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1、第十單元現(xiàn)代生物科技專題 專題30基因工程,高考生物（浙江專用）,考點(diǎn)基因工程 考點(diǎn)清單,基礎(chǔ)知識(shí) 一、基因工程的含義與工具 1.基因工程與遺傳工程:基因工程是狹義的遺傳工程。廣義的遺傳工程泛指把一種生物的遺傳物質(zhì)(細(xì)胞核、染色體脫氧核糖核酸等)移到另一種生物的細(xì)胞中去,并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)。 2.基因工程的核心是:構(gòu)建重組DNA分子。,3.基因工程的工具 (1)限制性核酸內(nèi)切酶 a.來(lái)源:主要是從微生物(如細(xì)菌)中分離純化出來(lái)的。 b.功能:識(shí)別并切開(kāi)每條鏈中特定位點(diǎn)上的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的 磷酸二酯鍵。 c.特點(diǎn):具有專一性,表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面: 識(shí)別DNA分子中
2、某種特定的核苷酸序列;使每一條鏈中特定位點(diǎn)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。 d.作用結(jié)果:產(chǎn)生粘性末端或平末端。 (2)DNA連接酶 功能:將末端堿基互補(bǔ)的2個(gè)DNA片段連接起來(lái)。,(3)載體 a.最常用的載體質(zhì)粒 實(shí)質(zhì):能夠自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子,是一種特殊的遺傳物質(zhì),在細(xì)菌中以獨(dú)立于擬核之外的方式存在。 b.其他載體:噬菌體、植物病毒和動(dòng)物病毒等。 二、基因工程的基本操作步驟 1.獲得目的基因 (1)目的基因:人們所需要的基因。如:人的胰島素基因、植物的抗病基因等。 (2)獲取方法,2.形成重組DNA分子 一般用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割含有目的基因的供體DNA分子和載體(如質(zhì)
3、粒),使其產(chǎn)生相同的粘性末端(或平末端),然后用DNA連接酶將兩者連接在一起,形成重組DNA分子。 3.將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 常用的受體細(xì)胞:大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。 4.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 (1)篩選原因:并不是所有的細(xì)胞都接納了重組DNA分子。 (2)篩選方法舉例:質(zhì)粒上有抗生素如四環(huán)素的抗性基因,所以含有這種重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞就能夠在有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),而沒(méi)有接納重組質(zhì)粒的細(xì)胞在這種培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),這樣就能篩選出含有重組DNA分子的受體細(xì)胞。,5.目的基因的表達(dá) 目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá),產(chǎn)生人們需要的功能物質(zhì)。 三、基因工程與遺傳育種 1.轉(zhuǎn)基因
4、植物 培育優(yōu)點(diǎn) 2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (1)含義:轉(zhuǎn)入了外源基因的動(dòng)物。 (2)培育優(yōu)點(diǎn):省時(shí)、省力。,四、基因工程與疾病治療 1.基因工程藥物,2.基因治療指的是向目標(biāo)細(xì)胞中引入正常功能的基因,以 糾正或補(bǔ)償基因的缺陷,達(dá)到治療的目的。 五、基因工程與生態(tài)環(huán)境保護(hù) 1.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)聚羥基烷酯,用于合成可降解的新型塑料。 2.改造分解石油的細(xì)菌,提高其分解石油的能力。 3.利用轉(zhuǎn)基因微生物吸收環(huán)境中的重金屬、降解有毒化合物和處理工業(yè)廢水。,重難突破 一、基因工程的三大操作工具 1.限制性核酸內(nèi)切酶 (1)限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)的作用 限制酶切割時(shí)斷開(kāi)的是DNA分子中的磷酸二酯鍵(即相鄰脫氧
5、核苷酸間的鍵),而不是兩條鏈之間的氫鍵。如圖:,(2)限制性核酸內(nèi)切酶具有專一性,表現(xiàn)在兩個(gè)方面: 識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。 切割特定序列中的特定位點(diǎn)。如圖:,2.DNA連接酶 (1)DNA連接酶的作用 兩個(gè)來(lái)源不同的DNA用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割,形成相同的粘性末端(或平末端)。DNA連接酶能催化磷酸與脫氧核糖之間化學(xué)鍵的形成,將兩個(gè)DNA末端的縫隙“縫合”起來(lái)。如圖:,(2)幾種易混淆酶的比較,3.載體的種類及作用 (1)載體應(yīng)具備的特征 能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。 有1個(gè)或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn),以便與外源基因連接。 具有某些標(biāo)記基因,以便進(jìn)行篩選。 (2)載
6、體的種類 細(xì)菌質(zhì)粒,最常用大腸桿菌質(zhì)粒。 噬菌體和某些動(dòng)植物病毒。 一般來(lái)說(shuō)天然的載體往往不能滿足人們的所有要求,因此人們根據(jù)不同目的和需求,對(duì)某些天然的載體進(jìn)行人工改建。,(3)作用 一是用它作為運(yùn)載工具,將目的基因送到宿主細(xì)胞中去;二是利用它在 宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。 二、基因工程基本操作 1.基因工程基本操作“五步曲” (1)獲得目的基因 序列未知:建立一個(gè)包括目的基因在內(nèi)的基因文庫(kù),再?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取。 序列已知:化學(xué)方法(如逆轉(zhuǎn)錄法)合成或者用PCR擴(kuò)增目的基因。 PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較,(2)形成重組DNA分子 一般采用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和目的基因,以獲
7、得相同的粘性末端(或平末端),以利于形成重組DNA分子,但有時(shí)用不同的限制性核酸內(nèi)切酶處理也可以獲得相同的粘性末端(或平末端)。,目的基因的插入可能會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因生物原有基因的結(jié)構(gòu),影響轉(zhuǎn)基因 生物的正常生長(zhǎng),甚至致死。 限制性核酸內(nèi)切酶只識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列,對(duì)RNA不起作用。 用DNA連接酶連接時(shí),可形成3種不同的連接物:目的基因載體連接物、載體載體連接物、目的基因目的基因連接物,導(dǎo)入受體細(xì)胞后,可利用抗性基因的差異進(jìn)行篩選。,(3)將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,(4)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 原理:質(zhì)粒上有抗生素抗性基因等標(biāo)記基因。 方法:利用選擇培養(yǎng)基篩選。 舉例: 所
8、有受體細(xì)胞含四環(huán)素培養(yǎng)基活的受體細(xì)胞 重組DNA分子 (質(zhì)粒上有四環(huán)素抗性基因)含重組DNA分子的受體細(xì)胞 在實(shí)際應(yīng)用中還有: a.檢測(cè)是否插入目的基因,利用DNA分子雜交技術(shù),目的基因DNA一條鏈(作探針)與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交,看是否有雜交帶。,b.檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,利用核酸分子雜交技術(shù),目的基因DNA一條鏈(作探針)與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交,看是否有雜交帶。 (5)目的基因的表達(dá):看到目的性狀或分離到目的基因表達(dá)產(chǎn)物 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì):從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì),用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原抗體雜交。 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定:如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀。 2.有
9、關(guān)基因工程操作注意事項(xiàng) (1)基因文庫(kù)中的基因保存在受體菌中。 (2)原核生物繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少,有利于目的基因的復(fù)制與表達(dá),因此常采用大腸桿菌等原核生物作為受體細(xì)胞。,(3)植物細(xì)胞的全能性較高,可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程成為完整植物體,因 此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞;動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。 (4)操作工具有三種,但常用工具酶有兩種,載體不是酶;在基因工程操作步驟“獲得目的基因”和“形成重組DNA分子”兩個(gè)過(guò)程中通常用同種限制酶,目的是產(chǎn)生相同的粘性末端(或平末端);DNA連接酶只在“形成重組DNA分子”操作中用到。 (5)一般情況下,用同一種限制性核酸
10、內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段,但有時(shí)可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因,這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。,(6)標(biāo)記基因的種類和作用:標(biāo)記基因的作用篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為 帶顏色的物質(zhì))等。,方法限制性核酸內(nèi)切酶的選擇 方法技巧 限制酶選擇的注意事項(xiàng) (1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類: 應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇Pst。 不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇Sma。,為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒,如圖甲也可選擇用Pst和EcoR兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。 (2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類 所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致,以確保具有相同的粘性末端(或平末端)。 質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等,所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu),如圖乙中限制酶Sma會(huì)破壞標(biāo)記基因;如果所選酶的切點(diǎn)不是一個(gè),則切割重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū),則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制。,
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