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡 細(xì)胞碎片 有無游離細(xì)胞如A級 為優(yōu)良胚胎 形態(tài)典型 卵裂球輪廓清晰 緊密充實 大小均一 細(xì)胞質(zhì)致密 色調(diào)和分布均一 胚胎的降溫 使胚胎停止發(fā)育 延長其體外生存時間體外培養(yǎng) 將胚胎置于體溫條件下 在培養(yǎng)液中 使其繼續(xù)發(fā)育胚胎冷凍 通過一定的處理程序 將胚胎降溫冷凍后 保存于液氮中 6 胚胎的保存 胚胎冷凍的原理 胚胎冷凍實際是脫水的過程 冷凍保存的關(guān)鍵是設(shè)法減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對胚胎的損傷 冷凍過程中 水分形成冰晶造成細(xì)胞機(jī)械損傷 同時 導(dǎo)致未結(jié)冰的細(xì)胞內(nèi)溶液滲透壓急劇升高 造成蛋白質(zhì)變性 導(dǎo)致死胎 受精卵移植一般供體為良種或優(yōu)良個體 而受體為生產(chǎn)性能較差的個體或品種 借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎 5 胚胎移植 選擇 供體母牛 受體母牛 同期發(fā)情處理 超數(shù)排卵 供體公牛 配種 沖卵 質(zhì)量檢查 培養(yǎng) 胚胎移植 妊娠檢查 分娩 胚胎移植的犢牛 胚胎移植的基本程序 6 胚胎移植的應(yīng)用范圍 在家畜改良方面的應(yīng)用在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用在動物生物多樣性上的應(yīng)用其它方面應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因動物 性別控制 體外受精 在家畜改良方面的應(yīng)用 人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能 但對優(yōu)秀母畜來說 受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制 尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此 通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù) multipleovulationandembryotransfer MOET 牛羊的生長性狀年遺傳進(jìn)展可比正常繁殖提高80 和70 產(chǎn)奶性狀提高33 在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用 牛羊等低繁殖力家畜 從引進(jìn)到形成一個純種群體需要7 8個世代 15 20年 而采用MEOT法 一次就可獲得一個純種群體 80年代初 美 澳 新從歐洲引進(jìn)的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴(kuò)繁 2000年前后 我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進(jìn)行擴(kuò)繁的 在動物生物多樣性上的應(yīng)用 在保護(hù)動物遺傳資源 提高家畜生產(chǎn)性能 挽救瀕臨滅絕的野生動物方面 胚胎移植技術(shù)越來越發(fā)揮出重要作用 冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細(xì)胞 但該種動物雌性個體的減少 也是這種動物的胚胎或生殖細(xì)胞無法得到移植 科學(xué)家開始研究在該種動物的亞種或親緣種中試驗 并取得一些成功 如斑馬胚胎移植給馬 蒙古馬胚胎移植給驢 白肢野牛移植給荷斯坦牛 其它方面應(yīng)用 胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程體外受精必須借助胚胎移植實現(xiàn) 試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植 二 胚胎分割技術(shù) 1 概念 采用顯微手術(shù) 機(jī)械方法 的方法將早期胚胎分割成2分胚 4分胚或8分胚 經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)后植入受體 以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術(shù) 胚胎分割以增加優(yōu)秀遺傳性狀的動物數(shù)量為主要目的 可提高胚胎移植技術(shù)的效率和效益 2 胚胎分割的理論依據(jù) 大多數(shù)哺乳動物早期胚胎屬調(diào)整發(fā)育類型 去掉早期胚胎的一半 剩余的部分仍發(fā)育成完整的胚胎 至少在8細(xì)胞前 每個分裂球都有相同的發(fā)育能力 到晚桑椹胚時 胚胎發(fā)生初步分化 這時進(jìn)行胚胎分割 可以重新發(fā)育到囊胚 2 特點(diǎn) 后代具有相同的遺傳物質(zhì) 胚胎克隆 3 選擇的胚胎 發(fā)育良好的 形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚 4 使用的主要儀器 實體顯微鏡和顯微操作儀5 應(yīng)用 為轉(zhuǎn)基因技術(shù) 性別控制技術(shù)提供活胚材料 注意 對囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時 要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割 原因 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一般到囊胚階段才出現(xiàn) 它是發(fā)育為胚胎本身的基礎(chǔ)細(xì)胞 其他細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞 只為胚胎和胎兒發(fā)育提供營養(yǎng) 若分割時不能將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割 會出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強(qiáng) 少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良 甚至不能發(fā)育等問題 胚胎分割技術(shù)也是動物克隆的方法之一 胚胎分割的份數(shù)越多 操作的難度會越大 移植的成功率也越低 早期胚胎的體積很小 只有在顯微鏡下才能看到 細(xì)胞數(shù)目是有限的 分割的份數(shù)越多 不但難以做到均等分割 每一份的細(xì)胞數(shù)會越少 作為囊胚期的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞所受的影響會更大 分割的份數(shù)越多 技術(shù)的難度會越大 移植后的恢復(fù)和發(fā)育的難度會越大 移植成功率自然會降低 三 胚胎細(xì)胞核移植將未著床的早期胚胎分散成單個的細(xì)胞 用電融合方法 使單個細(xì)胞與去除細(xì)胞核的未受精的成熟的卵母細(xì)胞融合 體外培養(yǎng)發(fā)育成胚胎后 移入受體妊娠產(chǎn)子 已在小鼠 兔 山羊 牛 猴等動物上成功 四 性別控制與胚胎性別鑒定 動物的性別控制 sexcontrol 技術(shù)是通過對動物的正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù) 使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù) X Y精子分離技術(shù) 流式細(xì)胞儀胚胎性別診斷 早期胚胎的性別鑒定1 核型分析 分析部分胚胎細(xì)胞的染色體的組成2 SRY片段的PCR擴(kuò)增 Y染色體上的特異片段 3 H Y抗原 雄性特異性弱組織相容性Y抗原只有Y精子才能表達(dá)H Y抗原 利用H Y抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的H Y抗原 再通過一定的分離程序 就能將精子分離成H Y Y精子 和H Y X精子 兩類 將所需性別的精子進(jìn)行人工受精 即可獲得預(yù)期性別的后代 測定胚胎上H Y抗原的存在與否對胚胎的性別作出鑒定 意義 通過控制后代的性別比例 可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀 如泌乳 和受性別影響的生產(chǎn)性狀 如生長速度 肉質(zhì)等 的最大經(jīng)濟(jì)效益 控制后代的性別比例可增加選種強(qiáng)度 加快育種進(jìn)程 控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象 排除伴性有害基因的危害 五 早期胚胎培養(yǎng) 發(fā)育阻斷 早期胚胎停頓在某個特定發(fā)育時期 不能繼續(xù)發(fā)育 時間隨動物種不同而異培養(yǎng)條件不完備添加各種生長因子可促進(jìn)胚胎發(fā)育與某些體細(xì)胞共同培養(yǎng)飼養(yǎng)性細(xì)胞 通過分泌某些有利于胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)因子 體外受精 InVitroFertilization 是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù) 英文簡稱為IVF 在生物學(xué)中 把體外授精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物 test tubeanimal 第二節(jié)體外受精 我國奶牛問題 人工授精 AI 一 基本原理 人工模擬體內(nèi)環(huán)境 包括營養(yǎng) 溫度 PH等 使初級卵母細(xì)胞成熟 同時使精子獲能 最終完成受精作用 并有計劃地保存胚胎 二 體外受精技術(shù)發(fā)展的歷史體外受精研究有100多年歷史1878年德國Sehenk在家兔和豚鼠進(jìn)行了嘗試1954年張民覺獲得首例體外受精兔1963年金黃倉鼠體外受精獲得成功 開創(chuàng)了精子體外獲能成功的先例1990年我國錢菊芬獲得首例試管山羊旭日干 范必勤等獲得試管牛犢 三 意義 體外受精技術(shù)對動物生殖機(jī)理研究 畜牧生產(chǎn) 醫(yī)學(xué)和瀕危動物保護(hù)等具有重要意義 在家畜品種改良中 體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段 對充分利用優(yōu)良品種資源 縮短家畜繁殖周期 加快品種改良速度等有重要價值 哺乳動物胚胎移植 克隆 轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分 四 體外受精技術(shù)環(huán)節(jié) 卵母細(xì)胞的獲得和體外成熟精子的體外獲能成熟卵母細(xì)胞與獲能精子的體外受精受精卵的體外培養(yǎng)受精卵的移植 體外受精 獲能 次級卵母細(xì)胞減數(shù)第二次分裂中期 1 卵母細(xì)胞的獲得與體外成熟 1 卵細(xì)胞的采集方法獲得足夠數(shù)量的卵母細(xì)胞是生產(chǎn)試管動物的前提 1 從屠宰場家畜卵巢中采集 2 從超數(shù)排卵的卵巢獲得卵泡 借助腹腔鏡 手術(shù)法取卵 3 陰道超聲波監(jiān)視穿刺法直接從牛卵巢收集卵母細(xì)胞和內(nèi)窺鏡借助套筒穿刺陰道穹隆獲得 卵母細(xì)胞的采集 2 卵母細(xì)胞的成熟 未成熟的卵母細(xì)胞的核在細(xì)胞中央 成熟過程中遷移到動物極質(zhì)膜下 核變得膨大 改稱發(fā)生泡 接著進(jìn)行第一次成熟分裂 減數(shù)分裂的完成標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟 1 細(xì)胞核成熟 2 細(xì)胞質(zhì)的成熟 顯著的蛋白質(zhì)合成發(fā)生在生發(fā)泡破裂前后 這些新合成的蛋白質(zhì)不僅與卵細(xì)胞自身成熟有關(guān) 激活成熟促進(jìn)因子 而且與卵母細(xì)胞輸精后的發(fā)育能力直接有關(guān) 所以細(xì)胞質(zhì)成熟的質(zhì)量如何直接影響到早期胚胎的發(fā)育能力 胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)為細(xì)胞器變化和紡錘體的形成 卵母細(xì)胞成熟后期細(xì)胞器完成重新組裝 如高爾基體消失 線粒體分布核的周圍 胞質(zhì)內(nèi)有PAS陽性的囊膜和脂滴 3 細(xì)胞膜和透明帶的成熟 細(xì)胞膜穩(wěn)定性發(fā)生改變 膜微絨毛發(fā)生重排 表現(xiàn)密集而有彎曲 并從透明帶內(nèi)退出或斷裂透明帶外層呈網(wǎng)狀 變軟 2 體外獲能 指精子在體外獲得受精能力的過程 包括在體外環(huán)境中除去精漿和精子表面吸附的大分子物質(zhì) 減少表面陰性電荷 提高膜流動性 增加精子呼吸率和加快運(yùn)動幅度等一系列生理生化過程 精子體外獲能是體外受精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 主要包括精子的洗滌和添加特定成分Brackett 1982 以高離子強(qiáng)度液處理使精子獲能鈣離子在精子獲能時起關(guān)鍵作用 能較快的誘發(fā)精子超活化運(yùn)動和頂體反應(yīng) 氨基多糖 GAGs 是牛精子獲能的主要物質(zhì) 可促進(jìn)對鈣離子的吸收 誘發(fā)頂體反應(yīng) 如肝素也可使精子獲能 但同樣是一個鈣離子依賴的過程 血清白蛋白 BSA 也可誘發(fā)精子獲能 可能作為Zn離子融合劑引起PLA2的表達(dá) 或者在獲能中去除精子膜上的膽固醇 3 體外受精 體外受精是以正常體內(nèi)受精的研究為基礎(chǔ)的 盡可能給精 卵提供一個適宜的共培養(yǎng)體系是研究體外受精的目的 受精成功的標(biāo)志是看受精卵是否可發(fā)育至囊胚期階段 多精子受精一直是體外受精的一個難點(diǎn) 4 受精卵的體外培養(yǎng) 受精卵要在體外條件下培養(yǎng)發(fā)育一段時間 再移植到受體子宮內(nèi) 因此 試管動物 實際上要在體外進(jìn)行三個階段的培養(yǎng) 第一階段是卵子成熟培養(yǎng)和精子獲能培養(yǎng) 第二階段是受精培養(yǎng) 第三階段才是受精卵早期發(fā)育培養(yǎng) 5 存在的問題 1 體外受精的效率有待提高2 體外培養(yǎng)體系有待進(jìn)一步完善3 基礎(chǔ)理論研究有待加強(qiáng) 作業(yè) 1 概念胚胎移植 超速排卵 同期發(fā)情 胚胎分割 發(fā)育阻斷 體外受精 精子獲能2 簡答胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)胚胎移植的基本原則牛胚胎移植基本程序