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1、第二章 基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,第一節(jié) 基因工程基礎(chǔ),（一）基因工程的定義 1.基因（gene） DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)最小功能單位。 2.基因組（geneome） 一個生物體的全部基因序列。,一、基因工程的定義、基本操作程序,3.基因表達（gene expression） 遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。 （1）轉(zhuǎn)錄。在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA的過程。 （2）翻譯。在RNA的控制下，根據(jù)核苷酸鏈上每三個核苷酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈過程。 （3）逆轉(zhuǎn)錄。以RNA為模板，按照RN
2、A中的核苷酸順序合成DNA的過程。,4.重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technique） 利用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同的DNA進行體外切割、連接構(gòu)成新的DNA分子的技術(shù)。 5.基因工程（gene engineering） 運用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同DNA進行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細胞進行克隆、表達，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。 6.食品基因工程 利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食
3、品的營養(yǎng)價值、貯藏價格性狀以及感官性狀的技術(shù)。,（二）基因工程的基本操作程序 1.運用合適的方法從生物體中分離或通過化學(xué)合成制備目的基因。 2.采用合適的方法將目的基因與合適的載體進行體外連接，構(gòu)建重組DNA。 3.利用合適的方法將重組DNA導(dǎo)入受體生物細胞以獲得轉(zhuǎn)化體。 4.采用合適的方法篩選出重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆。 5.運用合適的方法對重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆進一步分析以及操作，使目的基因在受體生物細胞中高效表達。,（三）基因工程的三大理論和三大技術(shù)基礎(chǔ) 1.三大理論基礎(chǔ) （1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。 （2）1950年代Watson
4、和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)及DNA半保留復(fù)制機理。 （3）1960年代Crick關(guān)于遺傳中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNARNA蛋白質(zhì)方向進行傳遞。 2.三大技術(shù)基礎(chǔ) （1）如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來（限制性內(nèi)切核酸酶）。 （2）如何將獲得的基因片段進行連接（DNA連接酶）。 （3）如何將切割下來的基因片段進行繁殖擴增（基因載體）。,二、基因工程的工具酶,工具酶：基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、連接酶等）作為工具來對基因進行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶。,（一）限制性內(nèi)切核酸酶與DNA甲基化酶 1
5、.限制作用與修飾作用 限制作用（restriction）：指一定類型的細菌可以通過其限制性內(nèi)切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的現(xiàn)象。 修飾作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用下，生物體自身DNA分子在特定堿基的特定位置上發(fā)生甲基化而得到修飾，從而免遭自身限制性內(nèi)切核酸酶降解的現(xiàn)象。,2.限制性內(nèi)切核酸酶與DNA甲基化酶 限制性內(nèi)切核酸酶（restriction endonuclease）：簡稱限制酶，指一類能夠識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。 DNA甲基化酶（DNA methylase）：簡稱甲基化酶，指一類能
6、夠識別DNA特定序列，并在其特定堿基的特定位置上引入甲基而發(fā)生修飾作用的酶。,3.限制性內(nèi)切核酸酶的類型 （1）型。由三種不同亞基組成；輔助因子為ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸；切割位點距其識別位點至少1 000bp；切割作用隨機。型限制酶不宜作為基因工程的工具酶。 （2）型。由兩個相同亞基組成；輔助因子僅為Mg2+；識別位點常具旋轉(zhuǎn)對稱性；切割位點與其識別位點重疊或在其附近；切割作用特異性強。型限制酶是基因工程理想的工具酶。 （3）型。由兩種不同亞基組成；輔助因子為ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位點一般在距其識別位點3端2426bp處。型限制酶在基因工
7、程中也不常用。,限制性內(nèi)切核酸酶沒有種屬特異性，即限制性內(nèi)切核酸酶識別、切割特定序列的能力同底物DNA的來源無關(guān)，它可識別、切割各種來源的DNA。 DNA甲基化酶具有種屬特異性，生物體的DNA甲基化酶只修飾保護自己的DNA，而不修飾保護非己的DNA。生物體的限制性內(nèi)切核酸酶不能降解自身被修飾保護的DNA，而只能降解外源的DNA。,表4-1 限制性內(nèi)切核酸酶的類型及主要特性,4.型限制性內(nèi)切核酸酶的切割方式 在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成雙鏈平齊末端。 在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從3端切斷磷酸二酯鍵，形成3-羥基端25個核苷酸突出單鏈黏性末端。
8、 在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從5端切斷磷酸二酯鍵，形成5-磷酸端25個核苷酸突出單鏈黏性末端。,5.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的主要因素 （1）底物DNA制備物的純度 蛋白質(zhì)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。 （2）底物DNA的甲基化程度 dam甲基化酶：特異地催化DNA分子中5GATC3序列中的腺嘌呤N7位置的甲基化。 dcm甲基化酶：催化DNA分子中5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位置的甲基化。,（3）底物DNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)型 環(huán)狀雙螺旋DNA較線性DNA穩(wěn)定。在用限制酶酶
9、解同樣分子質(zhì)量的DNA時，環(huán)狀雙螺旋DNA所需酶量為線性DNA所需酶量的1020倍。 （4）酶反應(yīng)緩沖液的組成 酶反應(yīng)體系中常含MgCl2、NaCl或KCl、三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl、-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）等。Tris-HCl的作用在于使反應(yīng)液的pH值穩(wěn)定于酶活性所要求的最佳范圍內(nèi)，而后三者均有穩(wěn)定酶的作用。,（5）酶反應(yīng)的最適溫度 大多數(shù)限制酶反應(yīng)的最適溫度為37，少數(shù)限制酶反應(yīng)的最適溫度高于或低于此溫度。反應(yīng)溫度高于或低于其最適溫度，酶的活力均會下降。應(yīng)根據(jù)各限制酶反應(yīng)的最適溫度作相應(yīng)調(diào)整。,6.限制酶的主要用途 （1）在特異位點上切割DN
10、A，產(chǎn)生特異的限制酶切割的DNA片段。 （2）建立DNA分子的限制酶圖譜。 限制酶圖譜（restriction map）:指一系列限制酶的特異識別序列在DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對位置。 （3）構(gòu)建基因文庫。 基因工程中，將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料，稱為基因文庫（gene library） （4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。,（二）DNA聚合酶 依賴于DNA的DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶（全酶）；大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段
11、）、耐熱的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）等。 依賴于RNA的DNA聚合酶（即逆轉(zhuǎn)錄酶） 優(yōu)先以RNA為模板，也可以DNA為模板。逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板催化合成雙鏈DNA。 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶） 不以DNA或RNA為模板，而只是將核苷酸加到已有DNA分子的末端。,DNA聚合酶作用的條件 （1）要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA，接受模板指導(dǎo)，產(chǎn)物的性質(zhì)與模板編碼相同。 （2）不能起始合成新的DNA鏈，要有引物3-羥基的存在。 （3）催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-羥基末端。 （4）催化DNA合成的方向是53 。,1.大腸桿菌DNA
12、聚合酶（全酶） 一種從大腸桿菌中分離出的一條分子質(zhì)量為109KDa的多肽鏈（球蛋白）。 具有三種活性：53DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3自由羥基的DNA片段為引物；53外切核酸酶活性，從5端既降解雙鏈DNA，也降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈（RNA酶H活性）；35外切核酸酶活性，底物為帶3自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。 主要用于：以切刻平移法標(biāo)記DNA；對DNA分子的3突出尾進行末端標(biāo)記。,2.大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段） 一條分子質(zhì)量為76KDa的多肽鏈，一般由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶水解獲得，也可通過克隆技術(shù)獲得。 具有
13、兩種活性：53DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3自由羥基的DNA片段為引物。35外切核酸酶活性，底物為帶3自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。,3.Taq DNA聚合酶 最初來源于水生棲熱菌（Thermus aquaticus），現(xiàn)可由基因工程途徑來生產(chǎn)。分子質(zhì)量為65KDa，是一種非常耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。 具有一種活性：53DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3自由羥基的DNA片段為引物。 主要用于：對DNA進行測序。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增。,4.逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RN
14、A的DNA聚合酶） 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種來自禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條多肽鏈組成，分子質(zhì)量為170KDa。一種來自鼠白血病病毒（MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌，由單鏈多肽組成，分子質(zhì)量為84KDa。 具有兩種活性：53DNA聚合酶活性，以RNA或者DNA為模板，以帶3自由羥基的RNA或DNA片段為引物。RNA酶H活性，即53 外切核糖核酸酶活性，特異地降解RNA-DNA雜交體中的RNA。 逆轉(zhuǎn)錄酶無35外切核酸酶活性，即無校對功能，其催化的聚合反應(yīng)容易出錯。,5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶） 來源于小牛胸腺，分子質(zhì)量為60KDa，是一種不需要模板的特殊的DNA聚合酶
15、。 具有一種活性：即末端轉(zhuǎn)移酶活性，在二價陽離子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3-羥基端。 主要用于：給載體DNA或cDNA加上互補的同聚尾。以32P標(biāo)記的一種dNTP或一種rNTP來標(biāo)記DNA片段的3端。,（三）連接酶、磷酸酶 1.T4噬菌體DNA連接酶 來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，分子質(zhì)量為68KDa。 具有一種活性：即催化DNA的5磷酸基與3羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶的核酸底物為黏性末端DNA、平齊末端DNA等。 主要用于：連接帶匹配黏性末端的DNA分子。使平齊末端的雙鏈DNA分子互相連接或與合成接頭相連接。,2.堿性磷酸酶 來源于大腸桿菌及牛小腸。包括細菌堿
16、性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。 具磷酸酶活性，催化去除5磷酸的反應(yīng)。底物為單鏈或雙鏈DNA及RNA、dNTP。 主要用于：在用32P標(biāo)記5末端前，去除DNA或RNA分子的5磷酸。去除DNA片段5磷酸，以防自身環(huán)化。,三、基因工程的載體,載體（vector）：攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具?；蚬こ梯d體的特性: （1）能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。在插入外源基因后，仍然保持著穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。 （2）易于從宿主細
17、胞中分離，并進行純化。 （3）DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點，最好是單一酶切位點，并位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復(fù)制。 （4）具有能夠觀察到的表型特征，在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇的標(biāo)志。,載體的報告基因（標(biāo)記基因）：基因工程中利用載體上引入的一些具有特殊標(biāo)志意義的基因，可用來證明載體已經(jīng)進入宿主細胞，并可用來將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑選出來，這種具有標(biāo)志意義的基因稱為報告基因（reporter gene）或標(biāo)記基因。 最常用的報告基因有抗藥性基因（例如，抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉
18、素等抗生素抗性基因）， 此外，還有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT基因）、 -半乳糖苷酶基因（lacZ）、-球蛋白基因和人生長激素基因等。,按照介導(dǎo)的作用目的，可將基因工程載體主要分為克隆載體和表達載體。 克隆載體：有一個松弛性復(fù)制系統(tǒng)，能使外源DNA在受體生物細胞中擴增復(fù)制。（例如，細菌質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯氏質(zhì)粒載體） 表達載體：有一個受體生物細胞所要求的包括啟動子序列在內(nèi)的調(diào)控系統(tǒng)，能使外源基因在受體生物細胞中進行功能表達。（例如，Ti質(zhì)粒、SV40猴狀病毒） 按照導(dǎo)入的受體生物，一般可將基因工程載體分為大腸桿菌（原核細胞）載體、酵母載體、植物載體、動物載體等。,（一）大腸桿菌載體
19、 1.質(zhì)粒載體 質(zhì)粒:指細菌等生物細胞內(nèi)一類獨立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)。 質(zhì)?？截悢?shù)（plasmid copy number）：一種質(zhì)粒在一個細胞中存在的數(shù)目。,（1）質(zhì)粒的生物學(xué)特性 一般為雙鏈的共價閉合環(huán)狀DNA（ccc DNA），質(zhì)粒分子的長度一般為1200 kb。不同質(zhì)粒的分子質(zhì)量差異顯著，小質(zhì)粒的分子質(zhì)量約為103KDa，僅能編碼23種中等大小的蛋白質(zhì)；而大質(zhì)粒的分子質(zhì)量可達105KDa。,（2）質(zhì)粒的分類 根據(jù)復(fù)制控制類型：一般可將大腸桿菌質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒和松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒。 嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒:復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制同步，并與宿主蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，
20、而與DNA聚合酶的活性無關(guān)。如果宿主蛋白質(zhì)的合成終止，質(zhì)粒與宿主染色體的復(fù)制也停止。每個宿主細胞中只能達到1至數(shù)個拷貝。 松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒:復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制不同步，其與DNA聚合酶的活性有關(guān)，而與蛋白質(zhì)的合成無關(guān)。當(dāng)宿主蛋白質(zhì)的合成終止時，質(zhì)粒仍可復(fù)制。每個宿主細胞中的質(zhì)?？截悢?shù)可達10200個。,（3）質(zhì)?？寺≥d體的條件 分子結(jié)構(gòu)中具有多個單一限制酶切位點，具有易被檢測的選擇標(biāo)記基因，且切點位于選擇標(biāo)記基因上。 能插入、運載一定大小的外源基因。 在攜帶外源基因前后在宿主細胞內(nèi)均能自主復(fù)制。 在與外源基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后具有轉(zhuǎn)化功能。 分子質(zhì)量小，易于操作，一般為松弛型復(fù)制控
21、制。 容易控制，安全可靠。 現(xiàn)已通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多質(zhì)?？寺≥d體供基因工程應(yīng)用，例如，pBR322、pUC系列等。,（4）質(zhì)粒pBR322 組成 氨芐青霉素抗性基因（ampr） 四環(huán)素抗性基因（tetr） DNA復(fù)制起始點（ori） 優(yōu)點 分子質(zhì)量小。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。 較高的拷貝數(shù)。,（5）pUC質(zhì)粒載體 組成 來自pBR322的復(fù)制起始點（ori） 大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ基因。 氨芐青霉素抗性基因（ampr），但其核苷酸序列有變化，不含原來內(nèi)切限制酶的單位識
22、別位點。 位于lacZ基因中的靠近5端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)，但它并不破壞該基因的功能。 優(yōu)點 更小的分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)。 適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。 有多克隆區(qū)位點。,2.噬菌體載體 （1）噬菌體的生物學(xué)特性 不同種類的噬菌體（顆粒）在外形上差別很大。大多數(shù)噬菌體顆粒由呈20面體的頭部及尾部構(gòu)成，例如，噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形，例如，M13。在結(jié)構(gòu)上，噬菌體顆粒比質(zhì)粒復(fù)雜。 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸。該核酸最常見的構(gòu)型是線狀雙鏈DNA，此外，還有環(huán)狀雙鏈DNA、線狀單鏈DNA、環(huán)狀單鏈DNA等。,（2）噬菌體載體 噬菌體顆粒由頭與尾兩部
23、分組成。頭部裝載了其整個基因組DNA。 DNA為一長度約48.5 kb的線狀雙鏈DNA分子，可以分為三個區(qū)段：左臂、中央?yún)^(qū)和右臂。在左臂和右臂的5處各有12個堿基長的互補單鏈（從而構(gòu)成黏性末端）。當(dāng)噬菌體感染宿主細胞時，DNA被注入宿主細胞后會迅速通過黏性末端的互補作用形成環(huán)狀雙鏈DNA分子。,噬菌體載體的優(yōu)點：可攜帶較長的外源DNA片段。重組后的DNA分子可在體外被包裝成噬菌體顆粒。重組的噬菌體容易篩選和貯存。 噬菌體的必要基因：DNA至少包括61個基因。其中大約半數(shù)基因參與噬菌體生命周期活動，位于其左臂和右臂，這類基因稱作噬菌體的必要基因。 噬菌體的非必要基因：另一部分基因在被外源基
24、因取代后并不影響噬菌體的生命周期活動，位于其中央?yún)^(qū)，這類基因稱作噬菌體的非必要基因。 cos位點（cohesive-end site）：由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段。,噬菌體載體的分類：根據(jù)插入方式，一般可將噬菌體載體分為插入型載體和置換型載體。 插入型載體（insertion vector）：指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)有一種或不止一種限制酶的單一酶切位點可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的噬菌體載體。由插入型載體得到的重組DNA分子都比原載體長。 插入型載體可容納的外源DNA片段相對較小，一般在10 kb以內(nèi)。廣泛應(yīng)用于cDNA以及小片段DNA的克隆。,置換型（取代型）載體（r
25、eplacement vector）：指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)兩個或兩個以上的限制酶切位點間的DNA區(qū)段可被插入的外源DNA片段所置換的噬菌體載體。 置換型載體容納外源DNA片段大小的范圍一般在922 kb之間。 有些噬菌體載體兼有插入和置換兩種外源DNA片段的插入方式，這具體取決于載體與外源DNA末端匹配的限制酶切位點的種類和數(shù)目等。,3.柯斯質(zhì)粒載體（Cosmid vector） 也稱黏粒載體，指一類由人工構(gòu)建的含有抗性基因、單一克隆位點、DNA的cos位點和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。分子質(zhì)量較小，一般為46kb。 （1）柯斯質(zhì)粒載體的組成 1個質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)域復(fù)制子（基因
26、組中能獨立進行復(fù)制的單位）； 至少1個抗藥性選擇標(biāo)記基因； 至少1個限制酶的單一識別切割位點； 1個噬菌體黏性末端片段cos位點。,（2）柯斯質(zhì)粒載體的特點 具有質(zhì)粒載體的特性：它帶有質(zhì)粒的復(fù)制子，能像質(zhì)粒DNA一樣在宿主細胞內(nèi)復(fù)制，也能在氯霉素的作用下進行擴增。帶有抗生素抗性基因，有些還帶有基因插入失活的克隆位點，為重組體的篩選提供了簡便的標(biāo)記。 具有噬菌體載體的特性：它在與適宜長度的外源DNA片段重組后，可在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效地轉(zhuǎn)入對噬菌體敏感的大腸桿菌宿主細胞。進入宿主細胞后，也能像噬菌體一樣進行環(huán)化。 具有高容量的克隆能力：質(zhì)粒載體的克隆容量一般為10 kb，噬
27、菌體載體的克隆容量理論極限值是23 kb，一般為15 kb左右，而柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達45 kb 左右。,（一）基本原理 在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴增特異DNA片段。 在進行PCR擴增時，通常需要設(shè)計合成一對與目的DNA片段兩側(cè)翼序列分別互補的寡核苷酸引物。其中一引物與目的區(qū)段上游一條模板鏈的序列相互補，而另一引物與目的區(qū)段下游另一條模板鏈的序列相互補。,四、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù),將熱變性后分開的兩條模板鏈與摩爾數(shù)大大過量的兩個引物共同溫育復(fù)性產(chǎn)生的模板引物雜交體作為作用底物，利用耐熱的Taq DNA聚合酶催化延伸
28、合成反應(yīng)。在第一輪擴增完畢后，將反應(yīng)混合物再加熱使新構(gòu)成的雙鏈DNA變性，然后再度溫育使模板鏈與引物復(fù)性，進入第二輪特異性合成。由于耐熱的Taq DNA聚合酶在熱變性步驟中不失活，可直接進入第二輪特異性合成而不需要另外補加DNA聚合酶等。,PCR的每個循環(huán)包括3步 （1）變性（denaturation）。通過加熱至一定溫度使雙鏈DNA兩鏈間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈離解形成兩條DNA單鏈。 （2）復(fù)性（退火，annealling）。當(dāng)反應(yīng)體系溫度突然降低時，由于模板DNA分子的結(jié)構(gòu)比引物DNA分子復(fù)雜得多，而且在反應(yīng)體系中引物的量大大多于模板，因此引物和與其互補的模板配對形成局部雜交雙鏈，而變性后
29、離解形成的兩條模板DNA單鏈之間互補配對的機會則較少。 （3）延伸（extension）。在4種脫氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的條件下，Taq DNA聚合酶以模板引物雜交體分別為模板和引物催化DNA鏈沿53方向合成延伸。每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物作為下一循環(huán)的模板。,2.PCR的操作體系和反應(yīng)條件 （1）模板。待測的核苷酸（DNA或RNA）分子；雙鏈DNA可直接用于反應(yīng)，而RNA則需要用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后用作聚合酶反應(yīng)的模板。 （2）DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶的Klenow片段或T4 DNA聚合酶催化。由于每輪反應(yīng)需要三個溫度點，因此采用耐熱TaqDNA聚合酶。 （3）一
30、對引物。根據(jù)已知DNA序列，由人工合成的與所要求擴增的DNA兩端臨近序列互補的寡核苷酸片段，即左右端引物。 （4）四種三磷酸脫氧核苷（即dNTP），是合成DNA所需的原料。 （5）適當(dāng)?shù)木彌_液體系。 （6）反應(yīng)條件。94變性30s；55復(fù)性30s；7072延伸3060s。一共進行30輪左右的循環(huán)。,第二節(jié) 基因工程研究,外源基因：插入到載體內(nèi)的非自身的DNA片段。 目的基因：又稱為靶基因，是根據(jù)基因工程的目的和設(shè)計所需要的某些DNA分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼。 已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列，基因的制備方法主要分為兩大類：一類是基因化學(xué)合成法，一類是基因生物制備法
31、。一般又可將基因生物制備法分為基因組文庫法、cDNA文庫法和PCR法等。,一、目的基因的制備,（一）基因化學(xué)合成法 DNA的化學(xué)合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸酰胺法及固相亞磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初發(fā)明的化學(xué)合成基因的方法，而固相亞磷酸酰胺法是目前絕大部分DNA自動合成儀所使用的方法。 基因的化學(xué)合成法主要用于PCR擴增引物、核酸測序引物、核酸雜交探針和合成接頭等寡核苷酸片段的合成。 （二）基因組文庫法 是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。,（三）cDNA文庫法 指匯集以某種生物體成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的cDNA序列的重組DNA群體。在基因工程中
32、，cDNA文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。 （四）PCR法 一般經(jīng)典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特異擴增；而一些改進的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特異擴增。,二、目的基因與載體的重組（重組體的構(gòu)建）,基因重組（gene recombination）：利用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因，并將兩者連接起來。 目的基因和載體的連接分為黏性末端連接、平末端連接、人工接頭連接和同聚物加尾連接。,（一）黏性末端連接 1.同一限制酶切位點連接 由同一限制酶切割的不同DNA片段具有相同的末端，當(dāng)這樣的兩個DNA片段一起退火時，黏性末
33、端單鏈間進行堿基配對，然后在T4DNA連接酶催化作用下形成共價結(jié)合的重組DNA分子。,2.雙酶切片段的定向克隆 以兩種不同的限制酶切割目的基因，使之產(chǎn)生兩個不同黏端，對載體同樣以這兩個限制酶切割，達到載體DNA和外源DNA片段自身兩端為非同源的黏端，此時載體和外源DNA片段都不會發(fā)生自身環(huán)化，而且只有在DNA連接酶的作用下，載體DNA和外源DNA片段以兩端互補實現(xiàn)DNA定向插入。優(yōu)點： （1）外源DNA只能以一個方向插入到重組質(zhì)粒，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達。 （2）由于不會自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細菌克隆大多數(shù)是攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。,3.不同限制酶切位點連接 配伍末端（c
34、ompatible end）：由兩種不同的限制酶切割的DNA片段、具有相同類型的黏性末端。 同尾酶（isocaudamers）:來源不同，能夠?qū)NA切割產(chǎn)生相同的黏性末端，而其識別序列的特異性不同。 同尾切割可以產(chǎn)生完全配伍（互補）的黏性末端，便于兩個DNA片段的連接。 同裂酶（isoschizomers）：來源不同，具有相同識別序列，但切點不同。 經(jīng)過同裂酶切割過的DNA與載體連接前可能還必須進行前處理。,2.平端連接 具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。在一定的反應(yīng)條件下，可用T4DNA連接酶將平齊末端的DNA片段有效地連接起來。 3.人工接頭連接 人工接頭：人
35、工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點，應(yīng)用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，就可以分別得到互補的黏性末端。,4.同聚物加尾連接 利用同聚物序列之間的退火作用完成連接。末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段的3末端添加同聚尾造成延伸部分。末端轉(zhuǎn)移酶不具有特異性，在4種dNTP中任何一種均可作為前體物，可以產(chǎn)生由單一核苷酸所構(gòu)成的3同聚物末端。,三、將重組體導(dǎo)入受體細胞（重組轉(zhuǎn)化體的獲得）,轉(zhuǎn)化（transformation）：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞，使受體菌遺傳性狀發(fā)生改變的方法。 轉(zhuǎn)染（transfection）:將攜帶外源基因的病
36、毒感染受體細胞的方法。 根據(jù)受體生物，一般可將重組體導(dǎo)入受體細胞的方法主要分為大腸桿菌轉(zhuǎn)化法、酵母轉(zhuǎn)化法、植物細胞轉(zhuǎn)化法和動物細胞轉(zhuǎn)化法。,1.氯化鈣轉(zhuǎn)化法 首先將對數(shù)生長期的大腸桿菌懸浮于冰預(yù)冷的低滲氯化鈣溶液中處理，使細胞膜通透性增加，然后加入重組DNA，使DNA與鈣離子形成復(fù)合物，吸附于細胞表面，經(jīng)42短暫的熱處理，促進外源DNA進入宿主細胞。 2.轉(zhuǎn)染 首先將重組的噬菌體DNA或柯斯質(zhì)粒DNA體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細胞表面的噬菌體接受器位點使這些重組體DNA注入大腸桿菌宿主細胞。,四、重組轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定,（一）利用表型特征進行篩選（遺傳檢測法）
37、表型：指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。 1.利用載體提供的表型特征進行篩選 （1）抗藥性標(biāo)記基因插入失活篩選法 （2）半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法。 2.利用外源DNA提供的表型特征進行篩選 要求外源DNA是一個完整的基因，而且能夠在大腸桿菌或其他受體細胞中實現(xiàn)功能表達。,3.利用噬菌斑的形成進行篩選 以噬菌體載體與外源DNA構(gòu)建的重組體的篩選主要依賴于重組體的大小及形成噬菌斑的能力。 重組體DNA只有在為野生型噬菌體DNA的75%105%的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而載體DNA自身不會包裝成活的噬菌體顆粒。,（二）物理篩選鑒定法 1.電泳檢測法
38、根據(jù)DNA分子質(zhì)量的大小，以凝膠電泳檢測重組體。 2.R-環(huán)檢測法 R-環(huán)：指RNA通過取代與其序列一致的DNA單鏈而與另一單鏈DNA雜交，被取代的DNA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 R-環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定。應(yīng)用R-環(huán)檢測法可鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域（可在電子顯微鏡下觀察）。,（三）利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切進行鑒定 選擇適當(dāng)?shù)南拗泼笇χ亟M體DNA進行酶切鑒定。 （四）利用核酸雜交進行鑒定 采用的核酸雜交法是常用的幾種核酸雜交法，例如Southern雜交、Northern雜交等。 （五）利用PCR技術(shù)進行鑒定 利用PCR技術(shù)可以對目的
39、基因等特異核酸進行鑒定。 （六）利用免疫學(xué)方法進行篩選鑒定 基本原理：以目的基因在受體細胞中的表達產(chǎn)物（多肽）作抗原，以該基因產(chǎn)物的免疫血清作抗體，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，即可篩選鑒定出目的基因克隆及其產(chǎn)物。,（七）利用Western雜交進行鑒定 Western雜交：將蛋白質(zhì)電泳、吸印、免疫測定融為一體的特異蛋白質(zhì)的檢測方法。 （八）利用核苷酸序列測定進行鑒定 利用核苷酸序列測定技術(shù)可以對目的基因等特異核酸進行鑒定。 （九）轉(zhuǎn)譯篩選鑒定法 利用無細胞翻譯系統(tǒng)檢測經(jīng)處理后的mRNA的生物學(xué)功能。,第三節(jié) 基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用,（一）改良微生物菌種 1.面包酵母菌（麥芽糖透性酶和麥芽糖酶
40、） 2.啤酒酵母（淀粉酶、糖化酶） 3.單細胞酵母（ 淀粉酶） 4.其他微生物菌種 例如，氨基酸、有機酸、維生素、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、食用色素、食用香精及調(diào)味料等也可采用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)而得到。,一、利用基因工程改造食品微生物,（二）改良乳酸菌遺傳特性 1.抗藥性基因（食品安全） 2.風(fēng)味物質(zhì)基因（乳酸、乙醛、丁二酮、3羥基2丁酮、丙酮和丁酮等，黏多糖） 3.產(chǎn)酶基因（產(chǎn)生有機酸的酶系、合成多糖的酶系、降低膽固醇的酶系、分解脂肪的酶系） 4.耐氧相關(guān)基因 5.產(chǎn)細菌素基因（nisin、diplocoxin、lactocillin） （三）酶制劑的生產(chǎn) 1.凝乳酶
41、 2.葡萄糖異構(gòu)酶,（四）利用基因工程改良食品原料的品質(zhì) 1.改良動物食品性狀 2.改造植物食品原料 （1）提高植物性食品氨基酸的含量 （2）增加食品的甜味 3.改造油料作物 4.改良植物性食品的蛋白質(zhì)品質(zhì) 5.改善園藝產(chǎn)品的采后品質(zhì),（五）利用基因工程改進食品生產(chǎn)工藝 1.利用DNA重組技術(shù)改進果糖和乙醇生產(chǎn)方法 2.改良啤酒大麥的加工工藝 3.改良小麥種子貯藏蛋白的烘烤特性 4.改善牛乳加工特性,思考題,1.常用基因工程的工具酶有哪些，主要有哪些活性？ 2.常用的基因工程的載體有哪些，各有什么優(yōu)缺點？ 3.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的基本原理？PCR反應(yīng)體系的組成？ 4.常用目的基因制備的方法及其原理？ 5.獲得重組轉(zhuǎn)化體的方法有哪些？各有什么特點？ 6.篩選重組轉(zhuǎn)化體的方法有哪些？ 7.查閱資料，綜述一種基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用。,
基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用.ppt
