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2、styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,?#?,Slide Title,Body Text,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,Click to edit Master title style,,,?#?,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,,
3、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,個體化分子診斷的檢測技術(shù),個體化診斷的內(nèi)容,,個體化診斷的技術(shù)簡介,,技術(shù)原理,提綱,,年齡,老年人,兒童,新生兒,,性別,身高,/,體重,,并發(fā)癥,病程,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
4、,,,,,,,,,,,,,,,,,,什么是個體化分子診斷,臟器功能,肝,,,腎,,,心,,環(huán)境因素,飲食,,/,吸煙,/,合并用藥,藥物反應(yīng)個體差異,基因,個體化基因檢測方向,突變,（,mutation,）,表達(dá)水平,（,level of expression),甲基化修飾,（,methylation),基因突變檢測技術(shù),測序；,,探針；,質(zhì)譜；,基因突變檢測技術(shù),,測序,探針,質(zhì)譜,原始信號,光,光,光,一級信息,,探針結(jié)合,分子量,二級信息,,序列是否改變,分子大小是否改變,……,,推論,推論,最終信息,,堿基序列是否改變,,,,PPi,ATP,,Light,,,light,time,Si
5、gnal,Pyrosequencing - Chemistry,,Reagent cartridge,(Ink jet delivery),CCD camera detection,X-Y drive positioning,24,well plate,mix & thermostat,Lens array,Q,24,Instrument Design,焦磷酸測序的原理,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A G G A T C T,?,?,?,?,?,?,?,?,?,C,T,T,C,C,A,G,A,,,,,,,,,,,,,,
6、,T,,準(zhǔn)確度決定臨床判斷的價值,,,,,,,,,,,,,,,,,,,45%,,,E,E,,S,S,,G,G,,T,T,,C,C,,T,T,,G,G,5,,T,T,,C,C,,G,G,,T,T,,A,A,10,,G,G,,T,T,,C,C,,G,G,,C,C,15,,T,T,,G,G,,A,A,,T,T,,C,C,20,,G,G,,T,T,,A,A,,G,G,,T,T,25,,C,C,,G,G,,A,A,,,0,,200,,400,600,,800,,1000,,1200,,1400,Sequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGAT,,Dispensati
7、on,Order:,,,,48%,,,,47%,,,,45%,,,,45%,,探針技術(shù)的常見應(yīng)用,,ARMs,液相芯片,基因芯片,熒光,PCR,引物數(shù)量,2,2,2,2,探針,SybGreen,引物,固定于磁珠的探針,固定于玻片探針,熒光探針,信號捕捉,CCD,CCD,掃描儀或肉眼,CCD,判讀,光信號的有無,,,,探針技術(shù),——Taqman,野生型的序列為,TTGTGGTAGTTGGAGCTGG,12ASP,突變型（,ARMS,）引物,P1 TTGTGGTAGTTGGAGCTG,A,12ASP,突變型（,ARMS,）引物,P2 TTGTGGTAGTTGGAGCT,CA,12ASP,突
8、變型（,ARMS,）引物,P3,,TTGTGGTAGTTGGAGC,A,G,A,,探針法的案例,——ARMS,圖,1 3,條,ARMS,引物的擴(kuò)增曲線,（模板為,3*10,8,copies/ul,野生型質(zhì)粒）,圖,2 3,條,ARMS,引物的擴(kuò)增曲線,（模板為,3*10,8,copies/ul,突變型,質(zhì)粒）,基因突變檢測技術(shù)對比,性能,測序技術(shù),探針,,,,DHPLC,,,熒光,PCR,基因芯片,,懸液芯片,ARMS,,檢測通量,高,低,高,高,低,高,靈敏、準(zhǔn)確度,高,高,一般,高,一般,高,重復(fù)性,好,好,一般,好,好,好,可否定量,是,否,是,是,否,否,技術(shù)可靠性,金標(biāo)準(zhǔn),/,
9、/,/,/,/,,基因突變檢測技術(shù)對比,金標(biāo)準(zhǔn),（,Golden standard,）,在檢測中的作用：,,現(xiàn)有技術(shù)所能達(dá)到的最先進(jìn)水平，最接近客觀事實(shí)，或者反映的就是客觀事實(shí)本身；,如同病理診斷；,,為什么測序是金標(biāo)準(zhǔn)？,人類基因組計(jì)劃,（,human genome project,?HGP,,）,；,1990,年正式啟動人類基因組測序計(jì)劃,, 2003,年完成。,,識別人類基因組的所有大約,3,萬個,DNA,測定組成人類基因組,DNA,的約,30,億對核苷酸的序列,,基因測序技術(shù)的進(jìn)展,Sanger,法,,第一代測序,1977,年,,簡單、快捷,,現(xiàn)代測序法,,第二代測序,,,,,實(shí)時檢測
10、,,費(fèi)用更低,,通量更高,,速度更快,第二代測序技術(shù),第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定,DNA,的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺,:,,第二代測序技術(shù),,,,,,Roche/454 FLX,,Illumina,,AB SOLID system,測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長能達(dá)到,400bp,測序性價比最高，不僅機(jī)器的售價比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低,測序的準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于,99.94%,,,,測序應(yīng)用的新高度,對定性檢測,（,Qualitative?test,）,進(jìn)行定量分析,（,Quantitative Test,）,；,突變定量檢測的必要
11、性,突變負(fù)荷,（,mutational load,）；,疾病不同階段,（,stage of disease,）；,對應(yīng)的策略不同；,準(zhǔn)確度高,靈敏度高,相對定量判讀,,焦磷酸測序的優(yōu)點(diǎn),檢測下限影響臨床判斷,,,可檢測3%的突變,,,,,,野生型,,突變型,,,,,,,,,,,,30,20,60,50,10,100,40,90,80,70,基因所占比例,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,靈敏度：,3%,,,靈敏度：,30%,檢測方法敏感度影響臨床判斷,PCR,擴(kuò)增,PCR amplification,,～,2h,,基因,突變,檢測流程,Pyrosequenc
12、ing,,測序樣本準(zhǔn)備,Sample preparation,,～,15min,,DNA,提取,DNA purification,,～,2h,,Pyro,測序,Pyrosequencing,,～,10-100min,,結(jié)果分析,Genotyping and identification,,收取樣本：血樣或組織,基因表達(dá)水平的檢測,檢測,mRNA,的水平；,基因表達(dá)水平的檢測技術(shù),mRNA,的降解；,20℃,時，（,R=-0.981,，,P<0.001,）；,15℃,時，（,R=-0.709,，,P<0.001,）；,,Y,：,18sRNA,含量,X,：離體時間,,對標(biāo)本位置的要求；,,mRNA,表達(dá)水平是相對定量,mRNA,差異表達(dá)的相對定量分析,兩種相對定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和,Delta-delta Ct,法,。,基因修飾的檢測,DNA,甲基化修飾：,,,基因甲基化的檢測意義,基因甲基化檢測的意義,,目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與抑癌基因啟動子區(qū)的,CpG,島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉非?？赡苡嘘P(guān)。,甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測,,腫瘤的分級,,甚至可以作為患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、臨床病程監(jiān)控和療效評估的指標(biāo)。,焦磷酸檢測基因甲基化,,甲基化程度的量化,無法定量的甲基化檢測,
基因分型技術(shù)
