生物芯片研究進展

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1、生物芯片研究進展 　　摘要　生物芯片是便攜式生物化學分析器的核心技術(shù)。通過對微加工獲得的微米結(jié)構(gòu)作生物化學處理能使成千上萬個與生命相關(guān)的信息集成在一塊厘米見方的芯片上。采用生物芯片可進行生命科學和醫(yī)學中所涉及的各種生物化學反應，從而達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。生物芯片發(fā)展的最終目標是將從樣品制備、化學反應到檢測的整個生化分析過程集成化以獲得所謂的微型全分析系統(tǒng)（micro total analytical system）或稱縮微芯片實驗室（laboratory on a chip）。生物芯片技術(shù)的出現(xiàn)將會給生命科學、醫(yī)學、化學、新藥開發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭、司

2、法鑒定、食品和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域帶來一場革命。本文闡述了生物芯片技術(shù)在加工制備、功能和應用方面的近期研究進展。 關(guān)鍵詞：生物芯片，縮微芯片實驗室，疾病診斷，基因表達 　　人類基因組計劃的目標是在2005年完成對30億個人體基因組DNA堿基的序列測定，現(xiàn)在通過使用更高級的毛細管陣列測序儀和商業(yè)操作，使該計劃有望提前完成。因此，人們現(xiàn)已開始利用人類基因組計劃中所發(fā)現(xiàn)的已知基因?qū)ζ涔δ苓M行研究，亦即把已知基因的序列與功能聯(lián)系在一起的功能基因組學研究。另外，與疾病相關(guān)的研究已從研究疾病的起因向探索發(fā)病機理方面轉(zhuǎn)移，并從疾病診斷向疾病易感性研究轉(zhuǎn)移。由于所有上述這些研究都與DNA結(jié)構(gòu)、病理和

3、生理等因素密切相關(guān)，因此許多國家現(xiàn)已開始考慮在后基因組時期，研究人員是否能用有效的硬體技術(shù)來對如此龐大的DNA信息以及蛋白質(zhì)信息加以利用。為此，先后已有多種解決方案問世，如DNA的質(zhì)譜分析法[1]、熒光單分子分析法[2]、陣列式毛細管電泳[3]、雜交分析[4]等。但到目前為止，在對DNA和蛋白質(zhì)進行分析的各種技術(shù)中，發(fā)展最快和應用前景最好看的技術(shù)當數(shù)以生物芯片技術(shù)為基礎的親和結(jié)合分析、毛細管電泳分析法[5]和質(zhì)譜分析法。此外，在此基礎上，通過與采用生物芯片技術(shù)和樣品制備方法（芯片細胞分離技術(shù)[6]和生化反應方法（如芯片免疫分析[7]和芯片核酸擴增[8]）相結(jié)合，許多研究機構(gòu)和工業(yè)界都已開始構(gòu)建

4、所謂的縮微芯片實驗室。建立縮微芯片實驗室的最終目的是將生命科學研究中的許多不連續(xù)的分析過程，如樣品制備，化學反應和分離檢測等，通過采用象集成電路制作過程中的半導體光刻加工那樣的縮微技術(shù)，將其移植到芯片中并使其連續(xù)化和微型化。這些當年將數(shù)間房屋大小的分離元件計算機縮微成現(xiàn)在只有書本大小的筆記本式計算機有異曲同工之效。用這些生物芯片所制作的具有不同用途的生化分析儀具有下述一些主要優(yōu)點，即分析全過程自動化、生產(chǎn)成本低、防污染（芯片系一次性使用）、分析速度可獲得成千上萬倍的提高、同時，所需樣品及化學藥品的量可獲得成百上千倍的減少、極高的多樣品處理能力、儀器體積小、重量輕、便于攜帶。這類儀器的出現(xiàn)將會給

5、生命科學、醫(yī)學、化學、新藥開發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭、司法鑒定、食品和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域帶來一場革命。因此，它已廣為各國學術(shù)界和工業(yè)界所矚目[9]。 　　1 生物芯片的微加工制備 　　生物芯片的加工借用的是微電子工業(yè)和其他加工工業(yè)中比較成熟的一些微細加工（microfabrication）工藝（如：光學掩模光刻技術(shù)、反應離子刻蝕、微注入模塑和聚合膜澆注法），在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物樣品分離、反應的微米尺寸的微結(jié)構(gòu)，如過濾器、反應室、微泵、微閥門等微結(jié)構(gòu)。然后在微結(jié)構(gòu)上施加必要的表面化學處理，再在微結(jié)構(gòu)上進行所需的生物化學反應和分析。 　　生物芯片中目前發(fā)展最快的要

6、算親和結(jié)合芯片（包括DNA和蛋白質(zhì)微陣列芯片）。它的加工除了用到一些微加工工藝以外，還需要使用機器人技術(shù)。現(xiàn)在有四種比較典型的親和結(jié)合芯片加工方法。一種是Affymetrix公司開發(fā)出的光學光刻法與光化學合成法相結(jié)合的光引導原位合成法[10]。第二種方法是Incyte pharmaceutical公司所采用的化學噴射法，它的原理是將事先合成好的寡核苷酸探針噴射到芯片上指定的位置來制作DNA芯片的。第三種是斯坦福大學所使用的接觸式點涂法。該方法的實現(xiàn)是通過使用高速精密機械手所帶的移液頭與玻璃芯片表面接觸而將探針定位點滴到芯片上的[11]。第四種方法是通過使用四支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴

7、頭在芯片上作原位DNA探針合成的[12]。 　　2 生物芯片舉例 　　生物芯片是縮小了的生物化學分析器，通過芯片上微加工獲得的微米結(jié)構(gòu)和生物化學處理結(jié)合，便可將成千上萬個與生命相關(guān)的信息集成在一塊厘米見方的芯片上。采用芯片可進行生命科學和醫(yī)學中所涉及的各種生物化學反應，以達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。通過分析可得到大量具有生物學、醫(yī)學意義的信息。生物化學反應和分析過程通常包括三個步驟：1，樣品制備；2，生物化學反應；3，檢測和數(shù)據(jù)分析處理。將其中一個步驟或幾個步驟微型化集成到一塊芯片上就能獲得具有特殊功能的生物芯片，例如用于樣品制備的細胞過濾器芯片和介電電泳芯片、

8、用于基因突變檢測和基因表達的DNA微陣列芯片和用于藥物篩選的高通量微米反應池芯片等?，F(xiàn)在，世界各國的科學家們正致力于將生化分析的全過程通過不同芯片的使用最后達到全部功能的集成，以實現(xiàn)所謂的微型全分析系統(tǒng)或縮微芯片實驗室。使用縮微芯片實驗室，人們可以在一個封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。 　　2.1 樣品制備芯片 　　針對DNA分析，其制備過程通常要經(jīng)過細胞分離、破胞、脫蛋白等多方面的工作，最后得到純度足夠高的待檢DNA。目前在細胞分離方法上較突出的有過濾分離（根據(jù)生物顆粒的尺寸差異進行分離）和介電電泳分離（利用在芯片上所施加的高頻非均勻電場使不同

9、的細胞內(nèi)誘導出偶電極，導致細胞受不同的介電力作用，而從樣品中分離出來）等；芯片中的破胞方法有芯片升溫破胞、變壓脈沖破胞，以及化學破胞等。在捕獲DNA方面，Cepheid公司應用濕法蝕刻和反應離子蝕刻/等離子蝕刻等工藝在硅片上加工出含有5000個高200微米直徑20微米的具有細柱式結(jié)構(gòu)的DNA萃取芯片，專門用于DNA的萃取[13]。 　　2.2 生物化學反應芯片 　　由于目前所用檢測儀器的靈敏度還不夠高，因此從樣品中提取的DNA在標記和應用前仍需用PCR這樣的擴增復制技術(shù)復制幾十萬乃至上百萬個相同的DNA片段。 　　目前，在芯片中進行核酸擴增反應獲得成功的有賓夕法尼亞大學研究小

10、組[8，14]，美國勞倫斯-利物摩國家實驗室[15]和Perkin-Elmer公司[16]。賓夕法尼亞大學研究小組所做的擴增反應都是在硅-玻璃芯片中進行的，芯片的外部加熱和冷卻采用的是計算機控制的帕爾帖電-熱器。在對芯片表面進行惰性處理后，亦即在硅片表面生長一層2000埃的氧化硅之后，他們成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸擴增反應，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由勞倫斯-利物摩國家實驗室加工的硅芯片所采用的加熱方式是芯片內(nèi)置的薄膜多晶硅加熱套，其升降溫的速度很快。Perkin-Elmer公司的PCR反應則是在塑料芯片上完成的。倫敦帝國理工大學的研究者研制了一種

11、樣品可在不同溫度的恒溫區(qū)間內(nèi)連續(xù)流動的PCR芯片[17]。上述所有工作都是用事先提純了的DNA或RNA作為擴增反應的底物來完成的。為了將樣品制備和擴增反應集成為一體，賓夕法尼亞大學研究小組最近成功地在壩式微過濾芯片中直接對分離所得的人白細胞通過升溫方式胞解后所釋放的DNA進行了擴增，這是世界上首例將樣品制備和擴增反應集成為一體的研究成果[14]。 　　2.3 檢測芯片 　　2.3.1 毛細管電泳芯片 　　芯片毛細管電泳是1983年由杜邦公司的Pace開發(fā)出來的[18]。隨后，瑞士的Ciba-Geigy公司和加拿大的Alberta大學合作利用玻璃芯片毛細管電泳完成了對寡核苷酸的

12、分離[19]。首次用芯片毛陣列電泳檢測DNA突變和對DNA進行測序的是由加利福尼亞大學伯格利分校Mathies領(lǐng)導的研究小組完成的[20,21]。通過在芯片上加上高壓直流電，他們在近兩分鐘的時間內(nèi)便完成了從118bp到1353bp的許多DNA片段的快速分離。此外，Mathies的小組與勞倫斯-利物摩國家實驗室Nothrup的研究小組合作，報道了首例將核酸擴增反應與芯片毛細管電泳集成為一體所作的多重PCR檢測工作[22]。賓夕法尼亞大學Wilding的小組與Ramsey的小組一道用芯片毛細管電泳對芯片中擴增得到的用于杜鑫-貝克肌萎縮診斷的多條DNA片段進行分離也獲得了成功[14]。其他用 芯片毛

13、細管電泳檢測突變的外國公司和學術(shù)機構(gòu)有Perkin-Elmer公司、Caliper technologies公司、Aclara biosciences公司和麻省理工等。 　　2.3.2 DNA突變檢測芯片 　　dNA之所以能進行雜交是因為核苷A和T、G和C可同時以氫鍵結(jié)合互補成對。許多經(jīng)典的分子生物學方法如桑格DNA測序法和PCR等都是以此為基礎的。最近出現(xiàn)的幾項技術(shù)，如用光刻掩膜技術(shù)作光引導原位DNA合成[23]、電子雜交技術(shù)[24]、高靈敏度激光掃描熒光檢測技術(shù)[25]等，使以雜交為基礎的應用有了長足的改善。最近的一些英文權(quán)威刊物對應用芯片雜交技術(shù)檢測突變作了報道。Hacia等

14、人采用由96000個寡核苷酸探針所組成的雜交芯片，完成了對遺傳性乳腺癌和卵巢腫瘤基因BRCA1中外顯子上的24個異合突變（單核苷突變多態(tài)性）的檢測。他們通過引入?yún)⒄招盘柡捅粰z測信號之間的色差分析使得雜交的特異性和檢測靈敏度獲得了提高[26]。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探針芯片對HIV病株的多態(tài)性作了分析[27]。Cronin等人用固化有428個探針的芯片對導致肺部囊性纖維化的突變基因進行了檢測[28]。用生物芯片作雜交突變檢測的美國公司有貝克曼儀器公司、Abbot laboratory、Affymetrix、Nanogen、Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hy

15、seq、Molecular dynamics等；英美學術(shù)機構(gòu)有賓夕法尼亞大學、貝勒醫(yī)學院、牛津大學、Whitehead institute for Biomedical Research，海軍研究室，Argonne國家實驗室等。 　　通過雜交分析DNA的另一應用技術(shù)是重復測序。那么，重復測序是怎么工作的呢？首先，人們將長度為8-20個核苷的探針合成并固定到指甲蓋大小的硅芯片或玻璃芯片上。當含有與探針序列互補的DNA被置于聯(lián)有探針的芯片之后，固化探針就會通過與其序列互補的DNA片段雜交而結(jié)合[10]。通過使用帶有計算機的熒光檢測系統(tǒng)對“棋盤”每個格子上的熒光強弱及根據(jù)每個格子上已知探針的序

16、列進行分析與組合就可得知樣品DNA所含有的堿基序列。最近美國的Science雜志對應用芯片雜交技術(shù)測序作了報道。Chee等人在一塊固化有135000個寡核苷酸探針（每個探針長度為25個核苷）的硅芯片上對長度為16.6kbp的整個人線粒體DNA作了序列重復測定。每個探針之間的空間間隔為35微米。測序精度為99%。另外Hacia還報道了一種微測序分析法（minisequencing-based assays）為檢測所有可能的堿基序列變化提供了強有力的手段。此方法中需要將不同顏色熒光染料標記的四種ddNTP，加入到引物的酶促反應中，微陣列上固化的寡核苷酸用作酶促反應的引物，靶序列作為模板，可檢測到靶

17、序列上的堿基變化。用生物芯片從事雜交測序的美國公司有Affymetrix和Hyseq[29]。 　　2.3.3 用作基因表達分析的DNA芯片 　　隨著人類基因組計劃的順序進行，越來越多的能夠表達的人基因序列以及引發(fā)疾病和能預測疾病的各種突變正在為人們逐漸認識。為了能夠同時對多個可能的遺傳突變進行搜尋、加快功能基因組學研究的進程，人們現(xiàn)已把越來越多的注意力放到了能同時提供有關(guān)多個基因及其序列信息的所謂并行分子遺傳學分析（parallel molecular genetic analysis）方法上。功能基因組學所研究的是在特定組織中、發(fā)育的不同階段或者是疾病的不同時期基因的表達情況。

18、因此它的要求是要能在同一時刻獲得多個分子遺傳學分析的結(jié)果。譬如，許多疾病引發(fā)基因可能會有數(shù)以百計的與表征有關(guān)的特定突變，因而，要求能有同時篩檢這些突變的有效方法。另外，任何一個細胞中都會有上千個基因在表達。而細胞間基因表達的差異往往能反應出這些細胞是發(fā)育正常還是在朝惡性腫瘤細胞方向發(fā)展。采用芯片技術(shù)利用雜交對基因表達進行分析的好處是它能用很少的細胞物質(zhì)便能提供有關(guān)多基因差異表達的信息，從而給疾病診斷和藥物篩選提供前所未有的信息量[30]。Lockhart等人采用固化有65000個不同序列的長度為20個核苷的探針芯片，定量地分析了一個小鼠T細胞線中整個RNA群體內(nèi)21個各不相同的信使RNA。這些

19、專門設計的探針能與114個已知的小鼠基因雜交。分析發(fā)現(xiàn) 在誘發(fā)生成細胞分裂后，另外有20個信使RNA的表達也發(fā)生了改變。檢測結(jié)果表明該系統(tǒng)對RNA的檢出率為1:300000，對信使RNA的定量基準為1:300[32]。Wang等人在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（etoposide）誘導的細胞程序性死亡時，利用DNA芯片技術(shù)，制備了一次可檢測6591種人細胞信使RNA的寡聚核苷酸微陣列，檢測到誘導后的細胞內(nèi)有62種信使RNA的量發(fā)生了變化。通過挑選12個與誘導作用有關(guān)的基因作進一步研究，它們發(fā)現(xiàn)了2個新的p53靶基因[33]。DeRisi等人將一個惡性腫瘤細胞線中得到的870個不同的cDNA探針通過

20、機械手“刷印”至載玻片上以觀察癌基因的表達情況。在比較兩個標有不同熒光標記的細胞信使RNA群的雜交結(jié)果之后，他們對引入正常人染色體后腫瘤基因受到抑制的細胞中的基因表達結(jié)果進行了分析[34]。另外，Shoemaker等人報道了一種利用生物芯片來確定許多新近發(fā)現(xiàn)的酶母基因的生物功能的所謂分子條形編碼技術(shù)。這種技術(shù)的好處是它能讓我們以并行的方式定量地分析很復雜的核酸混合物[35]。Lueking等人最近采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，把作為探針的蛋白質(zhì)高密度地固定在聚雙氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride）上，并檢測到了10pg的微量蛋白質(zhì)測試樣。對92個人cDNA克隆片段表達的產(chǎn)物進行檢測，用單克隆技術(shù)作平行分析，證實了假陽性的的檢出率低。由于蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)不受限于抗原-抗體系統(tǒng)，故能為高效篩選基因表達產(chǎn)物及研究受體-配體的相互作用提供一條新的有效途徑[36]。