北大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)課件 重組DNA技術(shù)

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1、重組重組DNA技術(shù)技術(shù)劉新文北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系劉新文，重組DNA技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的力的DNA分子分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。分子的過程。DNA克隆又稱基因克隆（克隆又稱基因克?。╣ene cloning）。）?；?/p>

2、工程（基因工程（genetic engineering）：）：實(shí)現(xiàn)基因克實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作。又稱重組隆所采用的方法及相關(guān)的工作。又稱重組DNA技技術(shù)（術(shù)（recombinant DNA technology）劉新文，重組DNA技術(shù)一、一、克隆體系：目的基因、載體克隆體系：目的基因、載體DNA、工具酶、宿工具酶、宿主細(xì)胞等主細(xì)胞等 1、目的基因目的基因（target gene）：cDNA或或基因組基因組DNA 2、載體載體(vector)：質(zhì)粒質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、病毒和人工染色體等病毒和人工染色體等 cDNA （complementary DNA）

3、：指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的，與合成的，與RNA（常指常指mRNA）互補(bǔ)的單鏈互補(bǔ)的單鏈DNA,單鏈單鏈cDNA進(jìn)而合成雙鏈進(jìn)而合成雙鏈cDNA?；蚪M基因組DNA（genomic DNA）：代表一個(gè)細(xì)胞或生代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有物體整套遺傳信息的所有DNA序列，稱為基因組序列，稱為基因組DNA。劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）：存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀：存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈雙鏈DNA分子，在細(xì)胞中可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制并在細(xì)分子，在細(xì)胞中可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制并在細(xì)胞分裂時(shí)恒定地傳給子代細(xì)胞。胞分裂時(shí)恒定地傳給子代細(xì)胞。3.1 限制性核酸內(nèi)切酶限制

4、性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease):存存在于細(xì)菌體內(nèi)，能夠識(shí)別和切割雙鏈在于細(xì)菌體內(nèi)，能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA內(nèi)部特定內(nèi)部特定核苷酸序列的一類核酸酶。核苷酸序列的一類核酸酶。3、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、酶、DNA酶，等酶，等 常用的是常用的是IIII類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 許多限制性核酸內(nèi)切酶許多限制性核酸內(nèi)切酶IIII的識(shí)別序列屬于回文結(jié)構(gòu)的識(shí)別序列屬于回文結(jié)構(gòu)劉新文，重組DNA技術(shù)配伍末端（配伍末端（compat

5、ible end）：）：不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的相同粘性末端生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大腸桿菌聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、全酶）、Klenow片段片段(Klenow 酶酶)、T4 DNA聚合酶以及聚合酶以及Taq酶等酶等 3.3 DNA連接酶連接酶T4 連接酶：可用于粘端與平端的連接連接酶：可用于粘端與平端的連接 4、宿主細(xì)胞：大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、宿主細(xì)胞：大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞 劉新文，重組DNA技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) DNA克隆的基本過程克隆的基本過程 分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表達(dá)分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表達(dá)一、一、“分分”：目的基因及載體的制備：

6、目的基因及載體的制備 1、分離基因的方法：化學(xué)合成、分離基因的方法：化學(xué)合成、PCR、基因組文庫、基因組文庫、cDNA文庫文庫 聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反應(yīng)體系中加入模板在反應(yīng)體系中加入模板DNA、dNTP、特別設(shè)計(jì)的特特別設(shè)計(jì)的特異引物及耐熱的異引物及耐熱的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），經(jīng)多次酶），經(jīng)多次變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)，使目的變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA呈指數(shù)合呈指數(shù)合成的過程成的過程 劉新文，重組DNA技術(shù)cDNA文庫文庫(cDNA library)：以：以mRNA為模板，利用為模板，利

7、用反轉(zhuǎn)錄酶合成與反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制成雙鏈再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有體菌包含了所有cDNA信息，總稱信息，總稱cDNA文庫文庫。常用常用于篩選編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。于篩選編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因?；蚪M基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)：利用限制利用限制性核酸內(nèi)切酶將組織或細(xì)胞染色體性核酸內(nèi)切酶將組織或細(xì)胞染色體DNA切割后，與切割后，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有基因組基因組DNA信息，總稱

8、基因組信息，總稱基因組DNA文庫文庫 劉新文，重組DNA技術(shù) 2、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA 克隆載體（克隆載體（cloning vector）：）：用于目的基因的克隆、用于目的基因的克隆、擴(kuò)增、序列分析和體外定點(diǎn)突變等擴(kuò)增、序列分析和體外定點(diǎn)突變等 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector)：用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源目的基因，獲得大量表達(dá)產(chǎn)物外源目的基因，獲得大量表達(dá)產(chǎn)物 二、二、“切切”：限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體：限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNA 三、三、“接接”：重組體的構(gòu)建：重組體的構(gòu)建 四、四、“轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)”：

9、重組：重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 1、轉(zhuǎn)化（、轉(zhuǎn)化（transformation）：）：將質(zhì)?；蚱渌庠磳①|(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞(常用大腸桿菌常用大腸桿菌)，并使其獲得新的表型，并使其獲得新的表型的過程的過程 劉新文，重組DNA技術(shù) 2、轉(zhuǎn)染（、轉(zhuǎn)染（transfection）：）：將外源將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程的過程 3、感染（、感染（transfection）：以）：以l l噬菌體、柯斯質(zhì)粒和噬菌體、柯斯質(zhì)粒和病毒為載體的重組病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適

10、當(dāng)?shù)募?xì)有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）五、五、“篩篩”：篩選出含重組：篩選出含重組DNA的受體細(xì)胞的受體細(xì)胞 1、直接選擇法：遺傳標(biāo)記、直接選擇法：遺傳標(biāo)記【抗藥性標(biāo)志選擇、營養(yǎng)抗藥性標(biāo)志選擇、營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)篩選法及分子標(biāo)記（缺陷型的互補(bǔ)篩選法及分子標(biāo)記（PCR、分子雜交）分子雜交）】2、非直接選擇法：免疫化學(xué)法、酶聯(lián)免疫檢測法、非直接選擇法：免疫化學(xué)法、酶聯(lián)免疫檢測法 劉新文，重組DNA技術(shù)六、六、“表達(dá)表達(dá)”：使克隆基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制、表：使克隆基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)達(dá) 1、外源

11、基因在原核細(xì)胞的表達(dá)、外源基因在原核細(xì)胞的表達(dá) 大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)體系大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)體系 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體性的包涵體 2、真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等、真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等 劉新文，重組DNA技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)與分子醫(yī)學(xué)的關(guān)系技術(shù)與分子醫(yī)學(xué)的關(guān)系 疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、DNA診斷、基因診斷、基因治療及遺傳病的防治治療及遺傳病的防治 一、疾病相關(guān)基因分析一、疾病相關(guān)基因分析 1、功能克?。?、功能克隆（functi

12、onal cloning）：）：根據(jù)基因的功能根據(jù)基因的功能（通常是根據(jù)其蛋白質(zhì)）產(chǎn)物來尋找、克隆與疾病相（通常是根據(jù)其蛋白質(zhì)）產(chǎn)物來尋找、克隆與疾病相關(guān)的基因關(guān)的基因 2、定位克?。?、定位克?。╬ositional cloning）：）：從一種致病基因從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因 二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 劉新文，重組DNA技術(shù) 三、基因診斷三、基因診斷基因診斷：利用分子生物學(xué)的基本原理和技術(shù)，在基因診斷：利用分子生物學(xué)的基本原理和技術(shù)，在DNA或或RNA水平上分析、鑒定與某些疾病有關(guān)基因水平上分析、鑒

13、定與某些疾病有關(guān)基因的改變（基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平的異常）的改變（基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平的異常）遺傳病的產(chǎn)前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些遺傳病的產(chǎn)前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學(xué)鑒腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學(xué)鑒定等定等 四、四、基因治療基因治療 基因治療（基因治療（gene therapy）：）：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而達(dá)到治療疾患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而達(dá)到治療疾病目的的方法病目的的方法 劉新文，重組DNA技術(shù) 1、基因治療的方法、基因治療的方法（分類）（分類）（1）基

14、因矯正（）基因矯正（gene correction）：）：將致病基因的異將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而保留正常部分常堿基進(jìn)行糾正，而保留正常部分（2）基因置換（）基因置換（gene replacement）：）：正?；蛲ㄟ^同正常基因通過同源重組，原位置換疾病基因源重組，原位置換疾病基因（3）基因增補(bǔ)（）基因增補(bǔ)（gene augmentation）：）：正常基因非定正常基因非定點(diǎn)整合，補(bǔ)償疾病基因的功能或使原有功能加強(qiáng)點(diǎn)整合，補(bǔ)償疾病基因的功能或使原有功能加強(qiáng)（4）基因失活（）基因失活（gene inactivation）：）：采用各種方式抑采用各種方式抑制或破壞某種基因的表達(dá)，如反義制或

15、破壞某種基因的表達(dá)，如反義RNA和和RNA干擾干擾(RNAi)技術(shù)、核酶與三鏈技術(shù)、核酶與三鏈DNA、基因敲除（基因敲除（gene knock-out）等等 劉新文，重組DNA技術(shù)概述概述1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技術(shù)成功一、克隆與克隆化克隆即指同一副本或拷貝（copy）的集合；獲取同一拷貝的過程叫克隆化。【實(shí)例】肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞單一肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞繁殖-細(xì)胞克隆自眾多分子中分離獲得相同分子，即為分子可隆，在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域所談的分子可隆專指DNA可隆.劉新文，重組DNA技術(shù)一、質(zhì)粒的特點(diǎn)：1、環(huán)狀DNA，2kb數(shù)百kb。2、某些質(zhì)?？梢灾亟M到染色體中復(fù)制，形成附加體。質(zhì)粒

16、載體質(zhì)粒載體 3、質(zhì)粒的遺傳信息可以賦予細(xì)胞某些性狀（抗藥性等），這些形狀的有無常用于鑒定質(zhì)粒是否存在于活細(xì)胞中。4、質(zhì)粒復(fù)制分兩型嚴(yán)謹(jǐn)型、松弛型劉新文，重組DNA技術(shù) 松弛控制性質(zhì)粒，拷貝數(shù)多，不受細(xì)胞內(nèi)染色體控制。5、質(zhì)粒含易位子和易位現(xiàn)象。易位子是質(zhì)粒上的特定DNA序列，它可以從所在質(zhì)粒易位于其它質(zhì)粒或染色體中，它對(duì)細(xì)菌的進(jìn)化有意義。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 嚴(yán)謹(jǐn)控制型質(zhì)粒，拷貝數(shù)少，復(fù)制受染色體控制。劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體理想載體的條件：理想載體的條件：1、具有自主復(fù)制能力；、具有自主復(fù)制能力；2、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細(xì)胞的染、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細(xì)胞的染色體色體D

17、NA分開；分開；3、分子量相對(duì)較小，能夠容納目的基因；、分子量相對(duì)較小，能夠容納目的基因；4、具有較多單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；、具有較多單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；5、有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記；、有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記；6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。劉新文，重組DNA技術(shù)The constructed plasmid pBR322The constructed plasmid pBR322 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體外源基因插入位外源基因插入位點(diǎn)點(diǎn)EcoEcoR R含一個(gè)復(fù)制起始含一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)點(diǎn)（oriori）抗藥基因抗藥基因terterr r和和ampampr r1977年由Boliver等人

18、自E.coli的天然質(zhì)粒建成。1、克隆載體、克隆載體劉新文，重組DNA技術(shù)An example of an E.coli expression vector.質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體2、表達(dá)載體、表達(dá)載體外源基因插入位點(diǎn)外源基因插入位點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)（oriori）標(biāo)記基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子調(diào)控序列調(diào)控序列核蛋白體結(jié)合序列核蛋白體結(jié)合序列劉新文，重組DNA技術(shù)噬菌體載體噬菌體載體 常用噬菌體：噬菌體載體、M13噬菌體 1、噬菌體載體（1）結(jié)構(gòu)：線性雙鏈DNA，由三個(gè)片段組成（左臂、中央、右臂）；感染細(xì)菌后，可以形成封閉環(huán)分子。（2）兩類載體置換型載體：適于基因組DNA克隆。插入型載體：適于cD

19、NA克隆。劉新文，重組DNA技術(shù)其它類型載體其它類型載體 一、一、柯斯柯斯質(zhì)粒（質(zhì)粒（cosmid）二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體三、三、Ti質(zhì)粒質(zhì)粒 可重組可重組可重組可重組45kb45kb的大片段的大片段的大片段的大片段 適用于動(dòng)物細(xì)胞的基因工程適用于動(dòng)物細(xì)胞的基因工程適用于動(dòng)物細(xì)胞的基因工程適用于動(dòng)物細(xì)胞的基因工程 用于植物細(xì)胞基因工程用于植物細(xì)胞基因工程用于植物細(xì)胞基因工程用于植物細(xì)胞基因工程劉新文，重組DNA技術(shù)其它類型載體其它類型載體 四四、酵酵母母人人工工染染色色體體（YAC）劉新文，重組DNA技術(shù)一、限制一、限制-修復(fù)體系修復(fù)體系（restriction-modifica

20、tion systemrestriction-modification system）在細(xì)菌中與限制性內(nèi)切酶同時(shí)共存有一種甲基化酶，兩種酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾體系 內(nèi)切酶：切除限制外源DNA甲基化酶：保護(hù)自身DNA限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)二、限制性內(nèi)切酶分類：二、限制性內(nèi)切酶分類：依據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂介方式分為三類1、三個(gè)亞基組成的限制酶即有內(nèi)切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+,S腺苷甲硫氨酸切割：特異性差，切割識(shí)別位點(diǎn)約400-700bp或更遠(yuǎn)的DNA。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸

21、內(nèi)切酶即有內(nèi)切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：識(shí)別位點(diǎn)周圍25-27 bp內(nèi)2、兩個(gè)亞基組成的限制酶 3、一個(gè)亞基的限制酶：常稱作限制性內(nèi)切酶只有內(nèi)切酶活性，無甲基化酶活性不需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：特異位點(diǎn)內(nèi)劉新文，重組DNA技術(shù)酶識(shí)別序列結(jié)構(gòu)呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱又叫作回文結(jié)構(gòu)(palindrome)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶【經(jīng)典舉例經(jīng)典舉例】Eco RI5端-GAATTC-3端3端-CTTAAG-5端劉新文，重組DNA技術(shù)The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence.The

22、dimeric enzyme(with its two subunits in gray and light blue)is shown bound to DNA.In the top view the DNA binding site is facing the viewer.In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物：具有5磷酸基和3羥基基團(tuán)由于酶的作用不同可以

23、產(chǎn)生三種切割末端。（1）5突出末端：如Eco RI 55端端-GAATTC-GAATTC-33端端33端端-CTTAAG-5-CTTAAG-5端端 5 AATTC-35 AATTC-33 G-53 G-5 5-5-G G 333-CTTAA 53-CTTAA 5 酶識(shí)別DNA序列的長短不同，一般為4-18bp劉新文，重組DNA技術(shù)（3）平頭鈍性末端：如Hpa I限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶55端端-GTTAAC-3-GTTAAC-3端端33端端-CAATTG-5-CAATTG-5端端5-GTT 35-GTT 33-CAA 53-CAA 55 AAC-35 AAC-33 TTG-53 TTG

24、-5（2）3突出末端：如Pst I 55端端-CTGCAG-CTGCAG-33端端33端端-GACGTC-5-GACGTC-5端端 5-CTGCA 35-CTGCA 33-G 53-G 5 5G5G-333 ACGTC-53 ACGTC-5劉新文，重組DNA技術(shù)工具酶工具酶 功功 能能 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列、切割識(shí)別特異序列、切割DNADNA DNADNA連接酶連接酶 連接連接DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷

25、酸化 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 在在3 3 羥基末端進(jìn)行多聚物加尾羥基末端進(jìn)行多聚物加尾 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟1、分、分2、切、切3、接、接5、篩、篩4、轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)6、表達(dá)、表達(dá)劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術(shù)一、化學(xué)合成法目的基因的獲得目的基因的獲得對(duì)已知基因的核苷酸序列，或蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推導(dǎo)對(duì)已知基因的核苷酸序列，或蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推導(dǎo)出

26、該多肽編碼的核苷酸序列，用出該多肽編碼的核苷酸序列，用DNADNA合成儀經(jīng)化學(xué)方法合成合成儀經(jīng)化學(xué)方法合成此基因。此基因?！九e例舉例】胰島素原胰島素原、心鈉素等心鈉素等二、基因組DNA文庫（鳥槍無性繁殖法）劉新文，重組DNA技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得OH 3 OH 3 OH 3 Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA t

27、emplatecDNADNA polymerase IdNTPsAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTTnT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNA三三、cDNA文文庫庫的的建建立立劉新文，重組DNA技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得四、DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）劉新文，重組DNA技術(shù)重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建一、一、粘性末端連接粘性末端連接 1 1、同一限制酶切割位點(diǎn)連接，堿基配對(duì)結(jié)合成重、同一限制酶切割位點(diǎn)連接，堿基配對(duì)結(jié)合成重組分子。組分子。2 2、不同限制酶切割位點(diǎn)連接，因有相

28、同末端，經(jīng)、不同限制酶切割位點(diǎn)連接，因有相同末端，經(jīng)配伍后連接配伍后連接劉新文，重組DNA技術(shù)DNA片段片段A DNA片段片段B 5G G A T C CG G A T C C35A G A T C T33C C T A G GC C T A G G53T C T A G A5 不同的限制性內(nèi)切酶水解不同的限制性內(nèi)切酶水解混合后經(jīng)混合后經(jīng)DNA連接酶連接連接酶連接BamHI BglIIGG G A T C TC C T A G C C T A G A G G G A T C TC C T A G C C T A G A 粘端粘端重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建配伍末端連接配伍末端連接劉新文，重組DNA技術(shù)

29、Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined.重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long.粘端的生成粘端的生成劉新文，重組DNA技術(shù)二、平端連接二、平端連接 平端在平端在T T4 4連接酶作用下可以連接。連接酶作用下可以連接。三、同

30、聚物加尾連接三、同聚物加尾連接 利用同聚物序列，如聚利用同聚物序列，如聚A A與聚與聚T T之間經(jīng)退火作用完之間經(jīng)退火作用完成連接，需末端轉(zhuǎn)移酶。成連接，需末端轉(zhuǎn)移酶。四、人工接頭連接四、人工接頭連接 用人工和成某酶切割序列的接頭，與用人工和成某酶切割序列的接頭，與DNADNA平端相連平端相連后形成粘性末端再連接。后形成粘性末端再連接。重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建劉新文，重組DNA技術(shù)重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建劉新文，重組DNA技術(shù)兩個(gè)技術(shù)：制備感受態(tài)細(xì)胞和導(dǎo)入方法。兩個(gè)技術(shù)：制備感受態(tài)細(xì)胞和導(dǎo)入方法。一、感受態(tài)細(xì)胞制備一、感受態(tài)細(xì)胞制備 經(jīng)某些方法處理后，具備接受外界經(jīng)某些方法處理后，具備接受外界DNAD

31、NA 能力的細(xì)能力的細(xì)胞，稱為感受態(tài)細(xì)胞。胞，稱為感受態(tài)細(xì)胞。目前常用的多為目前常用的多為E.E.Coli Coli k-12 k-12株的衍生物。株的衍生物。限制酶缺陷型使導(dǎo)入限制酶缺陷型使導(dǎo)入DNADNA免遭降解免遭降解 。重組缺陷型，以保證導(dǎo)入重組缺陷型，以保證導(dǎo)入DNADNA完成獨(dú)立存在完成獨(dú)立存在 ，不與，不與細(xì)菌中基因組細(xì)菌中基因組DNADNA重組。重組。重組體導(dǎo)入細(xì)胞重組體導(dǎo)入細(xì)胞劉新文，重組DNA技術(shù) 針對(duì)載體攜有某些標(biāo)志基因或目的基因的篩選方針對(duì)載體攜有某些標(biāo)志基因或目的基因的篩選方法，直接測定基因及表型。法，直接測定基因及表型。1 1、抗藥性標(biāo)志選擇、抗藥性標(biāo)志選擇含抗藥性

32、基因的載體（含抗藥性基因的載體（ampampTetTetKamKam）轉(zhuǎn)入的細(xì)轉(zhuǎn)入的細(xì)菌，可在含該藥物的培養(yǎng)板上形成菌斑，進(jìn)行初步篩菌，可在含該藥物的培養(yǎng)板上形成菌斑，進(jìn)行初步篩選。選。2 2、標(biāo)志補(bǔ)救、標(biāo)志補(bǔ)救導(dǎo)入基因的表達(dá)產(chǎn)物與受體菌的營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，利導(dǎo)入基因的表達(dá)產(chǎn)物與受體菌的營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，利用營養(yǎng)突變株篩選叫標(biāo)志補(bǔ)救。用營養(yǎng)突變株篩選叫標(biāo)志補(bǔ)救。重組子的篩選重組子的篩選一、直接篩選法一、直接篩選法劉新文，重組DNA技術(shù)【實(shí)例實(shí)例】M13M13載體含載體含-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端序列，而突端序列，而突變株細(xì)菌中可表達(dá)變株細(xì)菌中可表達(dá)-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端序列，只有在端序列，

33、只有在兩者共同表達(dá)時(shí)，才有酶的活性。兩者共同表達(dá)時(shí)，才有酶的活性。x-galx-gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶蘭色蘭色x-galx-gal缺少缺少-半乳糖苷酶半乳糖苷酶白色白色重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù) 3 3、分子雜交法、分子雜交法：用：用3232p p標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的重組纖維素膜上的重組DNADNA片段進(jìn)行雜交，直接鑒定目的片段進(jìn)行雜交，直接鑒定目的基因?；?。用特異的抗體與目的基因的表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行用特異的抗體與目的基因的表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選。篩選。二、免疫學(xué)方法二、免疫學(xué)方法重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù)

34、重組子的篩選重組子的篩選藍(lán)藍(lán)藍(lán)藍(lán)白白白白斑斑斑斑篩篩篩篩選選選選劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選Identifying a clone with the desired DNA segment 氨基酸序列氨基酸序列預(yù)預(yù)測測核核苷苷酸酸序序列列分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交劉新文，重組DNA技術(shù)【實(shí)例實(shí)例實(shí)例實(shí)例】脆性脆性x x綜合征（綜合征（fragile x syndromefragile x syndrome）：）：一種一種精神癡呆，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有些精神癡呆，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有些DNADNA含脆性位點(diǎn)，含脆性位點(diǎn)，并鑒定出含脆性位點(diǎn)并鑒定出含脆性位點(diǎn)DNADNA序列的特殊標(biāo)

35、志，但致病序列的特殊標(biāo)志，但致病的分子機(jī)制不清楚，的分子機(jī)制不清楚，19911991年用年用YACYAC克隆及分子雜交克隆及分子雜交技術(shù)證明脆性位點(diǎn)是一個(gè)（技術(shù)證明脆性位點(diǎn)是一個(gè)（CGGCGG）n n重復(fù)序列。正重復(fù)序列。正常人含常人含6-546-54，病人高達(dá)數(shù)百個(gè)（，病人高達(dá)數(shù)百個(gè)（200200）。重復(fù)序列）。重復(fù)序列的增多使所在基因的增多使所在基因FMR-1FMR-1不能轉(zhuǎn)錄出正確的不能轉(zhuǎn)錄出正確的mRNAmRNA，受累者出現(xiàn)綜合征。受累者出現(xiàn)綜合征?；蚬こ痰膽?yīng)用基因工程的應(yīng)用一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變劉新文，

36、重組DNA技術(shù)基基因因工工程程產(chǎn)產(chǎn)品品劉新文，重組DNA技術(shù)A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed.Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin,the substrate for this lightproducing enzyme(see Box 13-3,Fig.2).Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at y

37、our local nursery anytime soon;the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure.The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因植植物物劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因動(dòng)動(dòng)物物劉新文，重組DNA技術(shù) 2、基本程序、基本程序（

38、1）治療性基因的選擇）治療性基因的選擇（2）載體的選擇）載體的選擇（3）靶細(xì)胞的選擇）靶細(xì)胞的選擇（4）基因轉(zhuǎn)移）基因轉(zhuǎn)移 直接體內(nèi)療法：將外源基因轉(zhuǎn)移到體內(nèi)特定細(xì)胞內(nèi)，直接體內(nèi)療法：將外源基因轉(zhuǎn)移到體內(nèi)特定細(xì)胞內(nèi)，使外源基因得到表達(dá)，從而達(dá)到治療的目使外源基因得到表達(dá)，從而達(dá)到治療的目 間接體內(nèi)療法（細(xì)胞介導(dǎo)）：將外源基因?qū)牒线m間接體內(nèi)療法（細(xì)胞介導(dǎo)）：將外源基因?qū)牒线m的靶細(xì)胞內(nèi)并使其表達(dá)，體外進(jìn)行細(xì)胞增殖后再輸?shù)陌屑?xì)胞內(nèi)并使其表達(dá)，體外進(jìn)行細(xì)胞增殖后再輸回病人體內(nèi)，使基因在體內(nèi)表達(dá)以達(dá)到治療的目的回病人體內(nèi)，使基因在體內(nèi)表達(dá)以達(dá)到治療的目的（5）外源基因表達(dá)的篩檢）外源基因表達(dá)的篩檢（6）回輸體內(nèi)）回輸體內(nèi)