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第21章 基因工程
基因工程：是指采用人工方法在體外將目的基因與載體進(jìn)行重組，并將重組后的DNA分子引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)目的基因的過程。
基因工程的目的 ：（ 1）擴(kuò)增獲得某一感興趣的基因或DNA序列；（ 2）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))。
基因工程的特點(diǎn)：分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)
基因工程中目的基因：是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。目的基因來源：①人工合成；②從cDNA文庫中篩選；③從基因組文庫中篩選；④利用PCR合成（PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，包括變性、退火、鏈延伸三個(gè)步驟）。
基因工程載體：是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主
2、細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA 。
常用的載體主要包括質(zhì)粒、噬菌體和病毒三大類。這些載體均需經(jīng)人工改造后構(gòu)建，如除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。
不同的基因工程中需要不同的工具酶，其中必備的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。能夠識別特定的堿基順序并在特定的位點(diǎn)降解核酸的酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。其所識別的順序往往為4-8個(gè)堿基對，且有回文結(jié)構(gòu)。
基因工程的主要操作過程：
1．載體和目的基因的分離（分）：對載體DNA和目的基因分別進(jìn)行分離純化，得到純品。
2．載體和目的基因的切斷（切）：通常采用限制性核酸內(nèi)切酶，分別對載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesive end)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。
3．載體和目的基因的重組（接）：即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因用連接酶連接起來，得到重新組合后的DNA分子。
4．重組DNA的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)）：將重組DNA用適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入宿主細(xì)胞。
5．重組DNA的篩選和鑒定（篩）：對含有重組體的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作鑒定。
6．重組DNA的擴(kuò)增或目的基因的表達(dá)（擴(kuò)）。
生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第21章基因工程
