【考研必備】王鏡巖生物化學(xué)筆記 第六章 核酸

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1、 第六章 核 酸 核酸是遺傳物質(zhì) 1868年瑞士Miesher.從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出可溶于堿而不溶于稀酸的酸性物質(zhì)。 間接證據(jù)：同一種生物的不同種類的不同生長(zhǎng)期的細(xì)胞，DNA含量基本恒定。 直接證據(jù)：T2噬菌體DNA感染E.coli 用35S標(biāo)記噬菌體蛋白質(zhì)，感染E.coli，又用32P標(biāo)記噬菌體核酸，感染E.coli DNA、RNA的分布（DNA在核內(nèi)，RNA在核外）。 第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成 核酸是一種線形多聚核苷酸，基本組成單位是核苷酸。 結(jié)構(gòu)層次： 核 酸 核苷酸

2、 磷酸 核苷 戊糖 堿基 組成核酸的戊糖有兩種：：D-核糖和D-2-脫氧核糖，據(jù)此，可以將核酸分為兩種：核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA） P330 表5-1 兩類核酸的基本化學(xué)組成 一、 堿基 1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 鳥嘌呤 2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶 P331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基 植物

3、中有大量5-甲基胞嘧啶。 E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C。 稀有堿基：100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物。 DNA由A、G、C、T堿基構(gòu)成。 RNA由A、G、C、U堿基構(gòu)成。 二、 核苷 核苷由戊糖和堿基縮合而成，糖環(huán)上C1與嘧啶堿的N1或與嘌呤堿的N9連接。 核酸中的核苷均為β-型核苷 P332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷 DNA 的戊糖是：脫氧核糖 RNA 的戊糖是：核糖 三、 核苷酸 核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯化，生成核苷酸。 1、 構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸 P333表5-3 2、 細(xì)胞內(nèi)游離核苷

4、酸及其衍生物 ①核苷5’-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。 ②環(huán)核苷酸 cAMP（3’，5’-cAMP） cGMP（3’，5’-cGMP） 它們作為質(zhì)膜的激素的第二信使起作用，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝。 ③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物 ppGpp pppGpp ppApp ④核苷酸衍生物 HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。 GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。 第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu) 一級(jí)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。 二

5、級(jí)：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過(guò)氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三級(jí)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。 一、 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通過(guò)3/、5/-磷酸二酯鍵連接起來(lái)的線形多聚體。3/、5/-磷酸二酯鍵是DNA、RNA的主鏈結(jié)構(gòu) 。 P334 圖 5-1 書寫方法：5/ → 3/： 5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游離的） 在DNA分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表DNA生物學(xué)意義的是堿基的排列順序。 遺傳信息貯存在D

6、NA的堿基排列順序中，生物界生物的多樣性即寓于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化的精確的排列順序中。 二、 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff 規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射數(shù)據(jù)提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。 1、 Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)建立的根據(jù) ①Chargaff 規(guī)律 1950年 a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。 P334表5—4。 b. DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物的DNA皆有自己獨(dú)特的堿基組成。 c. DNA堿基組成沒(méi)有組織和器官的特異性。 d. 年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不

7、影響DNA的堿基組成。 ② DNA的Na鹽纖維和 DNA晶體的X光衍射分析。 相對(duì)濕度92%，DNA鈉鹽結(jié)晶，B—DNA。 相對(duì)濕度75%，DNA鈉鹽結(jié)晶，A—DNA。 Z—DNA。 生物體內(nèi)DNA均為B—DNA。 Franklin 的工作 2、 Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 P335 圖5—2 a.兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’ b.嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過(guò)3/、5/-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成

8、DNA分子的骨架。 寬1.2 nm 寬0.6nm 大溝 小溝 深0.85nm 深0.75nm c.螺旋平均直徑2nm 每圈螺旋含10個(gè)核苷酸 堿基堆積距離：0.34nm 螺距：3.4nm d.兩條核苷酸鏈，依靠彼此堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。堿基平面垂直于螺旋軸。A=T、G=C P336 圖5—4 堿基互補(bǔ)原則具有極重要的生物學(xué)意義，DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)都是

9、堿基互補(bǔ)。 3、 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素 ①堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。 ②堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 ③磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。 ④堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。 三、 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性和多型性 （一） DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性 1、 反向重復(fù)序列（回文序列） DNA序列中，以某一中心區(qū)域?yàn)閷?duì)稱軸，其兩側(cè)的堿基對(duì)順序正讀和反讀都相同，即對(duì)稱軸一側(cè)的片段旋轉(zhuǎn)180°后，與另一側(cè)片段對(duì)稱重復(fù)。 較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，在某些因素作用下，

10、可形成莖環(huán)式的十字結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。功能還不完全清楚，但轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。 較短的回文序列，可作為一種特別信號(hào)，如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。 2、 富含A T的序列 高等生物中，A+T與C+G的含量差不多相等，但在它們的染色體的某一區(qū)域，A T含量可能很高。 在很多有重要調(diào)節(jié)功能（不是蛋白質(zhì)編碼區(qū)）的DNA區(qū)段都富含A T堿基對(duì)。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)的Pribnow框的DNA區(qū)中，富含A T對(duì)。這對(duì)于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始十分重要，因?yàn)镚 C對(duì)有三個(gè)氫鍵，而A T對(duì)只有兩個(gè)氫鍵，此處雙鍵易解開。 （二） DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性 P339 表5-6 A-、B-、Z-DNA的

11、比較 1、 B—DNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA 右手雙股螺旋 每圈螺旋10.4個(gè)堿基對(duì) 每對(duì) 螺旋扭角36° 螺距：3.32nm 堿基傾角：1° 2、 A-DNA 在相對(duì)濕度75%以下所獲得的DNA纖維。 A-DNA也是右手雙螺旋，外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。 3、 Z-DNA 左手螺旋的DNA。 天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z0-DNA。 4、 DNA三股螺旋 在多聚嘧啶和多聚嘌呤組成的DNA螺旋區(qū)段，序列中有較長(zhǎng)的鏡像重復(fù)時(shí)，可形成局部三股螺旋，稱H-DNA。 鏡像重復(fù)： TAT配對(duì) C+

12、GC酸對(duì) DNA的三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始或調(diào)節(jié)位點(diǎn)，第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。 四、 環(huán)狀DNA 生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA的形式存在，包括： 某些病毒DNA 某些噬菌體DNA 某些細(xì)菌染色體DNA 細(xì)菌質(zhì)粒DNA 真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA 1、 環(huán)形DNA的不同構(gòu)象 P340 圖5-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋 （1）、 松弛環(huán)形DNA 線形DNA直接環(huán)化 （2）、 解鏈環(huán)形DNA 線形DNA擰松后再環(huán)化 （3）、 正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA 線形

13、DNA擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。 繩子的兩股以右旋方向纏繞，如果在一端使繩子向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。 如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。 對(duì)于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)小于10.4，則其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)，是正超螺旋。 如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)大于10.4，則其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，是負(fù)超螺旋。 2、 環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性 以260bp組成的線形B-DNA為例

14、，螺旋周數(shù)260/10.4=25。 P340 圖25-8 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋 ①連環(huán)數(shù)（L） DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。 松馳環(huán)：L=25 解鏈環(huán)：L=23 超螺旋：L=23 ②纏繞數(shù)（T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示 松馳環(huán)T=25 解鏈環(huán)T=23 超螺旋T=25 ③超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù)W） 松馳環(huán)W=0 解鏈環(huán)W=0 超螺旋W= -2 L=T+W ④比連環(huán)差（λ） 表示DNA的超螺旋程度 λ=（L—L0）/L0 L0是指松馳環(huán)形DNA的L值 天然DNA的超螺旋密度一

15、般為-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9個(gè)負(fù)超螺旋。 負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起，很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等需要將兩條鏈分開才能進(jìn)行的反應(yīng)。 3、 拓?fù)洚悩?gòu)酶 此酶能改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。 ①拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（擰緊） 能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時(shí)，使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。 ②拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（擰松） 能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時(shí)能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA。 五、 染色體的結(jié)構(gòu) 1、 大腸桿菌染色體 大腸桿菌染色體是由4.2×106

16、bp組成的雙鏈環(huán)狀DNA分子，約3000個(gè)基因。 大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白： 每個(gè)細(xì)胞 H 兩個(gè)28KD的相同亞基 30000個(gè)二聚體 HU 兩個(gè)各9KD的不同亞基 40000個(gè)二體聚體 HLP1 17KD的亞基 20000個(gè)單體 P 3KD的亞基 未知 這些DNA結(jié)合蛋白，使4.2×

17、106bp的E.coli染色體DNA壓縮成為一個(gè)手腳架形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中心是多種DNA結(jié)合蛋白，DNA雙螺旋分子有許多位點(diǎn)與這些蛋白結(jié)合，形成約100個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的DNA都是負(fù)超螺旋，一個(gè)小區(qū)的DNA有兩個(gè)端點(diǎn)被蛋白質(zhì)固定，每個(gè)小區(qū)相對(duì)獨(dú)立。 圖 用極微量的DNA酶I處理時(shí)，只能使少量小區(qū)的DNA成為松馳狀態(tài)，而其它小區(qū)仍然保持超螺旋狀態(tài)。 2、 真核生物染色體 主要由組蛋白和DNA組成。 組蛋白是富含堿性a.a(Lys、Arg)的堿性蛋白質(zhì)，根據(jù)Lys/Arg比值不同，可分為H1、H2A、H2B、H3、H4五種，均為單鏈蛋白質(zhì)，分子量11000-21000。

18、 H2A、H2B、H3、H4各兩分子對(duì)稱聚集成組蛋白八聚體。 146bp長(zhǎng)度的DNA雙螺旋盤繞在八聚體上形成核小體。 核小體間DNA長(zhǎng)度15-100bp（一般60bp）其上結(jié)合有H1 圖 2H2A、2H2B、2H3、2H4組蛋白八聚體 146bpDNA 核小體 串聯(lián) 染色質(zhì) 折疊 染色體 DNA（直徑2nm） 盤繞組蛋白八聚體上，結(jié)合H1，壓縮比1/7 核小體（一級(jí)結(jié)構(gòu)） 螺旋化，壓縮比1/6 螺線管（二級(jí)結(jié)構(gòu)）

19、 再螺旋化，壓縮比1/40 超螺線管（三級(jí)結(jié)構(gòu)） 折疊，壓縮比1/5 染色單體（四級(jí)結(jié)構(gòu)） 總壓縮比：1/8400~1/10000 六、 DNA的生物學(xué)功能 首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 P342 1~4 Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 第三節(jié) RNA的結(jié)構(gòu) 一、 RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通過(guò)3/、5/磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。 P343 圖5-10 RNA基本結(jié)構(gòu)

20、 ① 組成RNA的戊糖是核糖 ② 堿基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中還有一些稀有堿基。 ③ 天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋區(qū)一般占RNA分子的50%左右。 二、 RNA的類型 細(xì)胞中的RNA，按其在蛋白質(zhì)合成中所起的作用，主要可分為三種類型。 核糖體RNA rRNA 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA tRNA 信使 RNA mRNA 此外，真核生物細(xì)胞中有少量核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA snRNA） P344 表5-7 大腸桿菌中的RNA 沉降系數(shù)：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)中的沉降速

21、度，以S為單位，即10-13秒。 如23S rRNA ，單位離心場(chǎng)中沉降 23×10-13秒 5S rRNA ，單位離心場(chǎng)中沉降 5×10-13秒 三、 tRNA的結(jié)構(gòu) tRNA約占全部RNA的15% 主要功能：在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。 已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的tRNA有160種，每種tRNA可運(yùn)載一種特定的a.a，一種a.a可由一種或多種tRNA運(yùn)載。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系數(shù)4S左右 ②堿基組成中有較多稀有堿基 圖 ③3’末端為…CpCpA-OH，用來(lái)接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端。 ④5’末端大多為pG

22、…或pC… ⑤二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草形 P345 圖5-12 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三葉草模型） 1966年Crick對(duì)于tRNA能識(shí)別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對(duì)的“擺動(dòng)學(xué)說(shuō)”： 認(rèn)為除A-U、G-C配對(duì)外，還有非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，I-A、I-C、I-U，并強(qiáng)調(diào)密碼子的5’端第1、2個(gè)堿基嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，而第3個(gè)堿基可以非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，具有一定程度的擺動(dòng)靈活性。 四、 mRNA的結(jié)構(gòu) mRNA是從DNA上轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，其功能是依據(jù)DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的mRNA編碼，細(xì)胞內(nèi)?mRNA種類很多，大小不一，每種含量極低。 從功能上講，一個(gè)基因

23、就是一個(gè)順?lè)醋?，原核生物的mRNA是多順?lè)醋?，真核mRNA是單順?lè)醋印? 順?lè)醋樱菏怯身樂(lè)丛囼?yàn)所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。 1、 真核mRNA （1）、 3’-端有一段約30-300核苷酸的polyA。 PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶對(duì)mRNA專一。 原核mRNA一般無(wú)polyA。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長(zhǎng)；而衰老的mRNA，其polyA較短。 polyA功能： PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。 PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 （2）、 5’-帽子帽子 5’末端

24、的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個(gè)核苷酸相連，形成5’-5’-磷酸二酯鍵。 P346 帽子結(jié)構(gòu) 帽子的功能： 可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。 可為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。 2、 原核mRNA（多順?lè)醋樱? 原核mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒(méi)有5/帽子和3/polyA。 舉列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三個(gè)順?lè)醋?，分別編碼A蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。 圖MS2病mRNA 5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-

25、AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。 SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)，這種互補(bǔ)序列與mRNA對(duì)核糖體的識(shí)別有關(guān)。 原核mRNA代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。 五、 rRNA的結(jié)構(gòu) rRNA占總RNA的80%左右。 功能：rRNA是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場(chǎng)所。 大腸桿菌中有三類rRNA（原核） 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 真核細(xì)胞有四類rRNA 5S rRNA 5.8S rRNA 18S

26、rRNA 28S rRNA 圖 原核核糖體（rRNA?部分） 圖 真核核糖體（rRNA部分） P346 圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 一、 解離性質(zhì) 多聚核苷酸有兩類可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。 磷酸是中等強(qiáng)度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點(diǎn)在較低的pH范圍內(nèi)。 DNA等電點(diǎn) 4—4.5 RNA 等電點(diǎn) 2—2.5 RNA鏈中，核糖C’2-OH的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的解離。 二、 水解性質(zhì) 1、 堿水解 室

27、溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。 圖 在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C’2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。 DNA、RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。 DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。 RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后降解。 2、 酶水解 生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶 RNA水解酶 RNase DNA水解酶 DNase 核酸外一切酶 核酸內(nèi)切酶 最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶 三、 光吸收性 堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強(qiáng)

28、烈的光吸收，　　　　λmax=260nm 1、 鑒定純度 純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。 純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。 若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。 2、 含量計(jì)算 1 ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA 或：40ug/mL單螺旋DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸 3、 增色效應(yīng)與減色效應(yīng) P347 圖5-15 DNA的紫外吸收光譜 增色效應(yīng)：在DNA的變性過(guò)程中，摩爾

29、吸光系數(shù)增大 減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減小。 四、 沉降特性（DNA） 不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來(lái)，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。 P348 圖5—16 Cs-Cl密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA 相對(duì)沉降常數(shù) 線型雙螺旋分子 1.00 松馳雙鏈閉環(huán) 1.14 切刻雙鏈環(huán) 1.14 單鏈環(huán) 1.14 線型單鏈

30、 1.30 正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41 坍縮 3.0 五、 變性、復(fù)性及雜交 變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。 1、 變性 （1）、 變性： 核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價(jià)鍵的斷裂稱核酸的降解。 DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。 P350 圖5-18變性過(guò)程 熱變性 因素 酸堿變性（pH

31、小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 260nm吸收值升高。 變性后 粘度降低，浮力密度升高。 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 （2）、 熔解溫度（Tm）或稱熔點(diǎn)： DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。DNA的Tm一般在70—85℃之間。 濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNA A260=1.00，完全變性（單鏈）A260= 1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為Tm。 （3）、 影響DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性

32、 均一性高，熔解過(guò)程發(fā)生在很小的溫度范圍 內(nèi)。 ②G-C含量與Tm值成正比，G-C含量高，則Tm越高，測(cè)定Tm，可推知G-C含量。。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44 P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關(guān)系 ③介質(zhì)中離子強(qiáng)度 其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。 P351 圖5-21 2、 復(fù)性 變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm20—25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 變性DNA在緩慢冷卻時(shí)（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。 復(fù)性速度可用Co·t衡量。 Co為變性

33、DNA原始濃度mol·L-1，t為時(shí)間，以秒表示。 P352 圖5-22，不同DNA的復(fù)性時(shí)間。 A．1個(gè)核苷酸對(duì)（A.U） 圖上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L 若濃度為Co=1.0m mol/L 則復(fù)性50%所需時(shí)間t=0.004秒 若要全部復(fù)性，Cot=10-4 t=0.1秒 B．E.coli 4.2×106堿基對(duì) 圖上查出Cot1/2=10 mol.s/L 若濃度Co=1.0 umol/L則復(fù)性50%所需時(shí)間t=107秒，約115天。復(fù)性100%Cot=500 mol.s/L t=5×108秒，5758天。 對(duì)于E.coli ，4.2×

34、106bp，濃度達(dá)到umol/L級(jí)時(shí)，濃度已很高。 復(fù)性機(jī)制：10-20bp成、拉鏈 3、 雜交（DNA—DNA、 DNA—RNA） 將不同來(lái)源的DNA混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源DNA之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)會(huì)形成雜交分子。 第五節(jié) 核酸研究技術(shù) 一、 核酸的分離純化 要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。 條件溫和，防止過(guò)酸、過(guò)堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。 1、 DNA分離純化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質(zhì)，可將DNP與R

35、NA核蛋白分開，提取出DNP。 DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 2、 RNA的制備（重點(diǎn)介紹mRNA的分離、純化） 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等 必須防止RNA酶對(duì)RNA的破壞。 二、 核酸的凝膠電泳 1、 瓊脂糖電泳 ① 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比 ② 凝膠濃度 ③ DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 ④ 電流，不大于5V/cm 2、 PAGE電泳 三、 限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)） 1、 限制修飾系統(tǒng)

36、 圖 2、 II型核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶有I、II、III三種類型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。 II型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反向重復(fù)）。 II型酶的切割頻率 識(shí)別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 Not I GCGGCCGC 限制酶的命名：E.coRI 第一位： 屬名E（大寫） 第二、三位： 種名的頭兩個(gè)字母小寫co 第四位：

37、 菌株R 第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類酶的編號(hào)。 同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 BamH： GGATCC 同裂酶 BstI 識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。 BamHI：GGATCC 同裂酶：BstI GGATCC 同尾酶：BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC 星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH

38、，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。 例如 HindIII AAGCTT 四、 DNA物理圖譜及構(gòu)建 （限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜） 在研究某一種DNA時(shí)，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜： （1）單酶完全降解和部分降解 （2）雙酶降解 圖 五、 分子雜交 1、 Southern Blotting P353 圖5-23 DNA樣品 酶切 電泳

39、 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影 變性（NaOH 0.5mol/L） 轉(zhuǎn)膜（NC膜） 固定（80℃，4-6h） 雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時(shí)） Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。 可用DNA或RNA探針。 2、 Northern Blotting 研究對(duì)象是mRNA 檢測(cè)可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的產(chǎn)生，即特定基因的表達(dá)。 mRNA易形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，

40、因此，總RNA或mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 3、 Western Blotting 是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。 六、 DNA序列分析 （一） 化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert 法） DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸DNA片段的PAGE上分離。 一定濃度的特測(cè)片段 32P-GCTACGTA 特異性化學(xué)裂解 在A處：32P-GCT和32P-GCTA

41、CGT 在G處：32p-GCTA 在C處：32P-G和 32P-GCTA 在T處：32P-GC和32P-GCTACG 圖 硫酸二甲酯特異切割：G 甲酸特異切割：G和A 肼在Nacl條件下切割：C 肼在無(wú)?Nacl條件下切割：T和C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼（有Nacl）： *A *ACTT

42、 *ACTTCGA 肼（無(wú)Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 從下往上讀：CTACGTA 末端G不能讀出。 （二） 雙脫氧終止法 英國(guó) Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu) 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1980 設(shè)計(jì)出DNA測(cè)序法 1980 再獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 合成一段與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。 圖 胰島素的基因工程：A鏈21a.a 63個(gè)核苷酸

43、 B鏈30a.a 90個(gè)核苷酸 （三） 序列分析儀 四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP 七、 DNA合成（合成探針、引物、基因） 1、 化學(xué)合成——DNA合成儀 DNA固相合成（亞磷酸三酯法） 合成方向：3’ 5’端 5’-OH用二對(duì)甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)， 堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 3’-OH用氨基磷酸化合物活化 P353 合成過(guò)程 保護(hù)： 5’-OH、活化3’-OH、保護(hù)所有NH2 2、 DNA的酶合成——PCR 用DNA聚合酶I 必備條件： ①模板DNA（單鏈） ②引物 ③DNA聚合酶 ④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP ⑤一定濃度的Mg2+ 鏈合成方向：5 ’ 3’端 新的DNA鏈合成，從引物DNA的3’-OH開始。 圖 鏈的增長(zhǎng)反應(yīng)是引物DNA的3’-OH，對(duì)脫氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果。 化學(xué)合成：方向3’ 5’，不需DNA模板，不用酶。 生物合成：方向5’ 3’，需模板，引物，用酶。 計(jì)劃：6