細(xì)胞重組與細(xì)胞融合.ppt

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第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合,一、細(xì)胞重組二、細(xì)胞融合,一、細(xì)胞重組（一）概述1概念通過一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組，使其裝配成具有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器，又稱細(xì)胞拆合。2特點(diǎn)細(xì)胞重組最初只在細(xì)胞核、質(zhì)之間的移植，現(xiàn)在發(fā)展到可以人為的對(duì)細(xì)胞任何的不同組分進(jìn)行組合，大大擴(kuò)展了在細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用。,3意義1）研究核質(zhì)關(guān)系2）研究細(xì)胞器的功能及相互作用關(guān)系3）研究細(xì)胞器的組裝，甚至細(xì)胞的自我裝配機(jī)理，以揭示細(xì)胞起源與進(jìn)化的機(jī)制。4）結(jié)合基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，可人為地使細(xì)胞表達(dá)新的性狀和產(chǎn)生新的產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)掌握細(xì)胞、利用細(xì)胞、改造并進(jìn)而創(chuàng)造出具有特定性狀和功能的工程細(xì)胞。,（二）細(xì)胞重組技術(shù)★細(xì)胞重組的方式及有關(guān)概念1）胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合形成胞質(zhì)雜種；2）微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合形成微細(xì)胞異核體；3）胞質(zhì)體與核體（小細(xì)胞）融合形成重組細(xì)胞（核質(zhì)雜種）胞質(zhì)體（cytoplast,cytosome)：除去細(xì)胞核后由細(xì)胞膜包裹的結(jié)構(gòu)。小細(xì)胞（minicell）：又稱核體，具有細(xì)胞核、帶有薄層細(xì)胞質(zhì)。微細(xì)胞（microcell）：含有一個(gè)微核（僅有一條或幾條染色體）并帶有薄層細(xì)胞質(zhì)。,1顯微操作技術(shù)在顯微鏡下或借助于顯微操作儀，用細(xì)微玻璃針或微吸管、微電極等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人為操作。2細(xì)胞分離技術(shù)1）梯度沉降分離法2）等密度沉降分離法3）流式細(xì)胞儀分離法3細(xì)胞破碎方法1）超聲波破碎法2）反復(fù)凍溶法3）化學(xué)裂解法4）高速組織倒碎法,4細(xì)胞器的分離5胞質(zhì)體、核體和微細(xì)胞的制備最常使用方法是：物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)制備1）胞質(zhì)體首先用細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞誘發(fā)其排核，然后震蕩離心分離得到胞質(zhì)體。2）核體在得到胞質(zhì)體的同時(shí)，離心收集排除的有完整細(xì)胞核，帶有少量細(xì)胞質(zhì)并圍有完整細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)便是核體。3）微細(xì)胞首先用秋水仙素處理，染色體停滯在有絲分裂中期，體外培養(yǎng)過程中，在單個(gè)染色體或染色體周緣會(huì)重現(xiàn)核膜而形成含有一個(gè)微核、一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的微細(xì)胞。,,,,,,,,,6細(xì)胞器拆合重組舉例,細(xì)胞器的移植主要是指葉綠體和線粒體的移植。如卡爾森用白化型原生質(zhì)體攝取正常的葉綠體，進(jìn)而發(fā)育成正常的綠色植物；或有人用抗藥型草履蟲的線粒體植入敏感的草履蟲細(xì)胞，使后者獲得抗藥性等。,二、細(xì)胞融合(cellfusion),（一）、細(xì)胞融合的概念,用人工方法把同種或不同種的兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞，通過介導(dǎo)物作用，融合成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。亦稱體細(xì)胞雜交（somatichybridization）,（二）、細(xì)胞融合的意義（應(yīng)用）,1進(jìn)行基因定位，繪制人類基因圖,基因定位的方法,家系分析法,細(xì)胞融合法,基因劑量效應(yīng)法,重組DNA法,分子雜交法,限制性片段長度多態(tài)性技術(shù),脈沖電泳法（PEGE）,基因圖：指將人類染色體上所有基因按其具體位置、次序和間隔距離詳細(xì)地排列而成的圖，又叫染色體連鎖圖,2誘導(dǎo)PC染色體,3體細(xì)胞雜種的致瘤性分析,4遺傳缺陷的基因互補(bǔ),5分化功能表達(dá)調(diào)控的研究,6淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體,☆由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群分泌的高度純一的抗體稱為單克隆抗體,7植物細(xì)胞的原生質(zhì)體融合培育雜種植株8核質(zhì)相互作用關(guān)系9基因治療10疾病診斷,（三）、細(xì)胞融合的機(jī)理,膜融合是兩個(gè)不同的膜相互接觸和融合，導(dǎo)致兩膜脂和膜蛋白的相互混合及兩側(cè)內(nèi)含物的混合。細(xì)胞融合的基本步驟包括：1細(xì)胞密切靠近2細(xì)胞橋形成3細(xì)胞質(zhì)滲透4細(xì)胞核融合,,★融合機(jī)制種種,1）“脂無序”模型Lucy，1970-1975,,2）Ca2+誘導(dǎo)的側(cè)向“相分離”模型Papahadjopoulos1978,,3）六角形HII構(gòu)象與膜融合CullisandHope1978,,4）Ca2+誘導(dǎo)局部脫水與膜融合WilschutandHoekstra1984,,5）滲透模型與膜融合Lucy1986,,6）質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)膜融合劉樹森1986,,膜融合過程大體概括為兩大階段：首先是兩膜脂相互聚合和接觸，其次是接觸部位的局部脫水，形成不穩(wěn)定中間結(jié)構(gòu)，使膜脂發(fā)生混合而最終導(dǎo)致膜的融合,（四）、細(xì)胞融合的材料1植物或微生物原生質(zhì)體的制備2動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得酶解消化法（胰蛋白酶、膠原酶）,（五）、細(xì)胞融合的方法,1、生物法——病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合仙臺(tái)病毒（Sendalvirus）又稱日本血凝性病毒（HVJ），是一種RNA病毒，1962年岡田善雄發(fā)現(xiàn)，能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。引起細(xì)胞融合的有效部位在于它的細(xì)胞膜成分，特別是磷脂成分，而與核酸活性無關(guān)。,2、化學(xué)法——PEG結(jié)合高Ca2+、pH誘導(dǎo)法,1）高級(jí)脂肪酸衍生物2）脂質(zhì)體3）鈣離子4）水溶性高分子化合物—聚乙二醇（PEG）最為常用5）水溶性蛋白質(zhì)和多肽（如牛血清蛋白）20世紀(jì)70年代，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)PEG能促進(jìn)植物原生質(zhì)體融合，開辟了植物細(xì)胞融合的研究。目前化學(xué)法主要包括：NaNO3誘導(dǎo)、高Ca2+、和pH誘導(dǎo)、PEG誘導(dǎo)、PEG結(jié)合高Ca2+和pH誘導(dǎo)等，后者最為常用。,A、基本原理PEG(polyethyleneglycol)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH，平均分子量在200—20000之間。誘導(dǎo)機(jī)制可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間在鈣離子的作用下形成靜電鍵，促使原生質(zhì)體間的黏著而結(jié)合，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,B、基本過程及注意事項(xiàng)（1）親本原生質(zhì)體事先做好識(shí)別標(biāo)記（色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等）（2）原生質(zhì)體密度在105/ml左右，比例1：1（3）PEG分子量通常為4000—6000，濃度50%（4）加入PEG后迅速混勻，置24℃培育10—20min，然后緩緩加入高pH、高鈣離子溶液，15min后用洗滌液洗滌，離心收集。,3、物理法——電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合,電融合是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的。優(yōu)點(diǎn)是融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、傷害小、方法簡便易行、可在顯微鏡下觀察融合的全過程。原生質(zhì)體在短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)電場(chǎng)（高壓脈沖電場(chǎng)，場(chǎng)強(qiáng)為kV/cm量級(jí)）作用下，極化產(chǎn)生偶極子，緊密排開成串珠狀，在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度（如50mA、1.2kV/cm)的直流電脈沖作用下，細(xì)胞膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體。,4、物理法——激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合,更具高度選擇性、有效性,（六）、融合細(xì)胞的選擇1融合體的類型在整個(gè)融合液中，除了未融合的單親細(xì)胞外，主要包括三種類型的融合細(xì)胞。1）同核體——同源原生質(zhì)體的融合2）異核體——非同源原生質(zhì)體的融合3）多核體——含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體,融合體的篩選方法1）遺傳互補(bǔ)篩選法2）抗性互補(bǔ)篩選法3）生長特性篩選法4）物理特性篩選法5）其他方法,（七）、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用舉例,制備細(xì)胞懸液雙親細(xì)胞的選擇,誘導(dǎo)細(xì)胞融合,雜種細(xì)胞篩選,1）由抗藥性細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞篩選,2）由營養(yǎng)缺陷變異型細(xì)胞組成的雜種的篩選,3）由溫度敏感突變型細(xì)胞組成的雜種的篩選,雜種細(xì)胞的培養(yǎng),1、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的基本步驟,動(dòng)物細(xì)胞融合舉例——單克隆抗體的制備,1單克隆抗體的制作原理2單克隆抗體的制作過程1）動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備2）骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)3）細(xì)胞融合4）抗體的檢測(cè)及雜交瘤的選擇5）單抗的大量生產(chǎn),細(xì)胞合成DNA有兩條途徑,主要途徑（生物合成）：糖、氨基酸→核苷酸→DNA,此途徑可因加氨基碟呤（A，一種葉酸的抵抗劑）被阻斷。DNA合成過程中所需的脫氧胸苷酸（dTMP）是由脫氧尿苷酸（dUMP）經(jīng)甲基化形成。甲基供體是四氫葉酸，四氫葉酸是由二氫葉酸還原酶還原二氫葉酸而來。氨基碟呤在分子結(jié)構(gòu)上是二氫葉酸的類似物，可與二氫葉酸競爭二氫葉酸還原酶發(fā)生不可逆結(jié)合，從而阻斷四氫葉酸的形成，不能提供甲基形成dUMP，最后阻斷DNA的合成。,3雜交瘤篩選原理,當(dāng)上面主要途徑被阻斷時(shí)可由此途徑代替補(bǔ)充，即可在次黃嘌呤核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT+）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK+）作用下，利用H（次黃嘌呤）合成嘌呤核苷酸，利用T（胸腺嘧啶）來合成胸腺嘧啶核苷酸，進(jìn)而合成DNA。,救急（應(yīng)急）途徑,HAT篩選法,一個(gè)親本細(xì)胞株為次黃嘌呤—鳥嘌呤—磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT－）,另一個(gè)親本細(xì)胞株為胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK－）,在含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的HAT選擇培養(yǎng)液中，上述親本細(xì)胞都無法生存，只有融合以后的雜種細(xì)胞才能生長，因此可有效地選擇出雜種細(xì)胞。,雜交瘤篩選過程,親本1（突變型細(xì)胞株）,親本2,骨髓瘤細(xì)胞（或胸腺瘤細(xì)胞）,（HGPRT－和TK－）,（HGPRT+和TK+）,加A后正常和應(yīng)急兩條途徑均被阻斷不能合成DNA,加A后主要（正常）途徑被阻斷，可走應(yīng)急途徑合成DNA，但該細(xì)胞在一般培養(yǎng)條件下不能較長時(shí)間存活，只有同瘤細(xì)胞融合后才獲取無限增殖能力,,故只有雜交細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)基上增殖,（骨髓瘤細(xì)胞從免疫脾細(xì)胞獲取HGPRT+和TK+，脾細(xì)胞則從骨髓瘤細(xì)胞獲取無限增殖能力）,免疫脾細(xì)胞,,,,,,（三）植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合,總過程包括：原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體的融合雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的分化,1原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義1）融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種2）分離或引入各種細(xì)胞器3）導(dǎo)入外源基因4）誘發(fā)突變體5）研究細(xì)胞信息傳遞、能量代謝、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?）研究細(xì)胞壁的合成機(jī)理7）研究膜的功能和細(xì)胞膜的相互作用8）研究核質(zhì)關(guān)系9）研究疾病與抗性生理,2原生質(zhì)體的制備3原生質(zhì)體的培養(yǎng)1）培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法,4原生質(zhì)體的融合,植物細(xì)胞雜交是指將兩個(gè)原生質(zhì)體融合成一個(gè)細(xì)胞的過程，又稱體細(xì)胞雜交。,,,,Cocking（1971）建議程序的代表圖示,,起源細(xì)胞（降解細(xì)胞壁）↓親本原生質(zhì)體（誘導(dǎo)融合）↓集聚粘連↓胞質(zhì)融合（異核體培養(yǎng)）↓核融合、壁再生（雜種細(xì)胞選擇）↓細(xì)胞分裂（雜種愈傷組織)↓誘導(dǎo)分化（器官、胚狀體形成）↓雜種植株,5再生植株的種類由于核融合的情況不同，形成不同的雜種植株。1）親和的細(xì)胞雜種具有雙親全套染色體，異源雙二倍體。2）部分親和的細(xì)胞雜種一個(gè)親本的染色體有少量重建或重組于另一親本的染色體組中。3）胞質(zhì)雜種一親本的染色體被全部排斥，但胞質(zhì)是雙親的4）異核質(zhì)雜種具有一個(gè)親本細(xì)胞核和另一個(gè)親本細(xì)胞質(zhì)的類型。,4）利用生長特性選擇,6融合細(xì)胞和雜種篩選,1)利用遺傳互補(bǔ)選擇,a葉綠體缺失互補(bǔ)選擇,,b營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇,c抗性互補(bǔ)選擇,2)敏感差異選擇,3)利用物理特性選擇,1978年，西德科學(xué)家獲得蕃茄—馬鈴薯的雜種植株；1982年，美國培育出“土豆西紅柿”；1986年，日本培育出稻（C3）和稗（C4）之間的新品種，同時(shí)“生物白藍(lán)”（38）[白菜（20）+甘藍(lán)（18）]成功；1988年，聯(lián)邦德國培育出地下結(jié)馬鈴薯，地上結(jié)西紅柿的“馬鈴柿”。近20幾年來，利用細(xì)胞雜交技術(shù)培育出眾多的雜種植株。☆動(dòng)、植物細(xì)胞雜種—“牛肉蕃茄”,7雜種細(xì)胞的再鑒定,1）雜種植株和親本植株的形態(tài)學(xué)特征比較,2）雜種和親本的核型分析,3）雜種和親本的同工酶譜分析,4）分子生物學(xué)方法,★已得到的細(xì)胞雜種,8細(xì)胞雜交的幾個(gè)重要進(jìn)展,八、細(xì)胞融合技術(shù)的進(jìn)展與展望1不對(duì)稱融合——將親本之一遺傳物質(zhì)部分破壞后再同另一完整原生質(zhì)體融合的方式。結(jié)果形成各種非整倍體。2胞質(zhì)雜種——是一親本去核后的胞質(zhì)體與另一親本完整細(xì)胞的融合。,復(fù)習(xí)思考題1什么是細(xì)胞融合？誘導(dǎo)細(xì)胞融合有幾種方法？2試述細(xì)胞融合的基本原理。3細(xì)胞融合技術(shù)有哪些應(yīng)用？,