細胞破碎課件

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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,*,,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,,*,細胞破碎,,細胞破碎,1,細胞破碎就是采用,物理,、,化學(xué),、,酶或機械,的方法，在一定程度上破壞細胞,壁,和細胞,膜,，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。,概念,細胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機械的方法，在一定程度上破壞,

2、2,細胞破碎機理圖,,細胞破碎機理圖,3,革蘭氏陽性細菌的細胞壁結(jié)構(gòu),革蘭氏陽性（,G+）,細菌的細胞壁具有較厚（30-40,nm）,而致密的肽聚糖層，多達20層,磷壁酸：是革蘭氏陽性菌的特有的成分，可加強肽聚糖的結(jié)構(gòu)。,革蘭氏陽性細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性（G+）細菌的細胞壁具有,4,革蘭氏陰性細菌的細胞壁,革蘭氏陰性細菌的外膜,壁膜間隙,O-,特異多糖,(,O-polysaccharide),核心多糖(,core-polysaccharide),蛋白質(zhì),類脂,A,(Lipid A),孔蛋白,(脂多糖),磷脂分子,脂蛋白,革蘭氏陰性細菌的細胞壁革蘭氏陰性細菌的外膜壁膜間隙O-特異多,5,細胞

3、破碎課件,6,微生物,革蘭氏陽性細菌,革蘭氏陰性細菌,酵母菌,霉菌,壁厚,/nm,20-80,10-13,100-300,100-250,層次,單層,多層,多層,多層,主要組成,肽聚糖,(40-90%),多糖,胞壁酸,蛋白質(zhì),脂多糖,(1-4%),肽聚糖,(5-10%),脂蛋白,脂多糖,(11-22%),磷脂,蛋白質(zhì),葡聚糖,（,30-40%,）,甘露聚糖,（,30%,）,蛋白質(zhì),(6-8%,）,脂類,(8.5-13.5%),多聚糖,（,80-90%,）,脂類,蛋白質(zhì),細胞壁的結(jié)構(gòu)和特點,微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-,7,細胞破碎的阻力,細菌,破碎的主要阻力來自

4、于,肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大,,酵母,細胞壁破碎的阻力也主要決定于,壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度,和它的厚度,,霉菌,細胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu),,成熟的植物,細胞壁分為初生壁和次生壁,,,細胞破碎的阻力細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀,8,細胞的破影響因素,物理破碎時影響因素：,細胞的大小,形狀,細胞壁的厚度,聚合物的交聯(lián)程度,酶法和化學(xué)法溶解細胞影響因素：,組成,結(jié)構(gòu),,細胞的破影響因素物理破碎時影響因素：,9,不同細胞破碎的難易程度,植物細胞,＞,真菌,（如酵母菌）＞,革蘭氏陽性細菌,＞,革蘭氏陰性細菌,＞動物細胞。,不同細胞破碎的難易程度植物

5、細胞＞真菌（如酵母菌）＞革蘭氏陽性,10,細胞破碎,目標產(chǎn)物的選擇性釋放,,選擇性釋放目標產(chǎn)物，使其他物質(zhì)盡量少地釋放出來，并盡量降低細胞的破碎程度，對下游分離純化有利。,細胞破碎目標產(chǎn)物的選擇性釋放,11,細胞破碎方法,（按是否使用外加作用力）,分 類,作 用 機 理,適 應(yīng) 性,,,,機,械,法,珠磨法,固體剪切作用,可達較高破碎率，,可較大規(guī)模操作,，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難,高壓勻漿法,液體剪切作用,可達較高破碎率，,可大規(guī)模操作,，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌,超聲破碎法,液體剪切作用,對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作,X-press,

6、法,固體剪切作用,破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合,,,,非,機,械,法,酶溶法,酶分解作用,具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差,化學(xué)滲透法,改變細胞膜的滲透性,具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差,滲透壓法,滲透壓劇烈改變,破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用,凍結(jié)融化法,反復(fù)凍結(jié),-,融化,破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物,干燥法,改變細胞膜滲透性,條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活,細胞破碎方法（按是否使用外加作用力）分 類作 用,12,分 類,作用機理,適應(yīng)性,,,,,,物理破碎,高壓勻漿法,液體剪切作用,可達

7、較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌,珠磨法,固體剪切作用,可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難,超聲破碎法,液體剪切作用,對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作,滲透壓法,滲透壓劇烈改變,破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用,反復(fù)凍融法,反復(fù)凍結(jié),-,融化,破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物,干燥法,改變細胞膜的滲透性,條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活,X-press,法,固體剪切作用,破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合,化學(xué)破碎,酶溶法,酶分解作用,具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差,化學(xué)滲透

8、法,改變細胞膜滲透性,具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差,細胞破碎的方法,（按細胞所受作用）,分 類作用機理適應(yīng)性高壓勻漿法液體剪切作用可達較,13,高壓勻漿法,珠磨法,超聲破碎法,滲透壓法,反復(fù)凍融法,干燥法,X-press,法,1.,物理破碎,,,高壓勻漿法珠磨法超聲破碎法滲透壓法反復(fù)凍融法干燥法X-pre,14,,高壓勻漿法（,High-pressure homogenization,）,——,大規(guī)模細胞破碎的常用方法,原理：,細胞懸浮液在,高壓,的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙,高速噴出,，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又,射到靜止的撞擊環(huán)上,，被迫改變方向從

9、出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了,剪切,、,碰撞,及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎,。,高壓勻漿法（High-press,15,高壓勻漿器,高壓勻漿器,16,壓力,,(,工業(yè)生產(chǎn)中常用,55,～,70MPa,的壓力,),,循環(huán)操作次數(shù),(,多次循環(huán),的操作方法,),,,溫度,,高壓勻漿法中影響細胞破碎的因素,:,壓力 (工業(yè)生產(chǎn)中常用55～70MPa的壓力)高壓勻漿法中影,17,不宜采用高壓勻漿法的微生物：,,易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，,較小的革蘭氏陽性菌，,含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）,適用于：微生物細胞和植物細胞的大規(guī)模破碎。,,不宜采用高壓勻

10、漿法的微生物： 易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，適,18,進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于,1mm,）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、,珠子與細胞之間的互相,剪切,、,碰撞,，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。,,珠磨法（,Bead mill,）,①,工作原理：,進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨,19,臥式,臥式,20,WSK,臥式高效全能珠磨機,ZM,系列,臥式密閉珠,(,砂,),磨機,WSK臥式高效全能珠磨機ZM系列臥式密閉珠

11、(砂)磨機,21,②,影響細胞破碎的因素,b.,珠體的裝量,a.,珠體的大小,c.,攪拌速度,d.,操作溫度,e.,被處理細胞的特性,,實驗室規(guī)模，珠徑,0.2mm,，工業(yè)規(guī)模珠徑大于,0.4mm,80,～,90,％,適當,5,～,40℃,珠磨法的破碎率一般控制在,80,％以下,②影響細胞破碎的因素b.珠體的裝量a.珠體的大小c.攪拌速度,22,撞擊破碎,原理：細胞,冷凍后,成為,剛性球體,，再進行,高速撞擊,而破碎,特點：細胞破碎均勻；可通過調(diào)節(jié)載氣壓力控制細胞破碎程度；適用于細胞器（如線粒體、葉綠體）的回收。,,撞擊破碎原理：細胞冷凍后成為剛性球體，再進行高速撞擊而破碎,23,其原理,可能

12、與,空,穴,現(xiàn)象,引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。,,超聲破碎法,（,Ultrasonication,）,超生波破碎細胞時的頻率一般為,15,～,20 kHz,，功率為,100,～,250W,，可分為,槽,式和,探頭直接插入介質(zhì)式,兩種型式。,其原理可能與空穴現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。,24,細胞破碎課件,25,影響超生波破碎的因素,聲強,、,頻率,、,破碎時間,、,介質(zhì)的離子強度、,pH,菌體的濃度和種類。,一般桿菌比球菌易破碎，,G,-,細菌比,G,+,細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時細胞濃度一般在,20,％左右,。,影響超生波破碎的因素聲強、一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G

13、,26,超聲波應(yīng)用,超聲波破碎法在,實驗室和小規(guī)模生產(chǎn),中應(yīng)用較廣。操作時常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷卻到,0,～,5℃,，并且還應(yīng)在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進行,冷卻,。,另外，超聲波產(chǎn)生的,化學(xué)自由基團,能使某些敏感性活性物質(zhì),失活,?？梢酝ㄟ^添加自由基清洗劑如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氫氣預(yù)吹細胞懸浮液來緩和。,超聲波應(yīng)用超聲波破碎法在實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用較廣。操作時,27,將細胞放在,高滲透壓,的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達平衡后，,轉(zhuǎn)入到滲透壓低,的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞,溶脹，,甚至破裂。,滲透壓沖擊法,（,Osmotic pressure,

14、）,僅適用于,細胞壁,較脆弱,的細胞或細胞壁預(yù)先,用酶處理,或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），,使細胞壁有缺陷，強度減弱。,將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達,28,將細胞放在,低溫下突然冷凍,而在,室溫,下緩慢融化，,反復(fù)多次,而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。,,反復(fù)凍融法,缺點：適用于,細胞壁,較脆弱,的菌體,，,破碎率較低,，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。,將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達到破,29,使,細胞膜結(jié)合水

15、分喪失,，從而改變細胞的,滲透性,。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來,。,（,6,）干燥法,氣流干燥,真空干燥,噴霧干燥,冷凍干燥,,氣流干燥,主要適用于酵母菌,，,一般在,25,～,30℃,的氣流中吹干；,真空干燥,多用于細菌,；冷凍干燥,適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì),。,,使細胞膜結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇,30,此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至,-,25℃,形成冰晶體，利用,500MPa,以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔擠出，由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而破碎。,（,7,）,X-press,法,該法,主要用于實驗

16、室,，,具有,使用范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高,等優(yōu)點,。,不適用于對冷凍敏感的物質(zhì)。,此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500,31,酶溶法,化學(xué)試劑破碎法,外加酶法,自溶法,表面活性物質(zhì),EDTA,螯合劑,有機溶劑,變性劑,,2.,化學(xué)破碎,（,Chemical permeation,）,,酶溶法化學(xué)試劑破碎法外加酶法表面活性物質(zhì)2.化學(xué)破碎（Che,32,（,1,）酶溶法,（,Enzymatic Lysis,）,①,外加酶法,常用的溶酶,G,+,,溶菌酶、適量抑制劑,G,-,,溶菌酶、,EDTA,放線菌 溶菌酶,酵母菌,β-,葡聚糖酶,霉

17、菌 幾丁質(zhì)酶、,植物 纖維素酶、半纖維素酶,,細胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物,（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）①外加酶法常用,33,選擇性釋放產(chǎn)物，,條件溫和,，核酸泄出量少，細胞外形完整。,溶酶,價格高,，溶酶法,通用性差,（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。,在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,酶溶法的優(yōu)點：,酶溶法的缺點：,選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。溶酶價,34,缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。,,,（,2,）自溶法（,Autolys

18、is,）,誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。微生物細胞的自溶常采用加熱法和干燥法。,影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、,pH,值、緩沖液濃度和細胞代謝途徑等。,缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞,35,某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。,（,2,）化學(xué)試劑破碎法,（,Chemical permeation,）,該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。,,用堿處理細胞，可以溶解除去細胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋

19、白質(zhì)水解成游離的氨基酸。,某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯,36,如,Triton X-100,是一種非離子型清潔劑,，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。,其他的表面活性劑，如,牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫,等也可使細胞破碎。,表面活性劑,可促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞的破碎。,如Triton X-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì),37,處理,G,-,細菌,，對細胞外層膜有破壞作用。,G,-,細菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子,Ca,2+,或,Mg,2+,結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，

20、一旦,EDTA,將,Ca,2+,或,Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。,EDTA,螯合劑,處理G-細菌，對細胞外層膜有破壞作用。G-細菌的外層膜結(jié)構(gòu)通,38,能溶解細胞壁中的磷脂層，使細胞破壞。,有機溶劑,變性劑,鹽酸胍,（,Guanidine hydrochloride,）,和脲,（,Urea,）是常用的變性劑。,常用的有機溶劑,：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高級醇等。,變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。,能溶解細胞壁中的磷脂層，使細胞破壞。有機溶劑變性劑

21、鹽酸胍（G,39,通用性差；,時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過,50%,有些化學(xué)試劑有毒 。,化學(xué)法的優(yōu)點：,缺點：,對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；,細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。,通用性差；化學(xué)法的優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使,40,細胞破碎效果的檢查,破碎率定義,:,被破碎的細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分數(shù)，即,其中,N,0,：原細胞數(shù)，,N,：破碎后殘存的正常細胞。,N,0,和,N,的可通過,直接測定法、目的產(chǎn)物測定法和測定導(dǎo)電率,得到。,細胞破碎效果的

22、檢查 破碎率定義:被破碎的細胞的數(shù)量占原始細胞,41,1.,直接測定法,,,,顯微鏡計數(shù)相對快速簡單，采用染色的方法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。,方法：樣本適當稀釋后，通過,平板計數(shù)技術(shù),或在血球計數(shù)板上用,顯微鏡觀察,來實現(xiàn)染色細胞的技術(shù)。,平板計數(shù)法計數(shù)時間長；只有活細胞才被計數(shù)，誤差大；細胞聚集時，不利計數(shù)。,1.直接測定法顯微鏡計數(shù)相對快速簡單，采用染色的方法把破碎的,42,2.,目標產(chǎn)物測定法,Rm,：理論最大值，,R,：實驗測得值。,將破碎后的細胞懸浮液離心分離細胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與,100%,破碎率所獲得的標準數(shù)值比較，計算其破碎

23、率。,2. 目標產(chǎn)物測定法Rm：理論最大值，R：實驗測得值。將破碎,43,3.,測定導(dǎo)電率,細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。,導(dǎo)電率的大小取決于微生物的種類、處理的條件、細胞的濃度、溫度和懸浮液中原電介質(zhì)的含量等，因此，正式測定前，應(yīng)預(yù)先用其它方法測定標準曲線。,3. 測定導(dǎo)電率細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，,44,選擇破碎方法時，需要考慮下列因素,：,選擇破碎方法的依據(jù),1.,處理量的大小,2.,細胞壁 的強度和結(jié)構(gòu),3.,目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性,4.,破碎后固－液分離的難易程度,適宜的操作條件應(yīng)從,高的產(chǎn)物釋放

24、率,、,低的能耗,和,便于后步提取,這三方面權(quán)衡。,選擇破碎方法時，需要考慮下列因素： 選擇破碎方法的,45,破碎技術(shù)的發(fā)展方向,1.,多種破碎方法相結(jié)合,2.,與上游技術(shù)相結(jié)合,培養(yǎng)過程控制,3.,與下游技術(shù)相結(jié)合,,寄主細胞的選擇,包含體的組成,耐高溫產(chǎn)品的基因表達,克隆噬菌體溶解基因,破碎技術(shù)的發(fā)展方向1. 多種破碎方法相結(jié)合2,46,,一、細胞壁結(jié)構(gòu)和特點,三、細胞破碎率效果的檢驗,二、細胞破碎的方法,四、選擇破碎方法的依據(jù),五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向,小結(jié),一、細胞壁結(jié)構(gòu)和特點三、細胞破碎率效果的檢驗二、細胞破碎的,47,寫在最后,成功的基礎(chǔ)在于好的學(xué)習(xí)習(xí)慣,The found

25、ation of success lies in good habits,48,寫在最后成功的基礎(chǔ)在于好的學(xué)習(xí)習(xí)慣48,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,謝謝聆聽,·,學(xué)習(xí)就是為了達到一定目的而努力去干,,,是為一個目標去戰(zhàn)勝各種困難的過程,,,這個過程會充滿壓力、痛苦和挫折,Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal,謝謝聆聽Learning Is To Achieve A C,49,