干細胞內毒素檢測標準操作規(guī)程SOP-ZK-003.doc

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1、GMP質量管理 文件編號：SOP/ZK/003 干細胞內毒素檢測標準操作規(guī)程（SOP）北京賽托森生物科技發(fā)展有限公司質量管理干細胞內毒素檢測標準操作規(guī)程文件名：干細胞內毒素檢測標準操作規(guī)程文件編號：制定人：日期： 年 月 日文件類型：工作標準審核人：日期： 年 月 日版 次：第一版批準人：日期： 年 月 日印 數(shù)：共5份生效日期： 年 月 日頒發(fā)部門：質量管理分發(fā)至： 質量副總經理、質量管理部、QC檢驗室、綜合辦公室變更記載修訂號修訂人批準日期生效日期原 因 及 目 的1.簡述本操作程序主要參照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotox

2、ins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及中國藥典2010版附錄E細菌內毒素檢查法中凝膠法，結合實驗室自身條件編寫而成。2.安全注意事項 由于細菌內毒素對人體有毒害作用，且鱟試劑對人的危害作用尚不明確。因此實驗過程中一定要做好防護措施。3.檢驗目的檢驗供試品中的的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定。4.檢驗原理本操作程序通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量檢測內毒素。5.供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶、稀釋或在水

3、性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH 值在6.08.0的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH 值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調節(jié)pH 值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去除內毒素的容器中配制。緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。6.供試品細菌內毒素的限值(L)藥典有明確規(guī)定的按照藥典規(guī)定值，如無規(guī)定需經計算得出，具體計算方法見各藥典。7.供試品最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)和最小有效稀釋濃度的確定(MVC)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)( 1MVD )，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內毒素限

4、值的檢測。用以下公式來確定MVD，MVD=cL /。式中L 為供試品的細菌內毒素限值；c 為供試品溶液的濃度，當L 以EU / ml 表示時，則c為1ml / ml ，當L 以EU / mg 或EU / U 表示時，c的單位需為mg / ml 或U / ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1 ，可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L ；為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度EU / ml （商品包裝上有標示）。舉例：設設鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml，英國藥典規(guī)定檸檬酸的限值L為0.5 IU/mg(IU與EU等同)，由于檸檬酸為固體，則可以通過c=/L，

5、確定最小有效稀釋濃度，即MVC=0.25/0.5=0.5 mg/ml。8.設備和試劑8.1電子天平8.2電熱滅菌干燥箱，溫度能達到250攝氏度8.3恒溫水浴或恒溫培養(yǎng)箱，能滿足恒溫在3718.4渦旋混合器8.5 無菌工作臺8.6微量加樣器，200 ul8.7去熱源一次性吸頭8.8凝集管(10mm75mm)8.9管架8.10錫紙8.11鱟試劑，應具有國家主管部門的批準文號。7.12細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品，除另有規(guī)定外，應使用由中國藥典生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標準品7.13細菌內毒素檢查用水，內毒素含量應小于0.015 EU/ml7.13細菌內毒素檢查用pH緩沖溶液注：以上試劑

6、推薦使用廈門鱟試劑實驗廠有限公司,湛江安度斯生物有限公司及湛江博康海洋生物公司9.實驗器皿去熱源實驗所用的器皿需經處理，取出可能存在的外源性內毒素。通常玻璃器皿首先細菌，再用錫紙包裹放入250干燥箱中進行干熱滅菌。而使用不耐熱的塑料器皿，應選用表面無內毒素并且對實驗無干擾的器械。10.鱟試劑的靈敏度符合實驗在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。10.1細菌內毒素標準溶液的制備取細菌內毒素國家標準品或工作標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，

7、然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，開啟過程中應防止玻璃屑落入瓶內。按照標準品說明書，加入規(guī)定量的細菌內毒素檢查用水溶解其內容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內毒素標準溶液，即2.0、0.5、0.25（為所復核的鱟試劑的標示靈敏度），每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘（詳細過程參見標準品使用說明書）。10.2待復核鱟試劑的準備取0.1ml/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解

8、，避免產生氣泡。若待復核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支按其標示量加入檢查用水復溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混合在一起，然后每0.1 ml分裝到10mm75mm凝集管中，要求至少分裝18管備用。10.3凝膠反應將已充分溶解的待復核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2、0.5和0.25的內毒素標準溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水（如圖1）。加樣結束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產生氣泡，連同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫602分鐘。圖110.4判定和計

9、算鱟試劑靈敏度的測定值(c) 觀察并記錄結果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉180觀察，管內形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。當最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。cantilg（X / 4 )，式中X為反應終點濃度的對數(shù)值（lg ）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。當c在0.52(包括0.52)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該

10、批鱟試劑的靈敏度。10.5舉例設待復核鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml。實驗結果如下：內毒素濃度 （EU/ml） 0.50 0.25 0.125 0.062 Nc 反應終點濃度X 1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125則：c =antilg(X/4)=antilg（lg0.25lg0.50lg0.125lg0.125）/4= antilg(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4= antilg(-0.508)=0.310（EU/ml）c在0.5-2范圍內，符

11、合規(guī)定。11.干擾實驗干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內毒素檢查法提供依據。11.1制備內毒素標準對照溶液取1支細菌內毒素標準品，用細菌內毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即2.0、0.5、0.25。11.2制備含內毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將11.1中的同支細菌內毒素標準品稀釋成4個濃度即2.0、1.0、0.5、0.25的含內毒素的供試品溶液。11.3鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，

12、防止玻璃屑落入瓶內。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，避免產生氣泡。若待復核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按其標示量加入檢查用水復溶，將復溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至少分裝36管備用。11.4凝膠反應將準備好的鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內毒素標準對照液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的

13、4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照，如表1所示。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產生氣泡，兩同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結果。表l 凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度/被加入內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標示靈敏度

14、的對照系列；D為陰性對照。11.5判定并計算C和B的反應終點濃度的集合平均值(Es和Et) 只有當溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C 和B 的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et ) :Es= antilg （Xs / 4 )Et=antilg （Xt / 4 )式中Xs、Xt分別為系列溶液C 和溶液B 的反應終點濃度的對數(shù)值（lg）。當Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD 的稀釋倍

15、數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD 的進一步稀釋，再重復干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。12.凝膠限度試驗12.1供試品溶液的制備將供試品進行稀釋，其稀釋倍數(shù)為MVD并且已經排除干擾。12.2陽

16、性對照溶液的制備用檢查用水將內毒素標準品稀釋制成2濃度的內毒素標準液。12.3供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內毒素標準品制成2濃度的內毒素溶液。12.4陰性對照液即細菌內毒素檢查用水。12.5鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內。每支加入0.1ml檢查用水溶解、輕輕轉動瓶壁，使內溶物充分溶解，避免產生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支，按其標示量加入檢查用水復溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至

17、少分裝8管備用。12.6凝膠反應取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品稀釋液作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管，2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管， 2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管，見表2。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。保溫和取放試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。表2 凝膠限度試驗溶液的制備編號內毒素濃度被加入內毒家的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液2B2供試品溶液2C2檢查用水2D無檢查用水2注：A 為供試品溶液；B 為供試品陽性對照；C 為陽性對照；D 為陰

18、性對照。12.7判定若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，陽性對照溶液C 的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A 的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；若溶液A 的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A 的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；否則判定供試品不符合規(guī)定。13. 凝膠半定量試驗半定量實驗是使用凝膠法估測供試品中內毒素含量的方法。系利用供試品系列與鱟試劑反應的終點濃度計算出供試品中內毒素的含量。13.1供試品系列的制備用檢查用水將供試品溶液從

19、已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成1、2、4、8等濃度，但最大稀釋倍數(shù)不得超過MVD。13.2內毒素標準系列的制備用檢查用水將內毒素標準品稀釋成4個濃度的標準溶液即2.0、1、0.5、0.25。13.3供試品陽性對照溶液的制備用已確定不干擾濃度或稀釋倍數(shù)的供試品溶液將內毒素標準品制成2濃度的內毒素溶液。13.4陰性對照液即細菌內毒素檢查用水。13.5鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支或分裝好的鱟試劑至少20支，其他操作按前文所述。13.6凝膠反應將準備好的鱟試劑取其中10支（管）放在試管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、0.5、0.25的

20、內毒素標準溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。另外8支（管）鱟試劑放在試管架上，排成4列，每列2支（管）。每列每支分別加入0.1ml一個濃度的供試品溶液。另2支（管）加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品的陽性對照，如表3。表3 凝膠半定量試驗溶液的制備編號內毒素濃度/被加入內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12224282B2/供試品溶液122C2/檢查用水檢查用水12221240.5280.252D無/檢查用水2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和

21、8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。B為2濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）。C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。D為陰性對照。13.7判定與供試品濃度CE的計算若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，系列溶液C 的反應終點濃度的幾何平均值在0.52之間，試驗有效。系列溶液A 中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度按公式CE=antilg（X / 2 ），在某稀釋倍數(shù)下，供試品溶液的反應終點濃度的對數(shù)值 。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果

22、乘以稀釋倍數(shù)。如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。若內毒素濃度小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。若內毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判定供試品不符合規(guī)定。13.8舉例供試品濃度計算的舉例：設供試品為某注射液，干擾實驗已確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，其內毒素限值為10EU/ml，現(xiàn)使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑檢測供試品中的內毒素含量。MVD=CL/=10/0.03320倍，將供試品溶液先稀釋至20倍后，再進行對倍稀釋。將20倍稀釋液稀釋2、4、8、16倍，同時制備內毒素標準系列。 則有：供試品稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 16 PPC 反應終點稀釋倍數(shù) 1 8 2 4CE=antilg(X/2)=antilglg（80.03）lg（40.03）/2=0.170 EU/ml供試品20倍稀釋液的內毒素含量=0.170EU/ml由于供試品先被稀釋了20倍，因此供試品的內毒素含量為：0.17020=3.40EU/ml低于規(guī)定的內毒素限值，此批注射液內毒素檢查項符合規(guī)定。第 8 頁 共 9 頁