《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》PPT課件.ppt

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1、1 找 答 案 ？ 核 酸 分 離 純 化 的 原 則 是 什 么 ？ 為 防 止核 酸 降 解 需 要 注 意 什 么 ？ 核 酸 制 備 基 本 步 驟 ？ 如 何 鑒 定 核 酸 濃 度 和 純 度 ？ 核 酸 的 保 存 方 法 有 哪 些 ？ 2 前 言 核 酸 （ nucleic acid） 是 以 核 苷 酸 為 基 本 組 成 單 位的 生 物 信 息 大 分 子 。 是 遺 傳 信 息 的 攜 帶 者 ， 是 基因 表 達(dá) 的 物 質(zhì) 基 礎(chǔ) 。 3 核 酸 的 分 類 ：nDNA q核 內(nèi) 染 色 體 DNA。q核 外 也 有 少 量 DNA， 如 線 粒 體 DNA， 葉

2、 綠 體DNA。q質(zhì) 粒 DNA。n RNAq存 在 于 細(xì) 胞 質(zhì) 中 ， 如 mRNA, rRNA, tRNA等 。n除 上 述 DNA， RNA外 ， 還 有 非 細(xì) 胞 形 式 存 在 的 病毒 和 噬 菌 體 ， 其 或 只 含 DNA， 或 只 含 有 RNA。 4 主 要 內(nèi) 容2. 核 酸 制 備 的 基 本 步 驟3. 核 酸 的 鑒 定 和 保 存4. 核 酸 提 取 方 法 簡(jiǎn) 介 5 1. 核 酸 分 離 與 純 化 的 原 則 及 要 求1.1 核 酸 分 離 與 純 化 的 一 般 原 則(1) 保 持 核 酸 分 子 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 完 整 性 ， 是 核 酸

3、 結(jié)構(gòu) 和 功 能 研 究 的 最 基 本 要 求 。(2) 排 除 其 他 分 子 的 污 染 ， 保 證 核 酸 的 純 度 。 6 1.2 核 酸 分 離 與 純 化 的 要 求(1) 為 保 證 核 酸 的 完 整 性 ，（ 防 止 降 解 ） ， 在 實(shí) 驗(yàn) 中 應(yīng) 注 意 ： 盡 量 簡(jiǎn) 化 步 驟 ， 縮 短 提 取 時(shí) 間 ， 減 少 各 種有 害 因 素 對(duì) 核 酸 的 破 壞 。 減 少 化 學(xué) 因 素 對(duì) 核 酸 的 降 解 ， pH4-10?；?學(xué) 因 素 ？生 物 因 素 ？物 理 因 素 ？ 7 防 止 核 酸 的 生 物 降 解 （ 細(xì) 胞 內(nèi) 或 外 的各 種

4、核 酸 酶 水 解 ） 。 所 用 器 械 和 一 些 試 劑 需 高 壓 滅 菌 ， 提 取 緩 沖液 中 需 加 核 酸 酶 抑 制 劑 。 操 作 溫 度 為 04 。l DNA酶 需 要 金 屬 離 子 Mg2+、 Ca2+的 激 活 ， 因 此使 用 金 屬 離 子 螯 合 劑 ， 如 EDTA或 檸 檬 酸 鹽 等 ；陰 離 子 表 面 活 性 劑 SDS。 l RNA酶 分 布 廣 泛 ， 極 易 污 染 樣 品 ， 而 且 耐 高 溫 、耐 酸 堿 、 不 易 失 活 ， 生 物 降 解 是 RNA提 取 過(guò) 程 中的 主 要 危 害 因 素 。 0.1%DEPC浸 泡 ， 器

5、 械 180干 烤 8h。 8 減 少 物 理 因 素 對(duì) 核 酸 的 降 解 ， 主 要是 機(jī) 械 剪 切 力 ， 其 次 是 高 溫 。l 機(jī) 械 剪 切 力 包 括 強(qiáng) 力 高 速 的 振 蕩 、 突 然 暴露 于 低 滲 液 、 樣 品 反 復(fù) 凍 融 等 。l 高 溫 ， 如 長(zhǎng) 時(shí) 間 的 煮 沸 。 9 (2) 核 酸 純 度 的 要 求 ： 非 核 酸 生 物 大 分 子 的 污 染 降 低 到 最 低 程度 ， 如 蛋 白 質(zhì) 、 多 糖 和 脂 類 分 子 ； 排 除 其 它 核 酸 分 子 的 污 染 ， 如 制 備 RNA時(shí) ， DNA分 子 是 污 染 物 ； 去 除

6、 對(duì) 后 續(xù) 實(shí) 驗(yàn) 有 影 響 的 物 質(zhì) ， 如 有 機(jī)溶 劑 和 過(guò) 高 濃 度 的 金 屬 離 子 。 10 2. 核 酸 制 備 的 基 本 步 驟I.材 料 準(zhǔn) 備II.破 碎 細(xì) 胞 或 包 膜 內(nèi) 容 物 釋 放III.核 酸 分 離IV.沉 淀 或 吸 附 核 酸 ， 純 化 并 去 除 雜 質(zhì)V.核 酸 溶 解 在 適 量 緩 沖 液 或 水 中 11 2.1 破 碎 細(xì) 胞 (1)玻 璃 勻 漿 器 勻 漿(2)液 氮 研 磨 法富 含 DNA酶 的 胰 、 脾 、 胸 腺 、 淋 巴 ； 富 含 膠 原 蛋 白 的 皮膚 、 肌 腱 ； 堅(jiān) 硬 的 組 織 如 骨 骼

7、。(3)高 速 組 織 搗 碎 機(jī) 搗 碎(4)超 聲 波 處 理 法(5)化 學(xué) 處 理 法 (SDS、 吐 溫 80等 ）(6)生 化 法 （ 溶 菌 酶 、 纖 維 素 酶 等 ） 12 2.2 核 酸 分 離 ， 去 除 蛋 白 核 酸 與 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 合 力 主 要 是 正 負(fù) 靜 電 吸 力 (核 酸 與 堿性 蛋 白 的 結(jié) 合 )、 氫 鍵 和 非 極 性 的 范 德 華 力 。 分 離 核 酸 最 困 難 的 是 將 與 核 酸 緊 密 結(jié) 合 的 蛋 白 質(zhì) 分 開 ，同 時(shí) 避 免 核 酸 降 解 。（ 1） 加 入 SDS SDS除 有 破 膜 和 抑 制 核

8、酸 酶 的 作 用 外 ， 還 具 有 使 核 酸 從 蛋 白 質(zhì) 上 游離 出 來(lái) 的 功 能 ；（ 2） 加 入 濃 鹽 溶 液 （ 如 NaCl） 核 酸 -蛋 白 質(zhì) 加 入 NaCl后 ， 破 壞 靜 電 吸 力 ， 使 氫 鍵 破 壞 ， 核 蛋 白 解 聚 ； 13 （ 3） 酚 /氯 仿 抽 提p 酚 氯 仿 混 合 使 用 能 增 加 去 除 蛋 白 的 效 果 ， 并 對(duì) 核 酸 酶 有 抑制 作 用 。p 氯 仿 比 重 大 ， 能 加 速 有 機(jī) 相 與 水 相 分 層 ， 減 少 殘 留 在 水 相 中的 酚 ， 同 時(shí) 氯 仿 具 有 去 除 植 物 色 素 和 蔗

9、 糖 的 作 用 。p 在 酚 /氯 仿 抽 提 核 酸 提 取 液 時(shí) ， 需 要 振 搖 ， 為 防 止 起 泡 和 促 使水 相 與 有 機(jī) 相 的 分 離 ， 再 加 上 一 定 量 的 異 戊 醇 （ 酚 ： 氯 ： 異戊 醇 =25： 24： 1） 。 14 (1） 使 用 注 意 酚 通 常 是 透 明 無(wú) 色 的 結(jié) 晶 ， 如 果 酚 結(jié) 晶 呈現(xiàn) 粉 紅 色 或 黃 色 ， 表 明 其 中 含 有 酚 的 氧 化 產(chǎn) 物 ，例 如 醌 、 二 酸 等 。 變 色 的 酚 不 能 用 于 核 酸 抽 提實(shí) 驗(yàn) ， 因 為 氧 化 物 可 破 壞 核 酸 的 磷 酸 二 酯 鍵

10、 。 (2） 安 全 操 作 酚 腐 蝕 性 很 強(qiáng) ， 并 可 引 起 嚴(yán) 重 的 灼 傷 ， 操作 時(shí) 應(yīng) 戴 手 套 。使 用 酚 時(shí) 應(yīng) 注 意 15 2.3 沉 淀 核 酸n 重 新 調(diào) 整 核 酸 的 濃 度 ， 起 到 濃 縮 核 酸 的 作 用 ； n 去 除 溶 液 中 某 些 鹽 離 子 與 雜 質(zhì) ；n 改 變 核 酸 的 溶 解 緩 沖 液 。 DNA純 化 柱 核 酸 提 取 （ 離 心 柱 型 ）利 用 硅 膠 膜 特 異 吸 附 核 酸 16Na+ Mg2+ Li+ 2.3.1 核 酸 的 有 機(jī) 溶 液 沉 淀 法 當(dāng) 核 酸 溶 液 的 pH值大 于 4時(shí) ，

11、 核 酸 分 子 呈多 聚 陰 離 子 狀 態(tài) 。 鉀 、 鈉 、 鎂 、 鋰 及 銨根 等 陽(yáng) 離 子 形 成 的 鹽 ，通 過(guò) 屏 蔽 帶 負(fù) 電 的 磷 酸基 團(tuán) 使 DNA分 子 聚 結(jié) 在一 起 而 不 溶 于 許 多 有 機(jī)溶 劑 。 17 核 酸 沉 淀 的 鹽 類 及 濃 度鹽 貯 存 液 濃 度 （ mol/L) 終 濃 度 (mol/L)MgCl2 1 0.01NaAc 3 (pH5.2) 0.3KAc 3 (pH5.2) 0.3NH4Ac 10 2.5NaCl 5 0.2LiCl 8 0.8 18 乙 醇n 優(yōu) 點(diǎn) ： 對(duì) 鹽 類 沉 淀 少 ， 沉 淀 中 所 含 跡

12、量 乙 醇 易 揮 發(fā) 除 去 ， 不 影 響以 后 實(shí) 驗(yàn) 。n 缺 點(diǎn) ： 需 要 量 大 ， 一 般 要 求 低 溫 操 作 。異 丙 醇n 優(yōu) 點(diǎn) ： 需 體 積 小 ， 速 度 快 ， 適 于 濃 度 低 、 體 積 大 的 DNA樣 品 沉 淀 。一 般 不 需 低 溫 長(zhǎng) 時(shí) 間 放 置 。 n 缺 點(diǎn) ： 易 使 鹽 類 、 蔗 糖 與 DNA共 沉 淀 異 丙 醇 難 以 揮 發(fā) 除 去 。 所以 ， 最 后 用 70 乙 醇 漂 洗 數(shù) 次 。 常 用 的 有 機(jī) 沉 淀 劑 19 聚 乙 二 醇 （ PEG）優(yōu) 點(diǎn) ： 可 用 不 同 濃 度 的 PEG選 擇 沉 淀 不

13、 同 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量的 DNA片 段 。 應(yīng) 用 6000相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 的 PEG進(jìn) 行DNA沉 淀 時(shí) ， 使 用 濃 度 與 DNA片 段 的 大 小 成 反 比 。注 意 ： PEG沉 淀 一 般 需 加 0.5mol/L的 NaCl或 10 mmol/L的 MgCl 2。 20 精 胺 精 胺 不 是 有 機(jī) 溶 劑 ， 但 可 快 速 有 效 沉 淀 DNA。 原 理 是 ： 精 胺 與 DNA結(jié) 合 后 ， 使 DNA在 溶 液 中 結(jié) 構(gòu) 凝 縮而 發(fā) 生 沉 淀 ， 并 可 使 單 核 苷 酸 和 蛋 白 質(zhì) 雜 質(zhì)與 DNA分 開 ， 達(dá) 到 純 化 DNA

14、的 目 的 。 21 2.3.2 核 酸 沉 淀 的 溫 度 和 時(shí) 間 一 般 強(qiáng) 調(diào) ， 核 酸 沉 淀 在 低 溫 長(zhǎng) 時(shí) 間 下 進(jìn) 行 。 但 時(shí)間 過(guò) 長(zhǎng) ， 易 導(dǎo) 致 鹽 與 DNA共 沉 淀 ， 影 響 以 后 的 實(shí) 驗(yàn) 。一 般 使 用 0 冰 水 ， 10-15min， DNA樣 品 足 可 達(dá) 到 實(shí)驗(yàn) 要 求 。3. 核 酸 的 濃 度 和 純 度 的 測(cè) 定3.1 紫 外 分 光 光 度 法 鑒 定 核 酸 3.2 熒 光 光 度 法 鑒 定 核 酸 22 3.1 紫 外 分 光 光 度 法 鑒 定 核 酸 3.1.1 紫 外 分 光 光 度 法 測(cè) DNA和 R

15、NA的 含 量 前 提 ： 核 酸 樣 品 要 較 純 ， 無(wú) 顯 著 蛋 白 質(zhì) 、 酚 、 瓊 脂糖 及 其 他 核 酸 污 染 。 測(cè) 定 濃 度 應(yīng) 大 于 0.25 g/ml 。結(jié) 論 ： 在 波 長(zhǎng) 260nm紫 外 光 下 ， 1 OD值 的 吸 光 度 相當(dāng) 于 雙 鏈 DNA濃 度 為 50 g/ml； 單 鏈 DNA為 37 g/ml； RNA為 40 ug/ml。 23 a 分 光 光 度 計(jì) 先 用 一 定 量 的 水 校 正 零 點(diǎn) 。b 吸 取 一 定 量 的 DNA樣 品 或 RNA樣 品 ， 加 入 到 盛有 一 定 體 積 水 的 石 英 比 色 杯 中 。c

16、 測(cè) 定 待 測(cè) 樣 品 在 230nm、 260nm和 280nm的 OD值d 計(jì) 算 濃 度 。 雙 鏈 DNA樣 品 濃 度 ( g/ l) = OD260 核 酸 稀釋 倍 數(shù) 50/1000； RNA樣 品 濃 度 ( g/ l) = OD260 核 酸 稀 釋 倍 數(shù) 40/1000。e 分 析 純 度 。 核 酸 定 量 儀 可 直 接 獲 得 濃 度 ， 不 用 計(jì) 算 。小 分 子 雜 質(zhì) 核 酸 蛋 白 質(zhì)紫 外 分 光 光 度 計(jì) 測(cè) 定 核 酸 濃 度 的 操 作 步 驟 24 A： 測(cè) DNA： 純 的 DNA樣 品 OD260/OD280=1.8 （ 1.71.9）

17、 OD260m/OD2302.01) OD260/OD2801.9, RNA污 染 。2) OD260/OD2801.6， 存 在 蛋 白 質(zhì) 或 酚 污 染 ；3) OD260/OD2302.01） OD260/OD280比 值 太 小 ， 蛋 白 質(zhì) 或 酚 的 污 染 ；2） OD260/OD280 2.0， 可 能 被 異 硫 氰 酸 胍 等 污 染 ；3） OD260/OD2302.0， 表 明 有 小 分 子 及 鹽 存 在 。 26 3.2 熒 光 光 度 法 鑒 定 核 酸 3.2.1 測(cè) 定 核 酸 含 量 ：原 理 ： DNA、 RNA在 熒 光 染 料 溴 乙 錠 (EB

18、)嵌 入 堿 基 平 面之 間 后 ， DNA、 RNA樣 品 在 紫 外 光 激 發(fā) 下 ， 可 發(fā) 出 紅色 熒 光 ， 熒 光 強(qiáng) 度 與 核 酸 含 量 成 正 比 。 使 用 一 系 列已 知 的 不 同 濃 度 DNA溶 液 作 標(biāo) 準(zhǔn) 對(duì) 照 ， 可 比 較 出 被 測(cè)DNA溶 液 濃 度 。 注 意 ： 此 法 的 比 較 主 要 基 于 目 測(cè) ， 是 估 計(jì) 水 平 。 常 用 的 熒 光 染 料 還 有 :golden view, gel red, sybr green 27核 酸 鑒 定 實(shí) 際常 用 操 作 程 序核 酸 定 量 儀 測(cè) 定 濃 度 ，OD260/OD

19、280及 OD260/OD230比 值 。瓊 脂 糖 電 泳 ， UV下 觀 察驗(yàn) 證 純 度 及 判 斷 是 否 降 解 3.2.2 熒 光 光 度 法 鑒 定 核 酸 純 度原 理 ： 溴 化 乙 錠 (EB)等 熒 光 染 料 示 蹤 的 核 酸 電 泳 結(jié) 果 。 基因組DNARNA 28 (1) 對(duì) DNA DNA樣 品 溶 于 pH8.0的 TE， 4 或 -20 保 存 ； 長(zhǎng) 期 保 存 樣 品 中 可 加 入 1滴 氯 仿 。(2) 對(duì) RNA RNA樣 品 溶 于 0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或 雙 蒸 滅 菌 水 中 ，-70 保 存 ; 可 以 沉 淀

20、形 式 貯 于 乙 醇 ， 可 在 -20 中 長(zhǎng) 期 保 存 ; 最 常 用 無(wú) Rnase水 或 高 壓 后 的 DEPC水 溶 解 RNA， 凍 貯 于 -70-80 。3.3 核 酸 的 保 存 TE： Tris-Cl, EDTA 29 4、 核 酸 提 取 方 法 簡(jiǎn) 單 介 紹4.1 基 因 組 DNA的 提 取 方 法4.2 質(zhì) 粒 的 提 取 和 純 化4.3 Trizol法 提 取 總 RNA 30 4.1 基 因 組 DNA的 提 取 方 法4.1.1 酚 抽 提 法以 含 EDTA、 SDS及 RNase的 裂 解 緩 沖 液 裂 解 細(xì) 胞 ，經(jīng) 蛋 白 酶 K處 理

21、后 ， 用 pH8.0的 Tris飽 和 酚 抽 提 。（ DNA） 31 原 理 ：n 在 正 常 情 況 下 ， 核 酸 表 面 覆 蓋 了 一 層 由 水 分 子 組 成 的 親 水n 薄 膜 ， 以 維 持 其 水 溶 性 。 高 濃 度 鹽 離 子 的 加 入 破 壞 了 核 酸n 表 面 親 水 薄 膜 的 相 對(duì) 有 序 排 列 ， 形 成 了 疏 水 環(huán) 境 。 在 此 環(huán)n 境 中 ， 核 酸 與 硅 膠 膜 能 有 效 結(jié) 合 ， 而 蛋 白 質(zhì) 、 代 謝 產(chǎn) 物 和n 其 他 污 染 物 則 不 能 結(jié) 合 。特 點(diǎn) ： n 不 需 要 使 用 有 毒 的 苯 酚 等

22、試 劑 ， 也 不 需 要 乙 醇 沉 淀 等 步 驟 。n 快 速 ， 簡(jiǎn) 捷 。4.1.2 基 因 組 DNA提 取 試 劑 盒 （ 離 心 柱 型 ）常 用 的 試 劑 盒 ： Qiagen 32 裂 解 液 +蛋 白 酶 K裂 解 細(xì) 胞緩 沖 液 GB+乙 醇DNA柱 子 吸 附緩 沖 液 GD去 除 蛋 白漂 洗 液漂 洗 DNA兩 次 洗 脫 液 TE洗 脫 DNA離 心 柱 型基 因 組 DNA提 取 步 驟 33 n 甲 酰 胺 解 聚 法 ： 細(xì) 胞 裂 解 步 驟 與 酚 抽 提 法 一 致 ，但 以 高 濃 度 甲 酰 胺 裂 解 液 裂 解 DNA與 蛋 白 質(zhì)復(fù) 合

23、 體 ， 再 以 透 析 除 去 雜 質(zhì)n 玻 璃 棒 纏 繞 法 ： 將 基 因 組 DNA沉 淀 纏 繞 于 帶鉤 玻 璃 棒 上 帶 出 ， 溶 于 pH8.0的 TEn 異 丙 醇 沉 淀 法n 玻 璃 珠 吸 附 法4.1.3 其 他 的 基 因 組 DNA提 取 方 法 34 n 透 析 ， 沉 淀 ， 電 泳 ， 選 擇 性 沉 淀4.1.4 DNA樣 品 的 進(jìn) 一 步 純 化4.1.5 DNA片 段 的 回 收n原 則 ： 提 高 回 收 率 ， 去 除 雜 質(zhì) 污 染n從 瓊 脂 糖 凝 膠 中 回 收 ： DEAE纖 維 素 膜 插 片 電 泳 法 ， 電 泳 洗 脫 法

24、 冷 凍 擠 壓 法 n從 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 中 回 收 ： 壓 碎 與 浸 泡 35 4.2 質(zhì) 粒 的 提 取 和 純 化n 質(zhì) 粒 的 結(jié) 構(gòu) ： 超 螺 旋 ， 半 開 環(huán) ， 線 性 DNAn 理 化 性 質(zhì) ： 與 一 般 核 酸 相 似 ， 但 抗 切 割 和抗 變 性 能 力 更 強(qiáng)n 所 有 分 離 質(zhì) 粒 DNA的 方 法 都 包 括 3個(gè) 基 本 步 驟 ： 培 養(yǎng) 細(xì) 菌 使 質(zhì) 粒 擴(kuò) 增 ； 收 集 和 裂 解 細(xì) 菌 ； 分 離質(zhì) 粒 DNA(有 時(shí) 還 要 求 純 化 質(zhì) 粒 DNA， 根 據(jù) 實(shí)驗(yàn) 所 需 )。 選 擇 哪 一 種 方 法 主 要 取

25、 決 于 以 下 幾 個(gè) 因 素 ： 質(zhì) 粒 的 大 小 、大 腸 桿 菌 菌 株 、 裂 解 后 用 于 純 化 的 技 術(shù) 和 實(shí) 驗(yàn) 要 求 。 36 4.2.1 質(zhì) 粒 提 取 原 理4.2.2 質(zhì) 粒 DNA的 純 化 與 回 收n 純 化q CsCL-EB法q 聚 乙 二 醇 沉 淀 法q 柱 層 析 法n 回 收 ： 與 基 因 組 DNA類 似 37 4.3 RNA的 分 離 和 純 化n RNA易 被 RNase水 解 ， RNase除 細(xì) 胞 內(nèi) 還 廣 泛 存在 于 人 的 皮 膚 、 唾 液 、 汗 液 及 周 圍 的 環(huán) 境 中n RNase分 子 結(jié) 構(gòu) 中 的 二

26、 硫 鍵 使 其 生 物 學(xué) 活 性 非常 穩(wěn) 定 n 排 除 RNase的 污 染 是 RNA制 備 成 功 與 否 的 關(guān) 鍵 38 4.3.1 RNA制 備 的 條 件 與 環(huán) 境n 潔 凈 的 實(shí) 驗(yàn) 室n 操 作 人 員 帶 口 罩 ， 勤 換 手 套n 玻 璃 器 皿 （ 如 勻 漿 器 ） 、 鑷 子 180 干 烤 8 h或 更 長(zhǎng) 時(shí) 間n 槍 頭 、 EP管 0.1%DEPC水 浸 泡 過(guò) 夜 ， 再 高壓 ； 或 直 接 購(gòu) 買 無(wú) Rnase的 槍 頭 和 EP管n 冰 上 勻 漿 ， 4 離 心 39 n Trizol的 主 要 成 分 是 苯 酚 。 苯 酚 的 主

27、 要 作 用是 裂 解 細(xì) 胞 ， 使 細(xì) 胞 中 的 蛋 白 ， 核 酸 物 質(zhì) 解 聚得 到 釋 放 。 苯 酚 雖 可 有 效 地 變 性 蛋 白 質(zhì) ， 但 不能 完 全 抑 制 RNA酶 活 性 。n Trizol中 還 加 入 了 8 羥 基 喹 啉 、 異 硫 氰 酸 胍 、-巰 基 乙 醇 等 來(lái) 抑 制 內(nèi) 源 和 外 源 RNase（ RNA酶 ） 。4.3.2 Trizol法 提 取 總 RNA 40 Trizol法 提 取 RNA步 驟1、 每 50-100mg 組 織 加 入 1ml Trizol ， 用 勻 漿 器 勻 漿 處 理 ， 室 溫 放置 5min， 使

28、其 充 分 裂 解 。 12,000rpm 離 心 5min， 棄 沉 淀 。2、 加 入 氯 仿 200微 升 每 管 ， 劇 烈 振 蕩 15s ， 室 溫 放 置 2-3 min 。 12000g ,4 ， 離 心 15 min 3、 吸 取 上 層 水 相 (約 400微 升 ） ， 至 另 一 離 心 管 中 。 注 ： 千 萬(wàn) 不 要 吸取 中 間 界 面 ； 若 同 時(shí) 提 取 DNA和 蛋 白 質(zhì) ， 則 保 留 下 層 酚 相 存 于 4冰 箱 ,若 只 提 RNA， 則 棄 下 層 酚 相 。4、 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.5 ml 異 丙 醇 ， 室

29、溫 10min 。 12000g ， 4 ， 10 min ,棄 上 清 ， RNA沉 于 管 底 。5、 加 入 1 mL75%乙 醇 ， 溫 和 振 蕩 離 心 管 ， 懸 浮 沉 淀 。 12000g ,4 ,5min 。 ， 盡 量 棄 上 清 。6、 室 溫 晾 干 或 真 空 干 燥 5-10min。 加 入 20微 升 無(wú) Rnase 水 溶 解 RNA 沉 淀 。 41 除 血 紅 蛋 白 及 某 些 組 蛋 白 外 ， 絕 大 多 數(shù) mRNA在其 3末 端 帶 有 1個(gè) 長(zhǎng) 短 不 一 的 多 聚 核 苷 酸 的 結(jié) 構(gòu) ， 即poly（ A） 尾 巴n olig（ dT）

30、 -纖 維 素 柱 層 析 法n olig（ dT） -纖 維 素 液 相 結(jié) 合 離 心 法n 其 他 方 法 ： 磁 珠 法 生 物 素 標(biāo) 記 的 oligo（ dT） 結(jié) 合 poly（ A） 尾 ， 再 結(jié) 合 親 和 素 標(biāo) 記 的磁 珠4.3.3 mRNA的 分 離 和 純 化 42 找 答 案 DNA recombination DNA recombination technique vector DNA重 組 技 術(shù) 中 常 用 的 工 具 酶 ？ DNA重 組 技 術(shù) 的 基 本 步 驟 ？ DNA重 組 子 的 篩 選 和 鑒 定 的 方 法 有 哪 些 ？ -互 補(bǔ)第

31、六 章 DNA重 組 技 術(shù) 43 DNA重 組 （ DNA recombination） 不 同 來(lái) 源 的 DNA， 通 過(guò) 磷 酸 二 酯 鍵 連 接而 重 新 組 合 成 新 的 DNA分 子 的 過(guò) 程 。 DNA DNA新 的 DNA+ 連 接 組 合 44 DNA重 組 技 術(shù) （ DNA recombination technique）又 稱 分 子 克 隆 或 基 因 工 程 ： 體 外 用 限 制 性 內(nèi) 切 酶 將 不 同 來(lái) 源 的 DNA分子 進(jìn) 行 特 異 地 切 割 水 解 ， 獲 得 目 的 基 因 或DNA片 段 與 載 體 連 接 ， 從 而 組 成 特 異

32、 的 一 個(gè)新 的 DNA分 子 ， 重 組 的 DNA分 子 通 過(guò) 一 定 的方 式 導(dǎo) 入 相 應(yīng) 的 宿 主 細(xì) 胞 ， 在 宿 主 細(xì) 胞 中進(jìn) 行 無(wú) 性 繁 殖 ， 獲 得 大 量 目 的 基 因 或 DNA片段 的 過(guò) 程 。 分 子 水 平 操 作 ， 細(xì) 胞 水 平 表 達(dá) 。 45 切接轉(zhuǎn)分篩 46 重 組 DNA技 術(shù) 的 基 本 步 驟1.載 體 的 選 擇 與 制 備 、 核 酸 的 分 離 分2.目 的 基 因 的 獲 得 切3.目 的 基 因 與 載 體 的 連 接 接4.重 組 DNA分 子 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 轉(zhuǎn)5.篩 選 出 含 重 組 DNA基 因

33、分 子 的 受 體 細(xì) 胞 克 隆 篩6.克 隆 基 因 的 表 達(dá) 及 表 達(dá) 產(chǎn) 物 的 檢 測(cè) 和 分 離 純 化 47 DNA重 組 技 術(shù) 的 開 創(chuàng) 人 1.第 一 個(gè) 實(shí) 現(xiàn) DNA重 組 的 人 Berg 1972年 ， Berg用 E.coR 切 割 SV4 0DNA和 phageDNA， 經(jīng) 過(guò) 連 接 組 成 重 組 的 DNA分 子 。 Berg是 第 一 個(gè) 實(shí) 現(xiàn) DNA重 組 的 人 。 2.第 一 個(gè) 取 得 基 因 工 程 成 功 的 人 Cohen 1973年 ， Cohen Group將 E.coli的 tetr質(zhì) 粒 psclol和ne rsrR6-3質(zhì)

34、 粒 體 外 限 制 酶 切 割 ， 連 接 成 一 個(gè) 新 的 質(zhì) 粒 ，轉(zhuǎn) 化 E.coli， 在 含 四 環(huán) 素 和 新 霉 素 的 平 板 上 篩 選 出 了terrNer,實(shí) 現(xiàn) 了 細(xì) 菌 遺 傳 性 狀 的 轉(zhuǎn) 移 。 這 是 基 因 工 程 史上 的 第 一 個(gè) 克 隆 化 并 取 得 成 功 的 例 子 ， 這 一 年 被 定 為 基因 工 程 誕 生 的 元 年 。 DNA重 組 技 術(shù) 依 賴 于 3大 理 論 ， 3大 技 術(shù) 準(zhǔn) 備 ：（ 一 ） 理 論 上 的 3大 發(fā) 現(xiàn) ：1. 20世 紀(jì) 40年 代 ， Avery發(fā) 現(xiàn) 了 生 物 遺 傳 物 質(zhì) 的 化 學(xué)

35、 本 質(zhì) 是DNA。 超 越 時(shí) 代 的 科 學(xué) 成 就 往 往 不 易 被 人 們 接 受 ， Avery當(dāng) 時(shí) 并 未 贏 得 陣 陣 掌 聲 ， 他 的 論 文 事 隔 10年 以 后 才 公 開 發(fā)表 。2. 20世 紀(jì) 50年 代 ， Watson-crick提 出 了 DNA結(jié) 構(gòu) 的 雙 螺 旋結(jié) 構(gòu) 模 型 ， 搞 清 楚 了 生 物 遺 傳 物 質(zhì) 的 分 子 機(jī) 制 。3. 20世 紀(jì) 60年 代 ， 確 定 了 遺 傳 信 息 的 傳 遞 方 式 ：DNARNAPr,破 譯 了 全 部 遺 傳 密 碼 ， 43。 技 術(shù) 上 的 3大 發(fā) 明 ： 1 “ 基 因 剪 刀

36、” 限 制 性 內(nèi) 切 酶 的 發(fā) 明 （ 1） 20世 紀(jì) 40 60年 代 ， 科 學(xué) 家 們 就 為 基 因 工 程 設(shè) 計(jì)了 美 好 的 藍(lán) 圖 ， 但 是 面 對(duì) 龐 大 的 dsDNA（ 104， 2.2*1011公里 ） 束 手 無(wú) 策 ， 無(wú) 從 下 手 把 它 切 成 單 個(gè) 基 因 片 斷 。 （ 2） 當(dāng) 時(shí) 的 酶 學(xué) 知 識(shí) 已 有 相 當(dāng) 的 發(fā) 展 ， 但 是 沒 有 一 個(gè) 已發(fā) 現(xiàn) 的 酶 能 完 成 這 樣 的 使 命 。 （ 3） 1970年 ， Smith和 Wilcox在 流 感 嗜 血 桿 菌（ Haemophilus inffuenzae） 分 離

37、 純 化 了 Hind ， 取 得 了突 破 ， 打 破 了 基 因 工 程 的 禁 錮 ， 迎 來(lái) 了 改 造 生 物 的 春 天 ，為 基 因 工 程 奠 定 了 最 為 重 要 的 技 術(shù) 基 礎(chǔ) 。 50 2 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 1970年 Baltimove和 Temin等 同 時(shí) 各 自 發(fā) 現(xiàn)了 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 ， 打 破 了 遺 傳 學(xué) （ 生 物 學(xué) ） 中 心 法 則 ， 使 真 核基 因 的 制 備 成 為 可 能 。 （ 原 因 如 下 ） (1)真 核 基 因 組 龐 大 而 復(fù) 雜 ， 不 易 制 得 基 因 圖 譜 。HGP2005年 完 成 ， 2.8萬(wàn) 個(gè) 基 因

38、 ， 1 3kb/基 因 ， 104，2.2*1011公 里 。 （ 2） 即 使 有 了 基 因 圖 譜 ， 因 為 真 核 基 因 有 內(nèi) 含 子 ， 不 能在 原 核 表 達(dá) 系 統(tǒng) 剪 接 出 mRNA， 沒 有 成 熟 的 mRNA就 不 能得 到 相 應(yīng) 得 產(chǎn) 物 。 （ 3） 經(jīng) 過(guò) 逆 轉(zhuǎn) 錄 mRNAcDNA (complementory DNA)文庫(kù) 要 比 基 因 組 文 庫(kù) 小 得 多 ， 所 以 篩 選 陽(yáng) 性 克 隆 就 方 便 得 多 。 有 了 這 些 理 論 核 技 術(shù) 的 武 裝 ， 基 因 工 程 的 臨 盆 降 生 指日 可 待 ， Berg和 Coh

39、en兩 位 科 學(xué) 的 “ 助 產(chǎn) 士 ” ， 把 基 因 工 程接 到 了 人 間 。 3 載 體 (“交 通 工 具 車 子 ” ) 基 因 工 程 技 術(shù) 誕 生 的 第 二個(gè) 技 術(shù) 準(zhǔn) 備 （ 1） 有 了 切 割 與 縫 合 （ ligase） 基 因 DNA的 工 具 ， 還得 有 一 個(gè) 車 子 （ 富 康 ） 將 重 組 DNA送 到 宿 主 細(xì) 胞 中 去 。 （ 2） 1946年 起 ， Lederberg就 研 究 細(xì) 菌 性 因 子 （ F因子 ） .50-60年 代 相 繼 發(fā) 現(xiàn) 了 R因 子 （ 抗 藥 因 子 ） ， CoE(大腸 桿 菌 因 子 )等 質(zhì) 粒

40、 。 （ 3） 然 而 ， 直 到 1973年 Cohen才 能 將 質(zhì) 粒 作 為 基 因 工程 載 體 使 用 （ 至 今 一 直 是 基 因 工 程 最 重 要 最 廣 泛 使 用 的 載體 ） 。 這 是 基 因 工 程 的 第 二 個(gè) 技 術(shù) 準(zhǔn) 備 。 工 具 酶常 用 的 工 具 酶 （ tool enzymes） 有 ： 1.限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 （ resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA連 接 酶 （ DNA ligase,ligase)3.逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 (reverse transcriptase)4.D

41、NA聚 合 酶 (DNA polymerase,DNA pol)5.核 酸 酶 (nuclease)6.末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 (terminal transferase)7.堿 性 磷 酸 酶 (BAP或 CIP)以 1. 和 2. 最 為 常 用 ， 最 為 重 要 。 工 具 酶 現(xiàn) 已 商 品 化 。第 一 節(jié) 常 用 工 具 酶 一 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 （ 一 ） 限 制 酶 的 概 念 （ 定 義 ， 分 類 ， 命 名 ， 限 制 與 修 飾 辨 正關(guān) 系 ） 1.定 義 限 制 性 內(nèi) 切 酶 （ restriction endonuclease, restrction

42、 enzymes） ： 簡(jiǎn) 稱 限 制 酶 ， 識(shí) 別 和 切 割 雙 鏈 DNA分 子 特 異 序列 的 核 酸 水 解 酶 。 具 有 識(shí) 別 和 切 割 dsDNA的 功 能 。 所 謂 限 制 （ restriction） =切 割 （ clearage） =水 解（ hydrolysis） 該 部 位 的 核 苷 鍵 （ 磷 酸 二 酯 鍵 ） 54 2.分 類 限 制 酶 都 是 從 原 核 生 物 中 發(fā) 現(xiàn) 的 （ 400多種 E/350M） 。 所 有 的 限 制 酶 可 分 成 3類 。 （ 1） 、 類 兼 具 限 制 與 修 飾 活 性 ， 它 們 識(shí) 別 與 切 割

43、順 序 不在 一 個(gè) 地 方 ， 不 產(chǎn) 生 特 異 性 的 DNA片 段 ， 與 基 因 工程 意 義 不 大 （ 有 說(shuō) 型 識(shí) 別 核 切 割 的 位 點(diǎn) 一 致 ， 但罕 見 ） 。 （ 2） 類 基 因 工 程 說(shuō) 到 的 限 制 酶 是 型 酶 ， 具 有 此 類 酶的 微 生 物 限 制 修 飾 系 統(tǒng) 分 別 由 限 制 酶 和 甲 基 化 酶來(lái) 完 成 。 型 酶 分 子 量 小 ， 僅 需 Mg 2 作 為 催 化 反應(yīng) 的 輔 因 子 ， 識(shí) 別 與 切 割 位 點(diǎn) 相 同 ， 產(chǎn) 生 特 異 的DNA片 段 。 3. 命 名 （ 1973年 Smith 原 則 、 類

44、酶 ， 斜 體 字 母 表 示 ）根 據(jù) 分 離 此 酶 微 生 物 的 學(xué) 名 ， 一 般 取 3個(gè) 字 母 。第 一 個(gè) 字 母 大 寫 - 該 微 生 物 屬 名 前 的 第 一 個(gè) 字 母第 二 、 三 個(gè) 字 母 小 寫 - 該 微 生 物 種 名 前 的 2個(gè) 字 母第 四 個(gè) 字 母 大 寫 - 有 變 種 或 株 系 的 第 一 個(gè) 字 母羅 馬 字 母 、 、 - 從 一 種 微 生 物 中 發(fā) 現(xiàn) 了 幾 種 限 制 酶 ， 按 發(fā) 現(xiàn) 順 序 排 列 如 EcoR 是 指 從 大 腸 桿 菌 （ Escherichia coli） R株分 離 得 到 的 第 一 種 限

45、制 酶 。 (二 )限 制 酶 的 識(shí) 別 位 點(diǎn) 它 能 識(shí) 別 dsDNA的 4 6bp的 回 文 序 列并 水 解 該 部 分 的 核 苷 鍵 。 一 般 來(lái) 說(shuō) 是 4 6bp， 有 6個(gè) 以 上 的 ， 但 沒 有 4個(gè) 以 下的 。 回 文 結(jié) 構(gòu) ： 57 Bam HGTCCAG GCCTAG GATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平 端 切 口 粘 端 切 口識(shí) 別 順 序 呈 二 重 對(duì) 稱 ， 即 1800旋 轉(zhuǎn) 對(duì) 稱 。 58GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC G Bam H GGATCCCCTAGG GCCT

46、AG GATCC GBst 同 功 異 源 酶 ：來(lái) 源 不 同 的 限 制 酶 ， 能 識(shí) 別 和 切 割 同 一 位 點(diǎn) ， 這些 酶 稱 同 功 異 源 酶 。 59 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G ATCTAG GATCT A 同 尾 酶 ：有 些 限 制 性 內(nèi) 切 酶 雖 然 識(shí) 別 序 列 不 完 全 相 同 ， 但切 割 DNA后 產(chǎn) 生 相 同 的 粘 性 末 端 ， 稱 為 同 尾 酶 。 60 （ 三 ） 限 制 性 內(nèi) 切 酶 的 活 力 單 位 和星 號(hào) 活 力 1. 酶 活 力 單 位 在 合 適 溫 度 、 pH

47、值 和 離 子 強(qiáng) 度 等 條 件 下 ， 1小 時(shí) 內(nèi) 完全 消 化 1g特 異 DNA底 物 所 需 的 酶 量 ， 定 義 為 一 個(gè) 活 力單 位 。 2.星 號(hào) 活 性 限 制 性 內(nèi) 切 酶 在 非 標(biāo) 準(zhǔn) 反 應(yīng) 條 件 下 ， 對(duì) 識(shí) 別 序 列 的 特異 性 下 降 ， 能 切 割 一 些 與 特 異 識(shí) 別 順 序 類 似 的 序 列 ，一 般 在 酶 的 右 上 角 加 “ *” 表 示 克 隆 過(guò) 程 中 需 同 時(shí) 進(jìn) 行 雙 酶 切 時(shí) ， 應(yīng) 選 用 二 種 酶 都 能 接 受 的 反 應(yīng) 緩 沖 體 系 ， 否 則 可 能 影 響 酶 的 特 異 性 61 （

48、四 )注 意 事 項(xiàng) 底 物 DNA不 能 含 有 痕 量 的 酚 、 氯 仿 和 乙 醚 溶 液 中 不 能 含 SDS和 過(guò) 量 的 鹽 ， EDTA的 含 量 不能 大 于 10mmol/L 反 應(yīng) 緩 沖 體 系 中 一 般 可 加 入 2-巰 基 乙 醇 或 二 硫蘇 糖 醇 ， 防 止 含 巰 基 酶 的 氧 化 失 活 加 入 牛 血 清 白 蛋 白 穩(wěn) 定 酶 活 性 操 作 時(shí) 應(yīng) 注 意 混 勻 反 應(yīng) 體 系 62 (六 ) 甲 基 化 酶1.細(xì) 菌 的 限 制 修 飾 系 統(tǒng) 限 制 （ 降 解 ） 外 來(lái) DNA， 并 通 過(guò) 對(duì) 自 身 DNA的 修 飾 而起 保

49、護(hù) 作 用 。2.甲 基 化 酶 的 應(yīng) 用 當(dāng) 制 備 克 隆 用 雙 鏈 cDNA時(shí) ， 外 源 DNA片 段 可 用 EcoR 甲 基 化 酶 處 理 ， 使 雙 鏈 cDNA內(nèi) 部 EcoR 位 點(diǎn) 因 甲基 化 受 到 保 護(hù) 而 不 被 切 割 二 DNA連 接 酶 ： DNA連 接 酶 是 基 因 工 程 第 二 位 重 要 的 工 具 酶 ， 常 用 T4DNA ligase. （ 一 ） 功 能 ： 催 化 有 互 補(bǔ) 順 序 的 兩 個(gè) dsDNA分 子 的 粘 性 末 端 或 平 頭 末 端 3 OH、 5 P連 接 作 用 （ 只 能 作 用 于 雙 鏈 DNA分 子

50、內(nèi) 或 兩 個(gè) 雙 鏈DNA分 子 間 ， 不 能 將 二 個(gè) 單 鏈 DNA分 子 連 接 。 ) （ 二 ） 來(lái) 源 噬 菌 體 T4感 染 Ecoli分 離 的 一 種 單 鏈 多 肽 酶 、 MW.68K D。 （ 三 ） 催 化 反 應(yīng) ： （ 1） 需 要 ATP、 Mg 2+作 輔 助 因 子 ； （ 2） 最 適 pH值 為 7.2-7.4。 （ 3） 對(duì) 粘 性 末 端 催 化 活 性 大 于 平 頭 末 端 （ 酶 量 1： 100） 64 三 、 分 子 克 隆 中 常 用 的 其 他 酶1.逆 轉(zhuǎn) 錄 酶2.Taq DNA聚 合 酶 （ 目 的 DNA片 段 3 端 加

51、 A， 用 于 A T克 隆 ）3.T4多 核 苷 酸 激 酶4.末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 （ 脫 氧 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 ）5.堿 性 磷 酸 酶6.DNA聚 合 酶 7.Klenow片 段 （ DNA聚 合 酶 大 片 段 ） 一 、 載 體 （ vector） 的 概 念 攜 帶 靶 DNA（ 目 的 DNA） 片 段 進(jìn) 入 宿 主 細(xì)胞 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 和 表 達(dá) 的 運(yùn) 載 工 具 ?；?因 工 程 所 用 的 vector實(shí) 際 上 是 DNA分 子 ， 可 以 被 插 入DNA片 段 。第 二 節(jié) 常 用 載 體 二 、 載 體 的 分 類分 類 依 據(jù) 類 別 克 隆

52、擴(kuò) 增 或 表 達(dá) 舉 例1.按 功 能 分 成 （ 1） 克 隆 載 體（ 2） 表 達(dá) 載 體 PBR322PCDN32.按 進(jìn) 入 受 體 細(xì) 胞 類型 分 （ 1） 原 核 載 體（ 2） 真 核 載 體（ 3） 穿 梭 載 體 PUC8PBUDCE41YE3.按 載 體 來(lái) 源 分 質(zhì) 粒 載 體 、 病 毒 載體 、 噬 菌 體 載 體 等4.按 克 隆 片 段 得 大 小 （ 克 隆 能 力 ） 分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb(4)50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb ( 1 ) M 1 3 (2)plasmid(3) phage(4)cas

53、mid( 5 ) B A C (6)YAC 三 、 載 體 應(yīng) 具 備 的 特 征 ：1) 載 體 必 須 具 有 自 我 復(fù) 制 和 表 達(dá) 的 能 力2) 載 體 不 能 過(guò) 大 ， 以 便 于 容 納 較 大 的 外 源 DNA片 段3) 具 有 合 適 的 酶 切 位 點(diǎn)4) 具 有 兩 個(gè) 以 上 的 遺 傳 選 擇 標(biāo) 記 ， 便 于 區(qū) 別 陽(yáng) 性 和 陰 性 克隆5) 配 備 有 與 宿 主 相 適 應(yīng) 的 調(diào) 控 原 件 ， 如 啟 動(dòng) 子 等 68 1、 質(zhì) 粒 載 體 質(zhì) 粒 載 體 是 應(yīng) 用 最 廣 的 載 體 嚴(yán) 緊 型 質(zhì) 粒 （ strigent plasmid

54、） 和 松 弛 型 質(zhì) 粒 （ relaxed plasmid） 基 因 工 程 使 用 松 弛 復(fù) 制 子 ， 以 獲 得 更 多 的 基 因 產(chǎn) 品 。 松 弛 復(fù) 制 子 的 特 點(diǎn) ： 復(fù) 制 不 受 宿 主 細(xì) 菌 復(fù) 制 系 統(tǒng) 的 限 制 ， 當(dāng) 宿 主 蛋 白 質(zhì) 合 成 受到 抑 制 （ 如 培 養(yǎng) 中 加 入 氯 霉 素 時(shí) ） 其 拷 貝 數(shù) 猛 增 至 0003000之 多 ， 該 性 質(zhì) 多 基 因 工 程 技 術(shù) 十 分 有 利 。 69 1、 質(zhì) 粒 載 體 的 原 件 構(gòu) 成1) Ori 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) （ origin， ori）2) 抗 生 素 抗 性

55、基 因3) MCS多 克 隆 位 點(diǎn) 70 載 體 本 身 必 須 是 一 個(gè) 復(fù) 制 單 位 即 復(fù) 制 子 ， 具 有 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) 。（ 1） 決 定 質(zhì) 粒 自 我 增 殖 和 拷 貝 數(shù) 的 主 要 元 件 。（ 2） 使 細(xì) 胞 繁 殖 后 維 持 一 定 量 的 質(zhì) 粒 拷 貝 數(shù) 。（ 3） 一 般 情 況 下 ， 一 個(gè) 質(zhì) 粒 只 含 一 個(gè) ori， 構(gòu) 成 一 個(gè) 獨(dú) 立 的復(fù) 制 子 。（ 4） 穿 梭 質(zhì) 粒 含 原 核 和 真 核 生 物 2個(gè) 復(fù) 制 子 ， 以 確 保 兩 類 細(xì)胞 中 都 能 擴(kuò) 增 。（ 5） 基 因 工 程 使 用 松 弛 復(fù) 制

56、子 ， 以 獲 得 更 多 的 基 因 產(chǎn) 品 。復(fù) 制 子 -是 一 段 包 括 復(fù) 制 起 始 位 點(diǎn) ， 反 式 因 子 作 用 在 內(nèi) 的 DNA片 段 ， 其 功 能 是 通 過(guò) 復(fù) 制 使 質(zhì) 粒 能 穩(wěn) 定 存 在 宿 主 菌 內(nèi) 。 1) Ori 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) （ origin， ori） 71 2) 抗 生 素 抗 性 基 因genotype 編 碼 產(chǎn) 物 功 能 （ phenotype）Ampr 酶 水 解 內(nèi) 酰 胺 環(huán) ， 解 除 氨 芐 的 毒 性tetr 1個(gè) 膜 蛋 白 可 以 阻 止 四 環(huán) 素 進(jìn) 入 細(xì) 胞camr 乙 酰 轉(zhuǎn) 乙 酶 生 成 氯 霉

57、 素 羥 乙 酰 基 衍 生 物 ， 使 之 失去 毒 性neo r（ kanr） 氨 基 糖 苷 磷 酸 轉(zhuǎn)移 酶 使 G418、 新 霉 素 、 卡 那 霉 素 失 活hygr 潮 霉 素 磷 酸 轉(zhuǎn)移 酶 使 潮 霉 素 失 活 72 是 多 個(gè) 限 制 酶 識(shí) 別 的 一 段 DNA順 序 ， 以便 克 隆 /插 入 外 源 基 因 /DNA片 段3) MCS多 克 隆 位 點(diǎn)（ multiple cloining site， MCS） 克 隆 載 體 元 件 以 及 性 質(zhì) E coli表 達(dá) 載 體 哺 乳 動(dòng) 物 質(zhì) 粒 細(xì) 胞 表 達(dá) 載 體1. Ori 能 在 受 體 細(xì) 胞

58、 中 復(fù) 制 ， 含 有 復(fù) 制 位 點(diǎn) （ 起 點(diǎn) ）2. Ampr 抗 生 素 抗 性 基 因 可 以 便 利 加 以 檢 測(cè)3. MCS 多 克 隆 位 點(diǎn) ， 克 隆 攜 帶 外 源 基 因 片 段 4. 載 體 可 導(dǎo) 入 宿 主 細(xì) 胞 （ 生 物 學(xué) /非 生 物 學(xué) 方 法 ） 1. Ori2.Ampr3.Mcs4. Promoter5. SDs Rbs 6.Terms7.可 導(dǎo) 入 E.coli 1.orip 在 E.coli中 能 作 復(fù) 制 起始 位 點(diǎn)2.Ampr 細(xì) 菌 抗 生 素 抗 性 基 因3.K anr 真 核 細(xì) 胞 （ 哺 乳 類 ） 藥物 抗 性 基 因

59、4.Orie 真 核 細(xì) 胞 復(fù) 制 起 始 位 點(diǎn)5.Mcs 多 克 隆 位 點(diǎn)6. P/E 啟 動(dòng) 子 /增 強(qiáng) 子7. Terms 終 止 信 號(hào)8. 加 poly（ A） 信 號(hào)9. 可 導(dǎo) 入 真 核 細(xì) 胞 （ 哺 乳 類 ）（ 7 8別 為 轉(zhuǎn) 錄 翻 譯 終 止 密 碼， 真 核 細(xì) 胞 表 達(dá) 元 件 。 ）克 隆 載 體 和 表 達(dá) 載 體 的 元 件 構(gòu) 成 理 想 的 克 隆 載 體 的 特 點(diǎn)1. 具 有 松 弛 型 復(fù) 制 子 （ ori）2. 在 復(fù) 制 子 外 存 在 數(shù) 個(gè) 單 一 的 酶 切 位 點(diǎn) （ 多 克 隆 位 點(diǎn) ）3. 具 有 插 入 失 活 的

60、 篩 選 標(biāo) 志 （ 抗 性 基 因 ）4. 分 子 量 較 小 和 較 高 的 拷 貝 數(shù) 75 LacZ基 因 ： 大 腸 桿 菌 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 編 碼 -肽 鏈 的 DNA序 列乳 糖 半 乳 糖 葡 萄 糖X-gal 5-溴 化 氯 淀 藍(lán)半 乳 糖 深 藍(lán) 色-半 乳 糖 苷 酶 +互 補(bǔ) ： 載 體 中 的 LacZ基 因 編 碼 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 的 -肽 段 ， 突 變 型 lac-E.coli宿 主 可 表 達(dá) 該 酶 的 肽 段 （ -肽 段 缺 失 ） ， 只 有 宿 主 和 載 體 同 時(shí) 表 達(dá) 這 兩個(gè) 片 段 形 成 互 補(bǔ) 時(shí) ， 才

61、 具 有 -半 乳 糖 苷 酶 活 性 。 76 2、 噬 菌 體 載 體 溶 菌 性 周 期 溶 源 性 周 期 77gt10（ 插 入 型 ） 結(jié) 構(gòu)Cos： Coshesive end site 可 互 補(bǔ) 的 粘 性 末 端 ， 當(dāng) 噬 菌 體 侵 入 宿 主 細(xì) 胞 后 ，線 狀 DNA分 子 借 助 粘 性 末 端 連 結(jié) 成 環(huán) 狀 分 子 。 (1)噬 菌 體 載 體 小 分 子 外 源 DNA片 段 78 (2) 黏 粒 載 體 （ 又 名 柯 斯 質(zhì) 粒 ）黏 粒 質(zhì) 粒 ：由 質(zhì) 粒 和 噬 菌 體的 cos黏 性 末 端 構(gòu)建 而 成 。 79 (3) 單 鏈 噬 菌

62、體l胞 內(nèi) 為 雙 鏈 ， 胞 外 為 單 鏈 。l復(fù) 制 型 為 雙 鏈 環(huán) 狀 DNA，可 按 細(xì) 菌 質(zhì) 粒 使 用 。l單 鏈 可 用 作 測(cè) 序 、 制 備 探針 等 。 3、 穿 梭 載 體 定 義 ： 在 原 核 生 物 載 體 的 基 礎(chǔ) 上 進(jìn) 行 適當(dāng) 的 改 造 ， 構(gòu) 建 出 同 時(shí) 帶 有 兩 種 細(xì) 胞（ 原 核 生 物 細(xì) 胞 和 真 核 生 物 細(xì) 胞 ） 的 復(fù)制 起 始 點(diǎn) ， 并 可 在 兩 種 細(xì) 胞 中 復(fù) 制 和 存在 的 載 體 。 80（ 二 ） 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載 體l病 毒 基 因 組 自 身 含 有 完 整 高 效 的 調(diào) 控 元 件l

63、病 毒 可 通 過(guò) 主 動(dòng) 感 染 方 式 進(jìn) 入 宿 主 細(xì) 胞 ， 并 能 有 效 地 整合 到 宿 主 染 色 體 基 因 組 中 ， 與 染 色 體 一 起 復(fù) 制 、 長(zhǎng) 期 存在l逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 作 為 載 體 需 要 相 應(yīng) 的 外 包 裝 ， 以 形 成 完 整 的體 系 最 常 用 的 穿 梭 載 體 ：（ 一 ） SV40（ 猿 猴 病 毒 ） 載 體l 用 SV40 DNA與 外 源 DNA構(gòu) 建 重 組 子 ， 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 后 允 許 細(xì) 胞形 成 含 外 源 DNA的 病 毒 顆 粒l 重 組 子 不 包 裝 成 病 毒 顆 粒 ， 而 在 細(xì) 胞 中 復(fù) 制

64、 或 整 合 到 染色 體 組 中 81 4、 人 工 染 色 體 酵 母 人 工 染 色 體 （ YAC） 細(xì) 菌 人 工 染 色 體 （ BAC） 噬 菌 體 P1衍 生 的 人 工 染 色 體 （ PAC） 哺 乳 動(dòng) 物 人 工 染 色 體 （ MAC） 82 YAC主 要 調(diào) 控 元 件 著 絲 粒 ： 保 證 染 色 體 細(xì) 胞 分 裂 過(guò) 程 中 正 確 分 配 到子 代 細(xì) 胞 端 粒 ： 防 止 染 色 體 被 核 酸 外 切 酶 降 解 復(fù) 制 起 始 點(diǎn)和 限 制 性 內(nèi) 切 酶 位 點(diǎn) 篩 選 標(biāo) 志 ： 酵 母 中 一 般 通 過(guò) 色 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 組氨

65、 酸 或 尿 嘧 啶 的 合 成 基 因 產(chǎn) 物 插 入 失 活 而 進(jìn) 行 篩選 原 核 序 列 及 調(diào) 控 元 件 ： 包 括 大 腸 桿 菌 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) 、Amp r基 因 等 83 YAC作 為 載 體 的 主 要 特 點(diǎn) 酵 母 是 單 細(xì) 胞 真 核 生 物 ， 培 養(yǎng) 方 便 酵 母 的 真 核 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 錄 系 統(tǒng) ， 有 利 于 表 達(dá) 真 核 生 物基 因 裝 載 容 量 大 ， 可 達(dá) Mbp水 平 DNA片 段 連 接 到 YAC載 體 的 （ 兩 ） 臂 上 形 成 重 組 體 ，將 重 組 體 通 過(guò) 常 規(guī) 方 法 導(dǎo) 入 酵 母 已 廣 泛 應(yīng) 用 于

66、 各 種 生 物 基 因 組 計(jì) 劃 84 基 因 工 程 前 考 慮 的 4個(gè) 問(wèn) 題 ： (1)基 因 工 程 的 目 的 克 隆 擴(kuò) 增 /表 達(dá) : 生 產(chǎn) 產(chǎn) 品 基 因 治 療 (2)克 隆 片 段 的 大 小 運(yùn) 載 多 大 重 量 的 車 子 。 (3)受 體 細(xì) 胞 類 型 真 核 /原 核 /穿 梭 。 (4)載 體 本 身 及 其 元 件 的 質(zhì) 量 不 能 搞 成 “ 豆 腐 渣 工 程 ” ， 要 “ 強(qiáng) 大 陣容 ” 。 85 第 三 節(jié) DNA重 組 與 鑒 定DNA重 組 技 術(shù)將 不 同 來(lái) 源 的 DNA分 子 進(jìn) 行 特 異 地 切 割獲 得 的 目 的 基 因 或 DNA片 段 與 載 體 連 接重 組 的 DNA分 子 導(dǎo) 入 相 應(yīng) 的 宿 主 細(xì) 胞在 宿 主 細(xì) 胞 中 進(jìn) 行 無(wú) 性 增 殖 86 一 、 目 的 片 段 與 載 體 連 接二 、 轉(zhuǎn) 化 或 轉(zhuǎn) 染三 、 篩 選 重 組 子重 組 DNA技 術(shù) 的 基 本 過(guò) 程 DNA連 接 酶 酶 促 生 化 反 應(yīng)連 接 反 應(yīng) 的 最 適 合 溫 度 是 1216度外 源 目