《實(shí)時(shí)定量PCR》PPT課件

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1、實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） Polymerase Chain Reaction（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)偉大的天才發(fā)現(xiàn)！ 1 2 3 4 522557294 時(shí) 間 （ min）溫度（ ） 適 溫 延 伸3高 溫 變 性1 低 溫 退 火2 重 復(fù) 13步2530輪目 的 DNA片 段擴(kuò) 增 100萬(wàn) 倍 以 上DNA雙 螺 旋 DNA單 鏈與 引 物 復(fù) 性 子 鏈 延 伸DNA加 倍DNA 變性形成2 條單鏈 PCR的基本原理 PCR的基本原理模 板 DNA 94 50-65引 物 1引 物 2 DNA引 物 72 PCR的 基 本 原 理 引 物 1引

2、 物 2 DNA引 物 72Taq酶Taq酶 PCR的 基 本 原 理 v PCR反 應(yīng) 條 件v PCR過(guò) 程v PCR的 特 點(diǎn)第 1輪 結(jié) 束 94第 2輪 開(kāi) 始 PCR的 基 本 原 理 v PCR反 應(yīng) 條 件v PCR過(guò) 程v PCR的 特 點(diǎn) 50-65TaqTaq TaqTaq 72 PCR的 基 本 原 理 v PCR反 應(yīng) 條 件v PCR過(guò) 程v PCR的 特 點(diǎn)第 2輪 結(jié) 束 PCR基本原理 模 板 引 物dNTPPCRPCR反應(yīng)基本要素 1、單、雙鏈DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑DNA結(jié)合蛋白類(lèi) 3、一般100ng DNA模板

3、/100L,模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加（1）模板 1、引物濃度一般為0.1-0.5 mol/L，濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降 2、引物的設(shè)計(jì) （3）Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般為0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 （4）Mg2+ 1、Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，一般用量為0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 2、Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 3、Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。

4、 1、dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 2、四種dNTP濃度應(yīng)相等 3、濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 4、dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）dNTP (1)變 性 使 雙 鏈 DNA解 鏈 為 單 鏈 ,94 30-40s(2)退 火v溫 度 由 引 物 長(zhǎng) 度 和 GC含 量 決 定 。v增 加 溫 度 能 減 少 引 物 與 模 板 的 非 特 異 性 結(jié)合 ;降 低 溫 度 可 增 加 反 應(yīng) 的 靈 敏 性 。 循 環(huán) 參 數(shù)（ 3） 延 伸v68-75 ,一 般 為 72v延 伸 時(shí) 間 由 擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng)

5、度 決 定（ 4） 循 環(huán) 次 數(shù)v主 要 取 決 于 模 板 DNA的 濃 度 ,一 般 為 25-35次v次 數(shù) 過(guò) 多 ,擴(kuò) 增 效 率 降 低 ,錯(cuò) 誤 摻 入 率 增 加 常用PCR反應(yīng)體系 (以H iFi Taq為例)v模板 1.0 Lv上游引物 0.5 Lv下游引物 0.5 Lv10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.5 LvdNTPs 2.0 LvHiFi Taq酶 0.2-0.3 LvddH 2O 補(bǔ)足25 Lv共 25 L 常用PCR反應(yīng)條件v94 2-5minv94 30-40svTm 30-45sv72 1min/1kbv72 10minv12 + 25-35

6、個(gè)循環(huán) 幾種常用PCR技術(shù)vRT-PCR (Reverse Transcription PCR)v反向PCR (Reverse PCR)vRACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends)vqRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄PCR)DNA水平RNA水平蛋白水平 RT-PCR基本原理mRNA AAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverse TranscriptionmRNA AAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTcDNA RT-PCR一般步驟v 1、RNA提取RNA質(zhì)量的檢測(cè)一般R

7、T-PCR要求提取的RNA要有較高的完整性和純度完整性檢測(cè)（1%瓊脂糖膠電泳）純度檢測(cè)（OD260/280） OD260/280一般介于1.9-2.1之間，小于1.9時(shí)蛋白污染；大于2.1時(shí)RNA發(fā)生降解28S1 8S5S v2、反轉(zhuǎn)錄RT-PCR一般步驟在冰盒上加入以下試劑：組成體積隨機(jī)引物或Oligo dT）1L1-5g Total RNA xLDEPC-Treated H 2O yL 體系配制完成后瞬時(shí)離心，70反應(yīng)5min,然后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒，冰浴2-5min,此步驟的作用是去除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 RT-PCR一般步驟組成體積5X Buffer 4LdNTPs 1LRNAse inh

8、ibitor 1LM-MLV 1LDEPC-Treated H 2O xL1、混勻，42，90min2、70，10min，終止反應(yīng)3、A3檢測(cè) 在冰盒上加入以下試劑： 反向PCR (reverse） PCR)v反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。v可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。 反向PCR原理 vcDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于PCR技

9、術(shù)從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA 的5和3末端的有效方法,以其簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的重視。 RACE (rapid-amplification of cDNA ends) AAAAAAAAmRNA接頭序列AAAAAAAAmRNA GeneRacer 3PrimerGSP2 GeneRacer 3Nested PrimerNGSP2Reverse transcription GeneRacer Oligo dT PrimerTTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCGcDNA TTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGC

10、ATCGCATAGCAACTGTCG已知片段RACE 3RACE原理 mRNAAAAAAAmRNANNNNNNNNNNN AAAAAAOligo dTReverse Transcription NGSP1GeneRacer 5Nested Primer GSP1GeneRacer 5 PrimerGeneRacer RNA Oligo Sequence NNNNNNNNNNN接頭序列TTTTTTNNNNNNNNNNN cDNAmRNAAAAAAANNNNNNNNNNN已知片段5RACE原理 qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)v通 過(guò) 熒 光 染 料 或 熒

11、 光 標(biāo) 記 的 特 異 性 探 針 ,對(duì)PCR產(chǎn) 物 進(jìn) 行 標(biāo) 記 跟 蹤 ,實(shí) 時(shí) 在 線(xiàn) 監(jiān) 控 反 應(yīng) 過(guò)程 ,結(jié) 合 相 應(yīng) 的 軟 件 可 以 對(duì) 結(jié) 果 進(jìn) 行 分 析 ,計(jì)算 待 測(cè) 樣 品 的 初 始 模 板 量 。 I 1、SYBR Green 法 SYBR Green 工作原理 SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn) 融解曲線(xiàn)（dissociation curve） 正常有非特異性擴(kuò)增 2、TaqMan探針?lè)?作用機(jī)理TaqMan TaqMan法與SYBR Green I的比較 幾個(gè)重要概念 基線(xiàn)（Baseline） 熒光閾值（threshold）v熒光閾值（threshold）

12、是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線(xiàn)（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。熒光域值是PCR3 15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。 Ct值（ threshold value ）v每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為 Ct 值。v研究表明，各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。反之亦然。 定量PCR的數(shù)學(xué)原理 熒光定量PCR的解析方法 相對(duì)定量?jī)?nèi)參基因目的基因1 20.2 內(nèi)參基因v內(nèi)參基因：qRT-PCR時(shí)，每個(gè)標(biāo)本都要做對(duì)應(yīng)

13、的內(nèi)參，而且每次都是管家基因，一般用-actin，有時(shí)也用GAPDH。v管家基因：又稱(chēng)持家基因(house-keeping genes)生物體各類(lèi)細(xì)胞中都表達(dá)，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是為維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所需而時(shí)刻都在表達(dá)的基因。 內(nèi)參基因的選擇v理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿(mǎn)足以下條件：v 1、不存在假基因，以避免基因 DNA的擴(kuò)增v 2、高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá)v 3、穩(wěn)定表達(dá)于不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），而且其表達(dá)量是近似的，無(wú)顯著性差別v 4、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無(wú)關(guān) v 5、其

14、穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似v 6、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響 常用內(nèi)參基因 家蠶常用內(nèi)參基因vActin3vGAPDHv sw22934 數(shù)據(jù)處理（Ct法） qRT-P C R的優(yōu)點(diǎn)及限制因素vqRT-PCR不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性高、特異性強(qiáng)、有效解決了PCR污染的問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn) qRT-PCR限制因數(shù)v實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴，需要設(shè)置多組重復(fù)和對(duì)照v怎樣避免擴(kuò)增基因組DNA、如何消除和評(píng)定由于樣品處理、儀器的差異和個(gè)人操作而帶來(lái)的誤差以及如何更準(zhǔn)確定量基因？v值得指出的是，qRT-PCR

15、只能定量mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映細(xì)胞中蛋白水平，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄后還有諸多調(diào)節(jié)因素。 v要準(zhǔn)確而全面的了解機(jī)體的表達(dá)水平，除了分析mRNA水平外，還需要免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。 v更多關(guān)于qRT-PCR的信息，請(qǐng)參照： v常用引物設(shè)計(jì)軟件：primer Premier，Oligov序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列v引物長(zhǎng)度：17-25bpv堿基盡可能隨機(jī)分布, GC%：40%-60%v盡量避免錯(cuò)配（False Priming)、引物二聚體(Dimer)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin） v引物長(zhǎng)度：17-25bpvGC%: 40-60%vTm:60（Primer Premier 5.0）v產(chǎn)物長(zhǎng)度：80-300bp,100-200bp最佳