《HPLC原理與應(yīng)用》PPT課件.ppt

高效液相色譜法,化學(xué)化工學(xué)院,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異，因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長有短，從而實(shí)現(xiàn)分離的目的,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,3.操作條件的選擇流動相的選擇,流動相要求： (1)溶劑應(yīng)當(dāng)是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性； (2)溶劑的性能與使用的檢測器應(yīng)當(dāng)匹配；選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長，甲醇：205nm; 乙腈：190nm (3)溶劑對樣品應(yīng)有足夠的溶解能力； (4)溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)； (5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑。,常用流動相溶劑：,反向色譜常用流動相及沖洗強(qiáng)度 H2O甲醇乙腈丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用組成：甲醇/ H2O 、 乙腈/ H2O 洗脫順序：極性物質(zhì)先洗脫下來 正想色譜常用流動相及沖洗強(qiáng)度 正乙烷乙醚乙酸乙酯異丙醇,洗脫方式等度洗脫、梯度洗脫,等度洗脫： 整個洗脫過程中，流動相的組成比保持不變 梯度洗脫： 在一個分析周期中，按照一定的時(shí)間程序連續(xù)或階段性的改變流動相的組成比，從而改變?nèi)軇┑臉O性、離子強(qiáng)度、pH值等，使每個組分在適宜的條件下獲得分離。 梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)： 改善峰型；提高柱效；減少分析時(shí)間；使強(qiáng)滯留組分不容易殘留在柱子。,梯度洗脫裝置,二元高壓梯度：先加壓后混合 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例輸入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,一臺高壓泵，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或者多種 不同極性的溶劑按一定比例抽入高壓泵中混合,四元低壓梯度：先混合后加壓,4.HPLC在各領(lǐng)域的主要應(yīng)用,1.環(huán)境:多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、酚類化合物、鄰苯二甲酸脂等。 2.食品:食品營養(yǎng)成分分析、食品添加劑分析、食品污染物分析。 3.醫(yī)藥:合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物、黃胺類藥等；天然藥物：鑒別中藥真?zhèn)位蛘弋a(chǎn)地、吲哚堿、鴉片堿、強(qiáng)心甙測定等。 4.農(nóng)藥:有機(jī)農(nóng)藥、除草劑等。 5.化工:無機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料等。,1.環(huán)境保護(hù)多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖,1.環(huán)境保護(hù)苯及其衍生的分離譜圖,2.食品分析中的應(yīng)用食品營養(yǎng)成分分析,啤酒中的有機(jī)酸分析,2.食品分析中的應(yīng)用食品營養(yǎng)成分分析,2.食品分析中的應(yīng)用食品添加劑分析,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用抗生素的測定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用復(fù)方丹參片中丹參酮A的測定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用中藥白鮮皮的指紋圖譜,不同地區(qū)的白鮮皮指紋圖譜考察,A吉林仁和 B黑龍江 C哈爾濱 D上海 E長沙 F承德圍場 G西安 H烏魯木齊,4.化工中的應(yīng)用24種禁用偶氮染料色譜圖,4. HPLC發(fā)展前景,固定相的發(fā)展 前處理方法 檢測器的發(fā)展 聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,4. HPLC發(fā)展前景固定相的發(fā)展,固定相基質(zhì) 高純硅膠微球 聚合物微球 有機(jī)-無機(jī)復(fù)合物 氧化鈷微球 多孔石墨微球,鍵合及改性技術(shù) 立體保護(hù)鍵合固定相 包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相 全氟烷基鍵合 聚合物涂覆改性,高純硅膠基質(zhì)固定相,硅膠除了具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、容易控制的孔結(jié)構(gòu)和比表面積、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及專一的表面化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn), 還有一個突出的優(yōu)點(diǎn)就是其表面含有豐富的硅羥基, 這是硅膠可以進(jìn)行表面化學(xué)鍵合或改性的基礎(chǔ)。 突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來改變分離的選擇性。,化學(xué)鍵合的種類,按鍵合官能團(tuán)的極性分：極性和非極性鍵合。 極性鍵合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。 非極性鍵合相：各種烷基(C1C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。,硅膠鍵合固定相的應(yīng)用,10種混合物在大黃酸鍵合硅膠固定相 (a)和C18 (b)的色譜圖,聚合物基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)： 色譜選擇性好 樣品容量較大 化學(xué)穩(wěn)定性好 不易產(chǎn)生非特異性吸附 不足： 剛性不理想、孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜、溶脹或收縮,多孔石墨化碳固定相,特點(diǎn)： 穩(wěn)定性好-在低或高pH條件下抑制酸堿離子 極性樣品具有較強(qiáng)的保留 異構(gòu)體選擇性提高 可分離旋光異構(gòu)體 可進(jìn)行族分離 流動相組成簡單,氧化鈷基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)： 穩(wěn)定性好 強(qiáng)堿分析速度快 高溫快速分析,優(yōu)點(diǎn)： 高比例水流動相，不會導(dǎo)致烷基鏈?zhǔn)湛s 極性化合物(包括酸和堿性化合物)保留增強(qiáng) 傳統(tǒng)C18C8固定相選擇性不同 可用低濃度緩沖溶液作流動相，以及固定相官能團(tuán)低流失，適合于LC/MS,包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相,包埋極性基團(tuán)鍵合相作用機(jī)理,溶質(zhì)與極性基團(tuán)的作用； 溶質(zhì)和硅羥基與極性基團(tuán)的競爭作用； 極性基團(tuán)增加表面層水濃度,氟烷基鍵合固定相,特點(diǎn)： 在與 C18/C8 相似的流動相條件下，選擇性改善 鹵代化合物和芳香異構(gòu)體的保留更強(qiáng) 分離含羥基、羧基、硝基和其它極性基團(tuán)化合物具有顯著優(yōu)勢,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,固相萃取,固相萃取,優(yōu)點(diǎn)：同步實(shí)現(xiàn)富集和純化 應(yīng)用范圍： 水中有機(jī)污染物的痕量富集、水中半揮發(fā)性有機(jī)物的測定及大氣和土壤樣品的前處理,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,分散液液微萃取,分散液液微萃取,特點(diǎn)： 有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高 應(yīng)用范圍： 適用于水溶液中有機(jī)物的提取，如有機(jī)磷農(nóng)藥、酚類物質(zhì)等。也可用于水溶液中重金屬( 鈀 鈷 鉛 釩 有機(jī)錫等)的萃取。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,固相微萃?。?在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來，采用一根聚合物涂層的熔融石英纖維，從樣品基質(zhì)中或樣品上方的頂空氣體中直接吸附萃取待測物，然后再色譜進(jìn)樣口解吸、分析。 優(yōu)點(diǎn)： 所需樣本量少,避免了乳化現(xiàn)象,回收率高， 重現(xiàn)性好,而且便于自動化操作。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,超臨界流體萃?。?利用超臨界流體的溶解能力與超臨界流體具有與流體相近的密度和與氣體相近的豁度，擴(kuò)散系數(shù)為液體的10倍至100倍，對很多物質(zhì)有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力。 優(yōu)點(diǎn)： 提取過程快速、簡便，消除有機(jī)溶劑對人體和環(huán)境的危害，并可與許多分析儀器聯(lián)用。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,微波輔助萃?。?在微波中，由于吸收微波能力的差異使基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取習(xí)題的某些組分被選擇性的加熱，從而使樣品中要分析的組分從樣品基質(zhì)中滲出，實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)的分離。 優(yōu)點(diǎn)： 受溶劑親和力影響小，設(shè)備簡單，適用范圍廣，重現(xiàn)性好，節(jié)省時(shí)間和溶劑。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,濁點(diǎn)萃取： 以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分開。 優(yōu)點(diǎn)： 萃取率高、富集因子大、操作簡便、安全、經(jīng)濟(jì)，便于實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。,4. HPLC發(fā)展前景檢測器,種類：紫外檢測器(UV) 熒光檢測器(FD) 電化學(xué)檢測器(ECD) 蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 示差折光檢測器(RID),紫外檢測器(UV),原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。 優(yōu)點(diǎn): a: 靈敏度高，檢測下限約為 10-6 gml b: 線性范圍廣 C: 對溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫 紫外檢測器的類型: 固定波長型(已淘汰)； 可變波長型(最常用)； 二極管陣列檢測器(最新型)。,二極管陣列檢測器（DAD）,時(shí)間、光強(qiáng)度和 波長的三維譜圖,熒光檢測器（FLD）,原理: 物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能 級，這些電子從高能級 躍至低能級時(shí)，物質(zhì)會發(fā)出比入射光 波長較 長的光，這種光稱為熒光。 熒光強(qiáng)度(F)與激發(fā)光強(qiáng)度(I0)及熒光物質(zhì)濃度(C)成正比。 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高、選擇性好，是微量組分和體內(nèi)藥物分析常用的檢測器之一。,熒光檢測器（FLD）結(jié)構(gòu)示意圖,HPLC-FLD檢測發(fā)霉的花生中的黃曲霉素B1和黃曲霉素B2,黃曲霉素B2,黃曲霉素B1,流動相：H2O :乙腈：甲醇 (60/20/20, v/v/v) 流速：1mL/min 柱溫：25,電化學(xué)檢測器(ECD),原理（電導(dǎo)檢測器）：兩個對電極測量樣品中離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)，由電導(dǎo)的變化測定的濃度。 原理（安培檢測器）：利用待測物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表明發(fā)生氧化還原反應(yīng)，兩電極間有電流通過，電流大小與待測物質(zhì)濃度成正比。 適用范圍： 凡具氧化還原活性的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測，本身沒有氧化還原活性的物質(zhì)經(jīng)過衍生化后也能進(jìn)行檢測。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度很高，尤其適用于痕量組分分析。,HPLC-ECD檢測綠原酸、咖啡酸、阿魏酸,蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD),原理： 將洗脫液引入霧化器與氣體混合形成均勻的微小液滴，蒸發(fā)除去流動相而樣品組分形成氣溶膠，進(jìn)入檢測室，用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測散射光。散射光的強(qiáng)度(I)與組分的質(zhì)量(m)通常具有下述關(guān)系：IKmb,散射光的對數(shù)響應(yīng)值與組分質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系。,HPLC-ELSD測定磷酸陰離子 鈣陽離子,4. HPLC發(fā)展前景聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）,液質(zhì)(LC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)的示意圖,HPLC-MS優(yōu)點(diǎn)：,1.是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極 性大、分子量大的物質(zhì)的電離。 2.主要生成準(zhǔn)分子離子（M+H+ 、M- H-、 M+Na+等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。 3.靈敏度高 4.不能進(jìn)行譜庫檢索 5.不適用于非極性化合物的分析,HPLC-MS應(yīng)用,LC/MS檢測:利血平,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）,HPLC-MS/MS: 第一級質(zhì)譜分離感興趣的離子，第二級質(zhì)譜通過在碰撞過程中產(chǎn)生的碎片譜來表示其特征。 與HPLC-MS比較： HPLC-MS/MS技術(shù)可減少或消除樣品基質(zhì)中無關(guān)物的干擾，特異性好，靈敏度高，分析速度快，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，為物證鑒定提供絕對可靠的依據(jù)，如毒物分析、濫用藥物鑒定、爆炸殘留物分析等.,高效液相色譜-共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)（HPLC-RRS）,聯(lián)用裝置圖,HPLC-RRS優(yōu)點(diǎn),分離效率高 分析數(shù)度快 選擇性好 自動化檢測 為無電化學(xué)性質(zhì)和光譜性質(zhì)的物質(zhì)提供新的檢測手段 可直接用于復(fù)雜樣品中微量組分的分離及測定。,HPLC-RRS的應(yīng)用,HPLC-RRS技術(shù)和HPLC-UV檢測土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素圖譜,HPLC-RRS測定血樣中氨基糖苷類抗生素,4. HPLC發(fā)展前景聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-核磁共振波譜聯(lián)用（HPLC-NRM） 優(yōu)點(diǎn)： 1.分離和結(jié)構(gòu)解析 2.對光、氧不敏感 缺點(diǎn)： 1.靈敏度低 2.線寬與流速有關(guān) 3.多溶劑信號突出 4.耗時(shí),HPLC-NMR的應(yīng)用,問題？,