分子診斷學(xué)：第五章 核酸擴增技術(shù)

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1、 第五第五章章 核核酸擴增技術(shù)酸擴增技術(shù) 核酸擴增技術(shù) Thermocycling based PCR (Polymerase Chain Reaction, Roche Diagnostics) Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) Real-Time PCR Multiplex PCR Nested PCR On-Array-PCR Digital PCR LCR (Ligase Chain Reaction, Abbott Laboratories) -MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe amplificati

2、on) Isothermal techniques NASBA (Nucleic Acid Squence Based Amplification RCA (Rolling Circle Amplification) RPA (Recombinase Polymerase Amplification) SDA (Strand Displacement Amplification) LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) Signal Amplification bDNA (Branched DNA, BayerSiemens)第一節(jié) 聚合酶鏈

3、反應(yīng)一、PCR的基本原理和反應(yīng)過程變性 Denaturing退火 Annealing延伸 Extension Polforward primerreverse primerrepetitive PCR cyclesdenaturationprimer annealingextensiondenaturation and annealingTarget DNAPolymerase Chain Reaction (PCR)Example thermal cycler protocol Step 15 min at 94CInitial Denature Step 2 40 cycles of: 3

4、0 sec at 94CDenature 30 sec at 52CAnneal 1 min at 72CExtension Step 3 5 min at 72CFinal Extension Step 4 Infinite hold at 4C Storage二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件（一）反應(yīng)體系:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液1. 模板（Template) 基因組DNA和RNA、質(zhì)粒DNA和線粒體DNA 模板DNA必須有較高的純度 RNA作為模板，須先將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA 常規(guī)PCR的模板DNA量一般僅需50-100ng左右 體系中較低量的模板有利于提高擴增的

5、產(chǎn)量和減少 非特異性擴增。（一）反應(yīng)體系: 2.引物（Primer) 設(shè)計原則： 設(shè)在被擴增目的片段的雙側(cè)兩端，并分別與模板正負(fù)鏈堿基序列互補。 長度以15至30個核苷酸為宜。 兩條引物之間（尤其3-OH未端）的序列不能互補。 引物的堿基組成應(yīng)平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。C+G 比例以45%-55%。引物3端尤其要避免重復(fù)的CG堿基序列。 PCR擴增的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，兩條引物的Tm值不能差別太大。 據(jù)需要可在5端加修飾成分或標(biāo)記分子。 保證與其它靶序列無同源性；引物濃度一般為0.1-1M之間。（一）反應(yīng)體系: 3.Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymer

6、ase) 水棲噬熱菌（thermus aquaticus)中提取，熱穩(wěn)定性高。 以DNA為模板，在引物3-OH端加上dNTP，在兩者間形成3-5 磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿53方向延伸。 Taq DNA 聚合酶缺乏35核酸外切酶活性。在每一次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。 Pfu DNA聚合酶,Vent DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，具有較高的保真性，可使堿基錯配率降低。 50-100l 的PCR擴增體系一般需1-2.5U酶。（一）反應(yīng)體系: 4.脫氧核苷三磷酸（dNTP) dNTP 是dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP四種 脫氧核苷三磷酸的混合

7、物。 反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致。 dNTP濃度一般為20-200M。 降低dNTP的濃度可相應(yīng)提高反應(yīng)特異性。（一）反應(yīng)體系: 5.Mg2+濃度 Mg2+是Taq DNA polymerase 不可缺少的輔助因子，可穩(wěn)定擴增體系，提高酶活性。 Mg2+濃度過低使酶活力降低，過高使酶催化非特異性擴增。 通過實驗優(yōu)化PCR擴增條件，尋找Mg2+最佳反應(yīng)濃度。（一）反應(yīng)體系: 6.其他因素 酶緩沖液pH用1050mM Tris-HCl 調(diào)整至8.3 8.8。當(dāng)溫度上升至72，體系的pH約在7.2左右，使酶發(fā)揮最大酶促活性。 PCR緩沖液中KCl的濃度為50mM，緩沖液可加BSA、Tween

8、 20、DTT等酶保護(hù)劑。 擴增富含CG堿基序列時，可加入DMSO至終濃度為1g/L，利于破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。也可用7-deaza-dGTP代替dGTP，避免二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。（二）反應(yīng)條件與優(yōu)化: 1.溫度 變性：變性：95-97 ，使模板和產(chǎn)物DNA雙鏈完全打開 退火：退火：保證PCR擴增特異性的前提，一般低于引物Tm 5 。過低易產(chǎn)生非特異性擴增，提高退火溫度可提高擴增的特異性，但也會降低擴增的效率。 延伸：延伸：一般為72 特殊情況下，可將PCR設(shè)為兩個步驟：變性和退火延伸（72 和 Tm 之間）。（二）反應(yīng)條件與優(yōu)化 2.時間 第一次變性應(yīng)給予足夠的時間（95 5min),使模板徹底變

9、性后進(jìn)入循環(huán)。 退火時間主要取決于引物長度 延伸時間主要取決于擴增產(chǎn)物長度，一般1kb/min。 200-1000bp的擴增片段，循環(huán)中變性、退火和延伸三個步驟的持續(xù)時間一般均為30-60秒。 （二）反應(yīng)條件與優(yōu)化 3.循環(huán)次數(shù) 一般為20-40次 PCR擴增效率呈S型曲線型。 平臺出現(xiàn)的遲早與模板的初始量有關(guān)，體系中模板的初始量越多，平臺期出現(xiàn)越早。 引物二聚體、反應(yīng)副產(chǎn)物、反應(yīng)成分的消耗、引物和產(chǎn)物間的竟?fàn)幘鶗绊懫脚_效應(yīng)。 理論上PCR擴增的產(chǎn)物拷貝數(shù)應(yīng)是2n，但實際上要少得多。 在定量分析PCR產(chǎn)物時，注意設(shè)置合適的初適模板DNA的量和循環(huán)次數(shù)，確定線性反應(yīng)的最佳條件，避免在“平臺效應(yīng)

10、”期對產(chǎn)物進(jìn)行定量。 （三）提高PCR擴增特異性的方法 1.熱啟動PCR 2.遞減PCR（Touch-Down PCR,TD-PCR) 3.促進(jìn)PCR添加劑和助溶劑 一、電泳 凝膠電泳是檢測PCR產(chǎn)物常用和最簡便的方法，能判斷有無預(yù)期大小的擴增產(chǎn)物及擴增的特異性。（一）瓊脂糖凝膠電泳 分離、純化、鑒定DNA（100bp-60kb）的常用方法（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳第二節(jié) PCR產(chǎn)物分析二、PCR-RFLP （Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于由于DNA DNA 變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點

11、消失，設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括位點消失，設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在用限制性某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化后，經(jīng)電泳分析產(chǎn)生不同長度或不核酸內(nèi)切酶消化后，經(jīng)電泳分析產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段。同數(shù)量的片段。ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoR 限制性內(nèi)切酶位點的變化限制性內(nèi)切酶位點的變化三、PCR-SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single-strand conformation polymorphism, SSCP） 單鏈單鏈DNADNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)。這種二

12、級在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的序列。即使只有一個堿基的結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的序列。即使只有一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并可引起非變性不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。條件下的電泳遷移率的差異。 技術(shù)路線：技術(shù)路線：PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物9595 C C變性變性5 5分鐘，立即置冰上。分鐘，立即置冰上。10%10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。PCR-SSCP原理示意圖原理示意圖四、高溫變性的熔點曲線分析 雙鏈DNA分子能結(jié)合熒光染料，在復(fù)性時結(jié)合熒光最強，隨溫度上升時熒光量逐漸降低。當(dāng)溫度升至其熔點溫度(Tm)時熒光量急

13、劇下降而形成熔點曲線，其波峰所在的溫度即代表被檢DNA分子的Tm值高分辨率熔點分析技術(shù)（High resolution melting,HRM) 溫度升高幅度0.02-0.1，分辨率高。 使用飽和染料（如ResoLight,LcGreen),當(dāng)雙鏈DNA局部解鏈，游離下來的染料不會再重新結(jié)合到DNA分子上去，熒光強度的降低能更精確地反映DNA分子的解鏈情況，能準(zhǔn)確分辨出單個堿基序列的變化。 已廣泛應(yīng)用于基因突變掃描、SNP的篩查、DNA甲基化的分析。五、PCR產(chǎn)物的序列分析 對于目的基因靶片段的序列鑒定以及對致病基因檢測時分析靶片段中點突變的具體位置和性質(zhì)。 序列分析模板的制備主要有： 純化后

14、直接作為模板進(jìn)行測序 克隆入載體后以此作為模板再測序DNA序列測定原理序列測定原理(雙脫氧末端終止法雙脫氧末端終止法)一代測序(Sanger法)一代測序(Sanger法)第三節(jié) 衍生的PCR技術(shù)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 是以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行核酸擴增技術(shù)。總RNA或mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，得到目的基因片段。 RT-PCR主要用于cDNA克隆、合成cDNA探針、檢測RNA病毒和分析基因表達(dá)。 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法有：特異性下游引物(GSP)、oligo (dT) 、random hexanucleotides （一）R

15、T-PCR體系1.模板2.引物（1）隨機引物（2）Oligo dT（3）基因特異性引物3.逆轉(zhuǎn)錄酶 （二）一步法RT-PCR和兩步法RT-PCR 實時熒光定量PCR（real-time fluorenscence quantitative PCR)是指在 擴增周期每個時間點（通常是每個循環(huán)結(jié)束后），通過檢測熒光強度對PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實時監(jiān)測，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出PCR的初始模板量。二、實時熒光定量PCR（RFQ-PCR） （一）熒光定量PCR的化學(xué)原理 嵌入型熒光染料： 特異性熒光探針： 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorenscence quantitative PCR,FQ-PCR)原理

16、的技術(shù)： 1.水解探針（Hydrolization probe) 2.雜交探針（Hybridization probe) 3.分子信標(biāo)（Molecular beacon)（一） DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)DENATURATION STEP: DNA + PRIMERS + DYEWEAK BACKGROUND FLUORESCENCEANEALING STEP:DYE BINDS dsDNA, EMITS LIGHTEXTENSION STEP: MEASURE LIGHT EMMISSIONSYBR Green I染料（二）特異性熒光探針1.水解探針技術(shù): TaqMan 5-3 Exonucle

17、ase熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記探針2.雜交探針技術(shù)（FRET 探針）3.分子信標(biāo)技術(shù)1.基線：產(chǎn)物積累的熒光信號能被儀器檢測到的最下限。2.熒光閾值:一般以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。（二）熒光定量PCR的重要概念Threshold fluorescence levelThreshold cycles for each sample3.閾值循環(huán)數(shù)：Threshold cycle value，Ct值 每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，也即Ct值的大小與樣品中的模板的起始拷貝數(shù)成反比。4.擴增曲線5

18、.標(biāo)準(zhǔn)曲線6.熔解曲線（二）熒光定量PCR的重要概念 （三）熒光定量PCR定量原理及結(jié)果分析1.數(shù)學(xué)定量原理 起始模板的對數(shù)與Ct值呈線性關(guān)系2.結(jié)果分析（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量 （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量 （3）比較Ct法的相對定量（四）熒光定量PCR的特點1.高特異性2.高敏感性3.可重復(fù)性4.無污染（五）影響熒光定量PCR的主要因素1.引物-探針二聚體2.引物和探針的濃度3.Mg2+的濃度4.循環(huán)數(shù)三、多重PCR (Multiplex PCR) 同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中同一靶基因多個不同序列的片段或多個不同靶基因的片段。 應(yīng)使各對引物之間的擴增效率基本一致，

19、否則它們之間會發(fā)生竟?fàn)幱绊懽罱K擴增結(jié)果。 將反應(yīng)條件（引物的Tm值、反應(yīng)時間和溫度、緩沖液的組分等）較為接近的引物組合在一起，使該反應(yīng)條件盡量適合所有引物以達(dá)到較為一致的擴增效率。 同一反應(yīng)內(nèi)各擴增產(chǎn)物片段的大小應(yīng)不同。Listeria monocytogenesGenoserotyping or PCR GroupProfilePCR GroupSerovar1, 5IIa1/2a ou 3a2, 6, 10IIb1/2b ou 3b ou 73, 7IIc1/2c ou 3c4, 8, 9IVb4b ou 4d ou 4e11-16LListeria monocytogenes 4a, 4

20、ab, 4c or other species of Listeria ORF2819 lmo0737 1000 800 700 600 500 400 300 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 lmo1118 ORF2110 prs IIaIIcIIbIVbDoumith et al. JCM, 2004Doumith et al., J Food Protect 2005Multiplex PCR : simultaneous PCR on 5 different DNA fragments （一）MLPA技術(shù)原理 MLPA技術(shù)融合了核酸分子

21、雜交和PCR反應(yīng)，是一種高通量的定性和定量分析的技術(shù)，反應(yīng)需要一對引物和一對特殊的探針，其反應(yīng)步驟包括雜交、連接、擴增和電泳檢測1、探針結(jié)構(gòu)（1）短探針（5探針）：50-60bp，其3端與靶序列完全互補的雜交序列和一個位于其5 未端19nt的共有序列，此共有序列與標(biāo)記的標(biāo)記的PCR引物相同引物相同。（2）長探針（3 探針）：60-450bp，包括一個位于其5未端并與靶序列完全互補的雜交序列和一個位于其3端23nt的共有序列及兩序列間經(jīng)設(shè)計的長度特異性的填充片段，其共有序列與與未記的未記的PCR引物互補引物互補。四、多重連接探針擴增PCR (Multiplex ligation-dependen

22、t probe amplication, MLPA)2.MLPA的反應(yīng)步驟（1）雜交： 兩條探針內(nèi)部的雜交序列可與靶序列雜交，如果待測DNA中某探針的靶序列突變或缺失，則該探針不能完成完整的雜交反應(yīng)。（2）連接： 若其中一條探針的雜交序列與待測序列不完全互補，甚至只有一個堿基不互補，也會使該探針雜交不完全而使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。（3）擴增： 以連接完全探針為模板進(jìn)行PCR擴增，而不是擴增樣品靶序，探針5端有19nt（與引物相同）,3端有一段25-43nt的共同序列（與引物互補），利用同一對引物，對成功連接的探針進(jìn)行擴增。（4）電泳： 不同靶基因長鏈探針含不同長度的填充片段，擴增產(chǎn)物長段也不同。相

23、鄰產(chǎn)物的長度相差6-8bp，探針長度在130-480nt之間，因此可同時檢測基因組中多達(dá)40種不同的靶序列。MLPA反應(yīng)步驟（二）MLPA的應(yīng)用1.檢測人類基因組拷貝數(shù)2.檢測染色體重排3.檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）和基因突變4.腫瘤方面檢測5.轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型實驗室分區(qū)管理平面圖實驗室分區(qū)管理平面圖第五節(jié) 臨床基因擴增檢驗的質(zhì)量管理 一、實驗室設(shè)置和人員資質(zhì)試劑準(zhǔn)備區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)（區(qū)）區(qū)）v試劑準(zhǔn)備區(qū)的儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣試劑準(zhǔn)備區(qū)的儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器和離心機等。儀器除了要專用外，還應(yīng)有器、混勻器和離心機等。儀器除了要專用外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。定期校準(zhǔn)。v試劑的分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行。試劑的分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行。標(biāo)本處理區(qū)（標(biāo)本處理區(qū)（區(qū)）區(qū)）基因擴增檢測區(qū)（基因擴增檢測區(qū)（區(qū)）區(qū)）空白對照空白對照陰性對照陰性對照弱陽性對照弱陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品（四種不同濃度）標(biāo)準(zhǔn)品（四種不同濃度）質(zhì)控品質(zhì)控品待測樣本待測樣本二、臨床基因擴增檢驗過程的質(zhì)量管理1、分析前質(zhì)量管理 保證臨床樣本的有效性 保證臨床樣本的原始性2、分析中質(zhì)量管理 包括核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析等環(huán)節(jié) 作業(yè)指導(dǎo)書和程序性文件 充分控制實驗系統(tǒng)中的污染 有完整有效的去污染措施3、分析后質(zhì)量管理 應(yīng)明確規(guī)定檢驗結(jié)果的報告時間和報告內(nèi)容。 還應(yīng)提供與實驗相關(guān)的一些技術(shù)細(xì)節(jié)。