生物芯片技術(shù)及應(yīng)用.ppt

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1、生物芯片技術(shù)及其應(yīng)用 1.What is a microarray Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過(guò)在一微小的基片表面固定大量的分子識(shí)別探針，或構(gòu)建微分析單元和系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞或其它生物組分準(zhǔn)確、快速、大信息量的篩選或檢測(cè)。 A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene products. 1.What is

2、 a microarrayFour distinct characteristics of microarray : Microscopic target elements or spots; Planar substrates; Rows and columns of elements; Specific binding between microarray target element on the substrate and probe molecules in solution. 1.What is a microarrayWhich is the probe?and which is

3、 the target?There are some differences between China and United States of America.In U.S.A. the probe are usually in solution.In China the probe is a reagent to detect target from sample. Biochips的主要類(lèi)別 蛋白芯片 Protein chips(protein microarray)： 肽芯片，蛋白芯片 基因芯片 Gene chips（Gene microarray）： 靶DNA芯片，多探針芯片 芯片

4、實(shí)驗(yàn)室Laboratory-on-a-chip or Microfluidics-based chip 2.Microarray manufacturingThe three main manufacturing methods: Contact printing:uses direct contact between the printing implement or the sample contained in the implement and the microarray substrate; Noncontact printing:on-the-fly printing inclu

5、ding ink-jet tech.,microsolenoid tech.,and thermal bubble jet dispenser; Semiconductor tech: photolithographic masks and micromirrors. Microscopic elements:Semiconductor tech produce 1530m features Printed spot size is 50350 m Tissue spot is 200600 m Macroarrays contain sample spot sizes of about 30

6、0 microns or larger microarray are typically less than 200 microns in diameter Gene chips的制備 在片原位光刻合成 O d NTP- 5-光敏保護(hù)基因光照O dNTP-OH + dNTP -5-保護(hù)基因 在片原位噴印合成 Gene chips的制備cDNA點(diǎn)樣法醛基修飾玻片 Silanized slide（與DNA上氨基反應(yīng)） Silane slide氨基修飾玻片 Silylated slide（UV照射與DNA交聯(lián)） Polylysine slide玻片氨基化舉例： Nytran尼龍膜 點(diǎn)樣前變性 變性的

7、終濃度10.4N NaOH/10mM EDTA， 變性的擴(kuò)增産物被點(diǎn)樣到Nytran尼龍膜上， 用120mj/cm2UV交聯(lián)固定(Stratalinker 1800, Stratagene) 點(diǎn)樣后變性 PCR擴(kuò)增産物被點(diǎn)入(或布陣)至Nytran尼龍膜 上之後,在0.4N NaOH/3M NaCl中浸濕5分鐘變 性DNA,隨後放在用6SSC浸濕5分鐘中和，再 用120mj/cm 2UV交聯(lián)固定。 我們有世界第一部量產(chǎn)的點(diǎn)樣機(jī)及相關(guān)的配套生產(chǎn)線 核酸的雜交 常用的雙色熒光標(biāo)記試劑有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。它們?cè)诜崔D(zhuǎn)錄過(guò)程中在DNA中的結(jié)合性好，激發(fā)和發(fā)射譜的間距大，以及光量子產(chǎn)率高

8、。亦可標(biāo)記酶和生物素。核酸的雜交 基因芯片實(shí)驗(yàn)程序 基因芯片實(shí)驗(yàn)程序 Gene chips的應(yīng)用 病原體的檢出 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜 位點(diǎn)突變 遺傳性疾病 測(cè)序 耐藥基因檢測(cè) 疾病的分子分型 HLA分型 pP TATGCAATCTAG CGTTAGAT ACGTTAGA ATACGTTAGATC TACGTTAG 由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC 雜交探針組 TATGCAATCTAG 重組的互補(bǔ)序列 靶序列 TACGTTAG ACGTTAGA ATACGTTA CGTTAGAT GTTAGATC 基因芯片的測(cè)序原理圖 ATACGTTA 蛋白芯片的原理1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或

9、吸附在膜上 不均等硝酸纖維膜的空氣面結(jié)構(gòu) SEM A E 100 (12 m ), air side, 500 x 背裱濾紙的硝酸纖維膜橫切面圖 SEM FT 020 (0.2 m), cross-section, 150 x 2. 抗體或抗抗體標(biāo)記示蹤酶：HRPO、AKP膠體金熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等 P O T O M A C 點(diǎn)抗原測(cè)抗體 3.檢測(cè)標(biāo)本中的抗體或抗原 P O T O M A C 點(diǎn)抗原測(cè)抗體 P O T O M A C 點(diǎn)抗體測(cè)抗體捕獲法 P O T O M A C 點(diǎn)抗體測(cè)抗原 P O T O M A C 滲濾式蛋白芯片的設(shè)計(jì) 將應(yīng)用物品

10、先準(zhǔn)備好。檢測(cè)實(shí)例 在晶片盒視窗內(nèi)滴加3滴試劑A，必要時(shí)用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。 待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢血清100l。 待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。 待試劑B完全滲入後，滴加10滴試劑C。 待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。 反應(yīng)完畢後0.5小時(shí)內(nèi)，將晶片放入晶片閱讀系統(tǒng)進(jìn)行閱讀分析。 大淵的PBT-X2-02型生物芯片識(shí)別儀器組成。 Protein chip的應(yīng)用 微生物感染病原體抗原、抗體的檢測(cè)自身抗體的檢測(cè) 特定蛋白的檢測(cè) HLA分型 過(guò)敏原檢測(cè) 腫瘤標(biāo)志的檢出 大淵結(jié)核菌多種抗原的 抗體檢測(cè)蛋白芯片系統(tǒng)特異性抗原：LAM、16KDa和38KDa蛋白L

11、AM：脂阿拉伯甘露糖，其它分枝桿菌不具備或其含量甚低；38KDa蛋白：較牛分枝桿菌高10倍以上；16KDa蛋白：存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(人型、牛型、非洲型)中，其它分枝桿菌（MOTT）不存在。其綜合檢出率可以達(dá)到93% 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的脂阿拉伯甘露糖（LAM）是細(xì)胞壁重要組成成分。結(jié)核菌的LAM含量比其他分枝桿菌的含量高許多，因此許多研究都認(rèn)為檢測(cè)病人血清中的抗LAM抗體是診斷結(jié)核病的重要標(biāo)志之一。 LAM要分布于細(xì)胞壁表面，組成成份為碳水化合物。 主要生物學(xué)活性 1) 抗原性 2) 抑制T淋巴細(xì)胞增殖 3) 破壞巨噬細(xì)胞的干擾素活化 4

12、) 清除有毒的自由基 5) 抑制蛋白激酶等的活性 目前，LAM的主要用途是將其作為主要的包被或者點(diǎn)樣抗原，以檢測(cè)結(jié)核患者血清中的相應(yīng)抗體，用于結(jié)核病的診斷。 結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖（以下簡(jiǎn)稱(chēng)LAM） 結(jié)核分枝桿菌MPT63抗原（16KDa） 結(jié)核菌MPT63主要存在于培養(yǎng)濾液中，分子量達(dá)16kDa，其基因?yàn)镸PT63，表達(dá)159氨基酸（aa）的蛋白質(zhì)，29aa為信號(hào)肽，130aa為成熟蛋白。MPT63可在感染結(jié)核菌的豚鼠誘發(fā)體液免疫。MPT63基因僅發(fā)現(xiàn)于結(jié)核菌復(fù)合群（M tuberculosis complex, MTC）。MPT63與常見(jiàn)的鳥(niǎo)分枝桿菌（M avium）的蛋白沒(méi)有血清交叉

13、反應(yīng)。 MPT63抗原的種特異性：非MTC分枝桿菌缺乏MPT63，表明MPT63是一個(gè)MTC特異性抗原。證據(jù)有二：抗MPT63抗體與純化的MPT63，結(jié)核菌培養(yǎng)濾液，牛分枝桿菌PPD反應(yīng)，而不與鳥(niǎo)分枝桿菌PPD反應(yīng)。另一方面，采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，MPT63與抗MPT63的抗體的反應(yīng)可被牛分枝桿菌PPD顯著抑制，而不被鳥(niǎo)分枝桿菌PPD和BSA（無(wú)關(guān)蛋白）抑制，因此，MPT63沒(méi)有環(huán)境中常見(jiàn)的分枝桿菌抗原表位，其可作為非常有潛力的免疫診斷用 抗原。 結(jié)核分枝桿菌的38kDa蛋白 n 它有不同的名稱(chēng)，在美、日被稱(chēng)為抗原5（Antigen 5）,挪威將其稱(chēng)之為抗原78（Antigen 78）。Coa

14、tes等人利用免疫電泳技術(shù)測(cè)得其分子量為38kDa，故稱(chēng)之為38kDa蛋白n 38kDa 蛋白為脂蛋白，存在于細(xì)胞外 ，含25%碳水化合物，是從細(xì)胞分泌的，理論分子量是為38200Da（含信號(hào)肽），其與細(xì)胞膜或者菌體表面的脂肪結(jié)構(gòu)相連 。 n 38kDa的反應(yīng)性：交叉免疫電泳技術(shù)（crossed immunoeleltrephoresis,CIE）證實(shí)結(jié)核菌和卡介苗均產(chǎn)生38kDa蛋白，但前者的濃度顯著較后者高。n 分枝桿菌中只在結(jié)核菌和牛分枝桿菌（M boris）發(fā)現(xiàn)38kDa蛋白，而且結(jié)核菌的反應(yīng)強(qiáng)度較牛分枝桿菌強(qiáng)10倍 。 n 抗-BCG多價(jià)抗體也能與38kDa蛋白反應(yīng) ，但BCG表達(dá)3

15、8-kDa蛋白的量很低 。n 結(jié)核分枝桿菌38kd抗原特異性100%，與正常健康人、MOTT感染和麻風(fēng)分枝桿菌感染無(wú)交叉。 TB蛋白芯片點(diǎn)陣排布識(shí)別色點(diǎn) 質(zhì)控點(diǎn) LAM16KDa38KDaH2O13 4 24411 2233 1234 大淵結(jié)核芯片系統(tǒng)與DIGFA試劑（上海奧普）檢測(cè)的總符合率 兩法檢測(cè)結(jié)核病人和對(duì)照組共1285份標(biāo)本，均陽(yáng)性326例，均陰性769例，相符總數(shù)為1095例。總符合率為85.21%。 武漢鋼鐵公司總醫(yī)院、哈爾濱市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科、海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院、 江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心 （組長(zhǎng)單位） 檢測(cè)抗結(jié)核分支桿菌LAM、16和38kD抗原的抗體意義： 鑒別痰涂片陽(yáng)性者是否

16、屬于結(jié)核桿菌感染。 提高痰涂片陰性患者的檢出率。 肺外結(jié)核的檢測(cè)。 痰涂陰性者的早期診斷。 可作為判斷對(duì)治療是否有效的指標(biāo)。 大淵心肌梗塞AMI檢測(cè)芯片 肌紅蛋白（Myoglobin）是早期診斷最重要的指標(biāo)1-2小時(shí)值升高 4-8小時(shí)達(dá)到高峰 20-36小時(shí)回到正常肌酸激酶同工酶（CK-MB）是診斷AMI最信賴(lài)的心肌酶3-8小時(shí)值升高 8-24小時(shí)達(dá)到高峰 3天回到正常肌鈣蛋白I（Troponin I）是診斷心肌損傷最主要的指標(biāo)4-8小時(shí)值升高 12-16小時(shí)達(dá)到高峰 5-10天回到正常高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）4-8小時(shí)值升高 12-16小時(shí)達(dá)到高峰 5-10天回到正常 大淵蛋白芯片(A

17、MI)對(duì)照檢測(cè)江蘇省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心上海瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科 湖北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 項(xiàng) 目 對(duì)照試劑 和儀器 例數(shù) 一致性相關(guān) 系數(shù)rc分析CK-MB羅氏ECL2010 524 0.852MB Bayer公司ACS180plus 524 0.915cTnI Bayer公司ACS180plus 524 0.915hs-CRP貝克曼 Immage 524 0.89 大淵STD芯片檢測(cè)系統(tǒng) 本晶片含有UU第一群（含1，3，6，14等四個(gè)血清型）和第二群（含2，4，5，7，8，9，10，11，12，13等十個(gè)血清型）多種抗原，對(duì)兩群十四個(gè)血清型都能檢出。 本晶片含有CT的沙眼生物變種（DK型）和性病淋巴

18、肉芽腫 （ LGV）生物變種可檢出UU/CT感染的85以上。泌尿道感染中UU/CT感染占1/3。 大淵STD芯片對(duì)比檢測(cè)結(jié)果1.江蘇省人民醫(yī)院（組長(zhǎng)醫(yī)院）， 2.安徽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 3.南京皮膚病研究所， 4.武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科 項(xiàng)目 試 劑例數(shù)敏感性(%)特異性(%)CT英國(guó)立明955 88.1 80.7UU法國(guó)梅里埃955 86.1 81.2 大淵TORCH生物芯片大淵TORCH芯片（IgM和IgG） ：檢測(cè)：弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒（、）的抗體用于優(yōu)生優(yōu)育，孕前和孕早期檢測(cè)IgM抗體陽(yáng)性提示現(xiàn)癥感染，IgG抗體陽(yáng)性提示有免疫力。 TORCH

19、檢查的臨床意義 約有30%-46%其弓形體可通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒，直接影響胎兒的發(fā)育，導(dǎo)致畸形，甚至死亡。也可使孕婦流產(chǎn)，早產(chǎn)，死產(chǎn)或增加妊娠并發(fā)癥。 孕婦感染風(fēng)疹病毒后，胎兒出生后多患有白內(nèi)障等眼疾、耳聾、心血管系統(tǒng)缺損、精神運(yùn)動(dòng)性障礙、紫癜等癥狀，重者可發(fā)生死亡和流產(chǎn)。 TORCH檢查的臨床意義 胎兒CMV感染后嚴(yán)重者則引起流產(chǎn)、死產(chǎn)，輕則造成出生體重偏低或畸形。嬰兒先天性感染常帶有明顯的遺留損害危險(xiǎn)，特別是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響較多。新生兒感染后死亡率高，存活者也大都發(fā)生智力降低，神經(jīng)性運(yùn)動(dòng)障礙等。 成人感染HSV的臨床表現(xiàn)往往是局部的，新生兒由于免疫力底下，往往是全身散播性的，其病情較重，病死

20、率高，幸存者往往有終身殘疾。 幽門(mén)螺旋桿菌（HP）IgG抗體蛋白芯片 大 淵 H p 抗 體 芯 片 檢 測(cè) ： 細(xì) 胞 毒 素 相 關(guān) 蛋 白A(CagA) 、尿素酶(Ure)和熱休克蛋白（HSP）臨床意義： 根據(jù)HP菌株有無(wú)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)蛋白表達(dá)將其分為兩型：型是高毒力株，含CagA基因，表達(dá)CagA蛋白；這類(lèi)菌株與胃、十二指腸潰瘍及誘發(fā)癌變密切相關(guān)。 幾乎所有的野生型HP都產(chǎn)生尿素酶(Ure)，Urc抗體的產(chǎn)生是Hp感染的標(biāo)志。 HSP是一種應(yīng)激蛋白， HP與HSP檢測(cè)結(jié)果同為陽(yáng)性，表示HP正在發(fā)揮致病作用，需要及時(shí)治療。另外，研究發(fā)現(xiàn)HSP60與胃癌的發(fā)生有密切的關(guān)連。

21、 大淵自身抗體生物芯片大淵自身抗體芯片：檢測(cè)：dsDNA,Histone,SSA/Ro,SSB/La,Sm,RNP,Jo-1,Scl-70,Rib-P的自身抗體用于自身免疫病的診斷檢查：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、藥物性狼瘡、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎、干燥綜合征等。 P O T O M A C 中國(guó)生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之一 20031128已批準(zhǔn)部份一 C12腫瘤蛋白芯片 湖州數(shù)康二 丙型肝炎病毒抗體芯片 深圳益生堂三 HP蛋白芯片 大淵四 UU CT HPV抗體芯片 大淵 五 地中海貧血基因芯片 P O T O M A C 中國(guó)生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之二 20031128已受理部

22、份一 乙型肝炎病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片二 丙型肝炎病毒抗體芯片三 AMI四項(xiàng)定量蛋白芯片（經(jīng)檢定全部合格） 大淵四 UU CT抗體芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵五 TB抗體檢測(cè)芯片 （經(jīng)檢定全部合格，即將拿到證書(shū)） 大淵六 SARS基因芯片 七 TORCH蛋白芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵八 自身抗體九項(xiàng)檢測(cè)蛋白芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵 P O T O M A C 中國(guó)生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之三 20031128檢定中部份一 HLA-DR分型基因芯片二 HLA-AB分型基因芯片三 SARS流感腸道核酸螢光芯片四 乙丙型肝炎基因芯片五 SARS基因芯片六 TB耐藥基因芯片 大淵七 食品藥物殘留芯片 大淵 大淵蛋白芯片的特點(diǎn)：a. 多種特異性抗原或抗體的同時(shí)檢測(cè)；b. 較單一指標(biāo)明顯提高檢測(cè)的敏感性、特異性；c. 可單人份操作，需時(shí)短，簡(jiǎn)單。 應(yīng)用多種高新技術(shù)：基因重組技術(shù)、單抗技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)、微陣列技術(shù)、圖像數(shù)字信息處理技術(shù)。 P O T O M A C 大淵的發(fā)展第二、三代閱讀儀基因芯片大鼎生物工程公司（計(jì)生產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售）大德實(shí)驗(yàn)診斷中心和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品研發(fā)中心（藥品、疫苗、試劑、保健品、營(yíng)養(yǎng)品及化妝品等的研發(fā)） THANK YOU FOR YOUR ATTENTION !